CN115505614A - 一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括10‑20g商品DNA、10‑40gDNMP酶、3‑10g酵母提取物、1‑2g蛋白胨、2‑4gMKP、2‑5g磷酸二钾、10‑20g玉米葡糖、1‑4g碳酰胺、0.1‑1g氯化钙、0.1‑1g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、10‑100g含磷物、10‑100g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。通过采用天然DNA经溶液态脱氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP，DNMP的收率提升，DNMP在经DNMP酶反应一步后结合化学反应，可分别转化为相应的DNTP，DNTP经层析法纯化，以钠盐或钡盐的形式沉淀分离。利用该方法得到的DNTP纯度较高本发明不仅使DNTP的生产工艺变的简单，而且使生产量达到了摩尔级，适用于工业大量生产，并且污染性极小。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法。
背景技术
DNA结构以脱氧核糖核苷酸为单位组成的两条长链，这4种脱氧核苷酸分别含有A、T、C、G四种碱基。DNA是一种双螺旋结构的生物大分子，其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，是由4种脱氧核苷酸组成的一种高分子化合物。脱氧核糖核苷三磷酸即DNTP，在DNA的应用中具有广泛的应用。
目前，申请号为CN202010287470.6公开了一种制备脱氧核糖核苷三磷酸生物合成新方法，其采用酶水解和酶催化全新工艺，选用鲐鱼精DNA为原料，用磷酸二酯酶将其水解生成DNMP混合物，经离子交换层析分离提纯后，用活性酵母全细胞催化合成DNTP混合物，然后用制备色谱分离纯制得四种高纯度的单体化合物，再复配成等摩尔的DNTP生化试剂，产品纯度达99.9％以上，但收率再难提高：
现有的高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法存在以下主要缺陷：(1)采用酶解方法，水解不充分、酶解率低；(2)产品收率和纯度不高等。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，解决了水解不充分和酶解率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：10-20g商品DNA、10-40gDNMP酶、3-10g酵母提取物、1-2g蛋白胨、2-4gMKP、2-5g磷酸二钾、10-20g玉米葡糖、1-4g碳酰胺、0.1-1g氯化钙、0.1-1g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、10-100g含磷物、10-100g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至6-8。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
优选的，所述S3步骤中酶解在40-50℃下进行，酶解时间为8-12小时。
优选的，所述S4步骤中反应温度为80-100℃下反应5-7小时。
优选的，所述S3步骤中酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃。
优选的，所述紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz。
优选的，所述DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
优选的，所述S4步骤中的所添加的含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过采用天然DNA经溶液态脱氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP，DNMP的收率提升，DNMP在经DNMP酶反应一步后结合化学反应，可分别转化为相应的DNTP，DNTP经层析法纯化，以钠盐或钡盐的形式沉淀分离。利用该方法得到的DNTP纯度较高本发明不仅使DNTP的生产工艺变的简单，而且使生产量达到了摩尔级，适用于工业大量生产，并且污染性极小。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方案，对本发明实施方案中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方案仅仅是本发明一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：10g商品DNA、20gDNMP酶、3g酵母提取物、1g蛋白胨、2gMKP、2g磷酸二钾、10g玉米葡糖、1g碳酰胺、0.1g氯化钙、0.1g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、10g含磷物、10g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至6，DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，酶解在40℃下进行，酶解时间为8小时，酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃，紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，反应温度为80℃下反应5小时，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例二
一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：20g商品DNA、40gDNMP酶、10g酵母提取物、2g蛋白胨、4gMKP、5g磷酸二钾、20g玉米葡糖、4g碳酰胺、1g氯化钙、1g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、100g含磷物、100g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至7，DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，酶解在50℃下进行，酶解时间为12小时，酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃，紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，反应温度为100℃下反应7小时，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例三
一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：10g商品DNA、30gDNMP酶、6g酵母提取物、1g蛋白胨、2gMKP、2g磷酸二钾、10g玉米葡糖、2g碳酰胺、0.5g氯化钙、0.5g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、30g含磷物、40g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至7，DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，酶解在50℃下进行，酶解时间为10小时，酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃，紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，反应温度为85℃下反应6小时，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例四
一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：15g商品DNA、30gDNMP酶、6g酵母提取物、1.5g蛋白胨、3gMKP、4g磷酸二钾、15g玉米葡糖、2g碳酰胺、0.6g氯化钙、0.6g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、40g含磷物、30g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至8，DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，酶解在45℃下进行，酶解时间为9小时，酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃，紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，反应温度为85℃下反应6小时，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例五
一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：原料选取：20g商品DNA、40gDNMP酶、8g酵母提取物、2g蛋白胨、3.5gMKP、4g磷酸二钾、15g玉米葡糖、2g碳酰胺、0.6g氯化钙、0.8g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、40g含磷物、60g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液。
S2：原料处理；
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基。
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子。
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至8，DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，酶解在45℃下进行，酶解时间为10小时，酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃，紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促。
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，反应温度为90℃下反应5小时，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
尽管已经示出和描述了本发明的实施方案，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施方案进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：原料选取：10-20g商品DNA、10-40gDNMP酶、3-10g酵母提取物、1-2g蛋白胨、2-4gMKP、2-5g磷酸二钾、10-20g玉米葡糖、1-4g碳酰胺、0.1-1g氯化钙、0.1-1g盐化锌、100g溶解水、100g醇类溶剂、10-100g含磷物、10-100g二环己基碳二亚胺和100g氢氧化钾溶液；
S2：原料处理：
A1：培养基制备：将部分溶解水倒入培养皿的内部，然后酵母提取物、蛋白胨、MKP、磷酸二钾、玉米葡糖、碳酰胺、氯化钙和盐化锌溶解到溶解水的内部得到培养基；
A2：商品DNA水解：将商品DNA分散在溶解水中制得DNA水溶液，并且在溶液中加入锌离子；
A3：DNMP酶水解：将DNMP酶分散在溶解水中制得DNMP酶水溶液，并且在溶液中加入氢氧化钾溶液调节PH至6-8；
S3：进行酶促酶解：将A1步骤中所制备的培养基经霉菌萃取后的萃取液添加至A2步骤的DNA水溶液中进行酶解，然后将A3步骤中所制备的DNMP酶水溶液导入酶解溶液中进行酶促；
S4：成品合成：酶促完成后，向溶液中加入等量的醇类溶剂、含磷物和二环己基碳二亚胺，在一定的温度下反应一段时间后得混合液，混合液经过层析分离可得到纯净的脱氧核糖核苷三磷酸。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述S3步骤中酶解在40-50℃下进行，酶解时间为8-12小时。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中反应温度为80-100℃下反应5-7小时。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述S3步骤中酶解包括紫外协同和超声处理，其中紫外协同时间为6小时，紫外协同温度为60℃；超声处理时间为1小时，超声处理温度28℃。
5.根据权利要求4所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述紫外协同中紫外线波长为254纳米，所述超声处理的超声功率为200W，并且频率为20kHz。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述预处理DNMP酶的加入量为DNA质量的2倍。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中的所添加的含磷物为磷酸或磷酸盐的一种或两种混合物。
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