CN115305267A - 生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物转化合成β‑烟酰胺单核苷酸的方法，属于生物化学技术领域。以烟酰胺核苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，加入催化量ATP钠盐启动反应，采用烟酰胺核苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化后，离子交换树脂交换得到β‑烟酰胺单核苷酸。与其他工艺相比，本发明反应体系以纯化水作为反应体系直接进行生物转化反应，生产目标产物浓度达到78.3g/L以上，且产物易提取，操作简单，易产业化。

Description

生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法

技术领域

本发明属于医药合成中生物发酵技术领域，涉及β-烟酰胺单核苷酸的生物合成，具体涉及利用生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)，外文名Nicotinamide mononucleotide，化学式C₁₁H₁₅N₂O₈P，分子量334.219，CAS登录号1094-61-7，外观白色结晶粉末。其为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称：辅酶A或NADH)重要中间体代谢物，是NAD⁺关键前体。NMN在心脏和脑缺血、阿尔兹海默症等方面具有重要生理活性，作为NAD+的前体药物，主要是用于合成NAD⁺。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)是一种存在于所有活细胞巾的辅酶。伴随着研究的深入，人们发现其在生物衰老方面的起着至关重要的调节作用，而他的前体烟酰胺单核苷酸(β-NMN)作为补救合成途径中主要原料，引起了社会各界的广泛关注。随着对NMN的研究逐渐深入，发现其具备多种生物功能，对心脑疾病、老年退行疾病、神经退行疾病、延缓衰老等有治疗作用。目前，中国营养健康产业规模已经超过7000亿元，成为仅次于美国的第二大市场。

目前，文献报道合成NMN的方法主要有化学合成法和酶促反应两类，具体如下：

1981年，Mikhailopulo等以三苯甲酰基-β-D-核糖为起始原料，经氢溴酸溴代，再与烟酰胺取代，最后与三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化制得β-NMN，对环境不友好且原料不易得。2002年，王波等以烟酰胺与四乙酰核糖为起始原料，经三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)缩合、脱乙酰基经活性炭色谱分离并重结晶得缩合物，再经三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化制得β-NMN，该方法产物产生消旋，且两种异构体分离困难，为工业化生产带来困难。2018年，索韦等将缩酮化保护的烟酰胺核糖磷酸化、脱保护制备β-NMN，该方法步骤简短，各步收率较高，缺点是原料价格昂贵，分离成本高。

1957年，Jack等从人红细胞提取物中合成了磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，并以PRPP和烟酰胺为底物在红细胞提取物中的酶催化下生成β-NMN，同时说明了β-NMN生成路径。生成路径为，1分子烟酰胺和1分子PRPP在烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT或NAMPRT)催化作用下生成1分子β-NMN和1分子焦磷酸(PPi)。除了烟酰胺可生成β-NMN，1分子烟酰胺核苷(NR)在烟酰胺核苷激酶(NRK)催化下磷酸化生成1分子β-NMN。此方法为后续酶促法合成β-NMN提供了参考。2018年，竺伟等以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料，在ATP存在下，用固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPPs)和NAMPT的基因工程菌全细胞催化，一步实现高效生物合成β-NMN，浓度最高达13.3g·L^-1，转化率为99.5％。此方法具有生产工艺相对简单，细胞可以循环利用等优点，然而D-5-磷酸核糖价格较为昂贵不适合进行工业化生产。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明工艺以烟酰胺核苷和为乙酰磷酸二钾盐原料，采用烟酰胺核苷激酶和多聚磷酸盐激酶进行生物转化，得到β-烟酰胺单核苷酸。整个过程相当于乙酰磷酸二钾盐上的磷酸直接转到烟酰胺核苷生成β-烟酰胺单核苷酸。该工艺方法原料来源方便，成本相对低廉，具备极强市场竞争力。

本发明所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：以烟酰胺核苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，采用烟酰胺核苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化，得到β-烟酰胺单核苷酸。采用反应方程式表示为：

进一步地，在上述技术方案中，反应体系中加入ATP钠盐启动反应。

进一步地，在上述技术方案中，生化转化后，加入阳离子交换树脂进行交换。

进一步地，在上述技术方案中，整个合成过程具体包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程，具体工艺流程见附图1。

1.1菌体活化

菌种：大肠杆菌

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0

培养条件：37℃，200rpm，12h

1.2酶的制备

发酵培养基配方：酵母膏10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，七水硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸锰0.1g/L。

配制好培养基后，加入发酵罐，进行补料分批高密度发酵培养，加入IPTG诱导培养；利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。

1.3转化反应

反应体系为：在乙酰磷酸二钾盐、烟酰胺核苷、六水氯化镁、ATP钠盐、烟酰胺核苷激酶、多聚磷酸盐激酶和pH＝7.0条件下反应，得到合成液。

1.4产物提取

1.4.1合成液预处理

合成液采用超滤膜除去细胞碎片、可溶性蛋白等机械杂质，透过液纳滤膜纳滤，除去反应液中的烟酰胺等盐分，得到清液。

1.4.2浓缩

纳滤后NMN溶液上样，阳离子交换树脂为001×7；上样结束水洗柱，洗掉没有挂柱ADP、磷酸等杂质；氯化钠溶液洗脱产品NMN。洗脱后NMN溶液纳滤浓缩，浓缩液中产品浓度达到20％以上。

1.4.3精制

浓缩液中加入乙醇，降温至0-5℃析出，抽滤后干燥烘干，精制后产品经检测产品合格，含量≥99.9％。

进一步地，在上述技术方案中，所述酶液-20℃冷冻保存。

进一步地，在上述技术方案中，菌悬液配方：Tris-Hcl 50mN、EDTA5mN、pH＝8.0、菌体浓度60％；破碎条件：1600W、35℃、30min；离心条件：7000rpm、30min。

进一步地，在上述技术方案中，转化反应温度为15-35℃；优选反应温度为25℃。

进一步地，在上述技术方案中，转化反应时间不低于20小时。

发明有益效果

1、生物转化反应底物

该生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的底物为烟酰胺核苷，磷酸供体底物原料是以乙酰磷酸二钾盐为原料提供磷酸来源。

2、转化反应体系

该工艺合成目标产物β-烟酰胺单核苷酸所用反应体系是以纯化水作为反应体系直接进行生物转化反应，成本低廉、环保、易操作、易产业化。

3、转化合成路线

该合成β-烟酰胺单核苷酸工艺中的转化反应是以多聚磷酸盐激酶与烟酰胺核苷激酶偶联转化合成产物β-烟酰胺单核苷酸。

4、生产效率高

该合成技术以纯化水为溶剂，不需要缓冲体系直接进行生物转化反应合成产物烟酰胺核苷酸钾盐，阳离子交换后得到β-烟酰胺单核苷酸，与文献报道相比该工艺目的产物积累浓度高，合成液中NMN达到78.3g/L以上，产物易提取、环保、易操作、成本低、易于产业化。

说明书附图

图1为生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸具体工艺流程图；

图2为实施例1中条件优化实验中温度对转化反应影响图；

图3为实施例1中条件优化实验中pH值对转化反应影响图；

图4为实施例1中条件优化实验中底物浓度对转化反应影响图；

图5为实施例1中条件优化实验中反应时间对转化反应影响图；

图6为实施例1中条件优化实验中酶量对转化反应的影响图。

具体实施例

实施例1

1转化反应条件优化

在初始反应体系基础上进行合成β-烟酰胺单核苷酸反应条件优化试验，包括对酶量、底物浓度、pH值、温度及反应时间等条件的优化，以期达到提高底物转化率和降低成本的目的。

1.1温度对转化反应的影响

利用初始反应体系，在不同温度条件下进行转化合成反应16h，测定产物含量，计算转化率。图2结果显示在较宽温度范围内，上述反应体系都可以将底物转化为目的产物，在15-35℃温度范围内，随温度升高转化效率不断提高，在25℃时达到最大值；进一步升高温度，转化率开始下降，高于30℃后转化率迅速下降，说明过高温度导致酶活失活严重，不利于转化反应。因而选择转化温度为25℃左右。

1.2pH值对转化反应的影响

利用上述反应体系，调整合成液pH值，进行转化反应16h，测定产物含量，计算不同pH条件下底物转化。图3结果显示，底物转化率在pH值6.5-7.5范围内达到最大值，pH值过高或过低转化率都迅速降低。因而选择最适pH值＝7左右。

1.3最适底物浓度的确定

在上述反应体系中，考察不同底物浓度下转化反应16h，测定产物含量，计算转化率。图4结果显示，底物浓度在60g/L到100g/L范围内，转化率趋于稳定，底物浓度大于100g/L之后，转化率开始明显下降。因而选择较适底物浓度范围为60-100g/L。

1.4最适反应时间的确定

在上述优化的反应条件下，测定不同转化时间的产物浓度，计算转化率。图5结果显示，随时间延长，产物不断积累，底物转化率随反应时间延长快速增加，反应时间达到20小时之后产物浓度变化不明显。因而获得产物的适宜时间可选择为20小时以后。

1.5最适酶量的确定

在上述最适反应条件下，在10-50g/L固定化酶量范围内考察酶量对转化率的影响。图6结果显示，在10-40g/L范围内，转化率随酶量的增加而快速增加，大于40g/L以后，转化率下降。由于固定化酶可以重复利用，为提高生产效率，因而选择大于40g/L为较适用酶量。

实施例2

生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸工艺放大(100L)

2.1菌体活化

菌种：大肠杆菌

保藏编号：NRKPK-001

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0。

培养条件：37℃，200rpm，12h

2.2酶的制备

发酵培养基配方：酵母膏10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，七水硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.8g/L，硫酸锰0.1g/L。

配制好培养基后，加入发酵罐，进行补料分批高密度发酵培养，待菌体OD₆₀₀达到200后，加入0.5-1mM IPTG诱导培养14-16h。利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。酶液-20℃冷冻保存。

菌悬液配方：Tris-Hcl 50mN、EDTA5mN、pH8.0、菌体浓度60％；

破碎条件：1600W 35℃30min

离心条件：7000rpm 30min

2.3转化反应

反应体系为：乙酰磷酸二钾盐12Kg，烟酰胺核苷8Kg，六水氯化镁500g，ATP钠盐500g，烟酰胺核苷激酶2.5Kg，多聚磷酸盐激酶1.5Kg，pH＝7.0；在25℃条件下反应20h，通过高效液相色谱检测合成液中目的产物NMN含量，待NMN含量不再增加时结束反应得合成液，然后进行下一步产物提取。

2.4产物提取

2.4.1合成液预处理

合成液用20000分子量超滤膜除去细胞碎片、可溶性蛋白等机械杂质。透过液用分子量200纳滤膜纳滤，除去反应液中的烟酰胺等盐分，得到清液。

2.4.2浓缩

纳滤后NMN溶液以1倍柱体积/小时速度进行上样，所用阳离子交换树脂为001×7；上样结束后用2倍柱体积水洗柱，洗掉没有挂柱ADP、磷酸等杂质；用2倍柱体积2％氯化钠溶液洗脱产品NMN。洗脱后NMN溶液纳滤浓缩，浓缩液中的产品浓度达到20％以上即可。

2.4.3精制

浓缩液中加入2倍无水乙醇，加入乙醇过程中NMN开始少量析出，降温至0-5℃使NMN继续析出，析出NMN抽滤后鼓风干燥烘干，得到成品5.1Kg。

2.4.4质检

精制后产品经检测产品合格，含量≥99.9％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以烟酰胺核苷和乙酰磷酸二钾盐为原料，采用烟酰胺核苷激酶和多聚磷酸盐激酶共同作用下进行生物转化，得到β-烟酰胺单核苷酸。

2.根据权利要求1所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：反应体系中加入ATP钠盐启动反应。

3.根据权利要求1所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：生化转化后，加入阳离子交换树脂进行交换。

4.根据权利要求1所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：整个合成过程具体包括，菌体活化、酶的制备、转化反应和产物提取。

5.根据权利要求4所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：酶的制备为，配制好培养基后，加入发酵罐，进行补料分批高密度发酵培养，加入IPTG诱导培养；利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。

6.根据权利要求4所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：转化反应为，在乙酰磷酸二钾盐、烟酰胺核苷、六水氯化镁、ATP钠盐、烟酰胺核苷激酶、多聚磷酸盐激酶和pH＝7.0体系下反应，得到合成液。

7.根据权利要求6所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：反应温度为20-30℃，反应时间不低于20小时。

8.根据权利要求4所述生物转化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：产物提取包括合成液预处理、浓缩和精制。

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