JPH06319581A - 安定同位体標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
安定同位体標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法Info
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- JPH06319581A JPH06319581A JP6019669A JP1966994A JPH06319581A JP H06319581 A JPH06319581 A JP H06319581A JP 6019669 A JP6019669 A JP 6019669A JP 1966994 A JP1966994 A JP 1966994A JP H06319581 A JPH06319581 A JP H06319581A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 13Ｃと15Ｎのうち、一方または両方などの安
定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチ
ドを安価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を
目的としている。 【構成】 13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち一方
または両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培養酵
母菌体より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及び／
又は全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上
であるＲＮＡを抽出することを特徴としている。
定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチ
ドを安価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を
目的としている。 【構成】 13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち一方
または両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培養酵
母菌体より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及び／
又は全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上
であるＲＮＡを抽出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は13Ｃや15Ｎなどの安定同
位体で標識された安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボ
ヌクレオチドの製造方法であり、特に標識率の高い安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良
く製造する技術に関する。
位体で標識された安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボ
ヌクレオチドの製造方法であり、特に標識率の高い安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良
く製造する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌ
クレオチドなどの標識化合物は、最近目ざましい発展を
遂げているＲＮＡの多次元ＮＭＲによる構造解析に不可
欠なものである。すなわち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様
にスピン１／２の原子核を持つために、これらの安定同
位体を有する物質は高分解能ＮＭＲの測定が可能であ
る。これらの標識化合物では1Ｈの化学シフトに加えて
13Ｃと15Ｎの化学シフトが利用できるようになり、多次
元ＮＭＲによる原子のシグナルの帰属の決定が容易とな
る。従ってＲＮＡのような、わずか４種類の類似のヌク
レオチド（シチジル酸、アデニル酸、グアニル酸及びウ
リジル酸）からなり、ＮＭＲシグナルの化学シフトが極
めて狭い範囲に集中している物質の構造決定のために
は、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠な物質である。そし
て安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレ
オチドは、これらの測定に用いる任意の標識ＲＮＡを化
学合成または生物合成するための原料として極めて価値
ある物質である。
クレオチドなどの標識化合物は、最近目ざましい発展を
遂げているＲＮＡの多次元ＮＭＲによる構造解析に不可
欠なものである。すなわち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様
にスピン１／２の原子核を持つために、これらの安定同
位体を有する物質は高分解能ＮＭＲの測定が可能であ
る。これらの標識化合物では1Ｈの化学シフトに加えて
13Ｃと15Ｎの化学シフトが利用できるようになり、多次
元ＮＭＲによる原子のシグナルの帰属の決定が容易とな
る。従ってＲＮＡのような、わずか４種類の類似のヌク
レオチド（シチジル酸、アデニル酸、グアニル酸及びウ
リジル酸）からなり、ＮＭＲシグナルの化学シフトが極
めて狭い範囲に集中している物質の構造決定のために
は、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠な物質である。そし
て安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレ
オチドは、これらの測定に用いる任意の標識ＲＮＡを化
学合成または生物合成するための原料として極めて価値
ある物質である。
【０００３】従来、13Ｃと15Ｎの一方または両方などの
安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオ
チドの製造方法に関する報告は無かった。しかし近時、
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Resear
ch）２０巻１７号4507〜4513頁および同号4515〜4523頁
（1992年）に、安定同位体で標識された炭素源及び窒素
源を用いて生育させた細菌の菌体から標識されたＲＮＡ
および５′ヌクレオチドを製造する方法が発表されてい
る。これらの発表のうち前者は炭素源として、全ての炭
素原子が完全に標識されたグルコース（13Ｃ6Ｈ
12Ｏ6）、窒素源として標識された硫酸アンモニウムを
用いて大腸菌を培養する方法であり、後者は炭素源とし
て標識されたメタノールと、窒素源として標識された硫
酸アンモニウムを原料とし、メタノール資化性細菌を培
養する方法である。
安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオ
チドの製造方法に関する報告は無かった。しかし近時、
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Resear
ch）２０巻１７号4507〜4513頁および同号4515〜4523頁
（1992年）に、安定同位体で標識された炭素源及び窒素
源を用いて生育させた細菌の菌体から標識されたＲＮＡ
および５′ヌクレオチドを製造する方法が発表されてい
る。これらの発表のうち前者は炭素源として、全ての炭
素原子が完全に標識されたグルコース（13Ｃ6Ｈ
12Ｏ6）、窒素源として標識された硫酸アンモニウムを
用いて大腸菌を培養する方法であり、後者は炭素源とし
て標識されたメタノールと、窒素源として標識された硫
酸アンモニウムを原料とし、メタノール資化性細菌を培
養する方法である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前者の
方法は炭素源として用いる13Ｃ標識グルコース（13Ｃ6
Ｈ12Ｏ6）が極めて高価であり、必ずしも良い方法では
ない。一方、後者の方法は炭素源のラベル化メタノール
は安価であるが、揮発性が高いため通気培養が極めて困
難であり、また生育阻害性が強いため培地中のメタノー
ルの濃度を高めることができず生産性が悪い。さらにい
ずれの方法も、細菌を用いるため、抽出した核酸画分に
は、ＤＮＡが多量に含まれており、ＤＮＡを分離する工
程が必要である等問題点が多く、工業的方法としては困
難である。
方法は炭素源として用いる13Ｃ標識グルコース（13Ｃ6
Ｈ12Ｏ6）が極めて高価であり、必ずしも良い方法では
ない。一方、後者の方法は炭素源のラベル化メタノール
は安価であるが、揮発性が高いため通気培養が極めて困
難であり、また生育阻害性が強いため培地中のメタノー
ルの濃度を高めることができず生産性が悪い。さらにい
ずれの方法も、細菌を用いるため、抽出した核酸画分に
は、ＤＮＡが多量に含まれており、ＤＮＡを分離する工
程が必要である等問題点が多く、工業的方法としては困
難である。
【０００５】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、13Ｃと15Ｎのうち、一方または両方などの安定同位
体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを安
価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を目的と
している。
で、13Ｃと15Ｎのうち、一方または両方などの安定同位
体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを安
価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を目的と
している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは13Ｃで標識
された安価な炭素源と15Ｎで標識された窒素源の、一方
または両方を含有する培地で酵母を製造する方法、さら
にこのＲＮＡを分解、分離することにより対応する標識
５′リボヌクレオチドを安価にかつ工業的に容易に生産
する方法を発見し、それによって本発明を完成させた。
即ち、本発明に係る安定同位体標識ＲＮＡの製造方法
は、13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち一方または
両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培養酵母菌体
より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及び／又は全
窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上である
ＲＮＡを抽出することを特徴としている。
された安価な炭素源と15Ｎで標識された窒素源の、一方
または両方を含有する培地で酵母を製造する方法、さら
にこのＲＮＡを分解、分離することにより対応する標識
５′リボヌクレオチドを安価にかつ工業的に容易に生産
する方法を発見し、それによって本発明を完成させた。
即ち、本発明に係る安定同位体標識ＲＮＡの製造方法
は、13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち一方または
両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培養酵母菌体
より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及び／又は全
窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上である
ＲＮＡを抽出することを特徴としている。
【０００７】また、本発明に係る安定同位体標識リボヌ
クレオチドの製造方法は、13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化
合物のうち一方または両方を原料として酵母菌を培養
し、次いで培養酵母菌体よりＲＮＡを抽出し、さらに該
ＲＮＡを分解して全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比
及び／又は全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５
％以上である５′リボヌクレオチドを分離することを特
徴としている。
クレオチドの製造方法は、13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化
合物のうち一方または両方を原料として酵母菌を培養
し、次いで培養酵母菌体よりＲＮＡを抽出し、さらに該
ＲＮＡを分解して全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比
及び／又は全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５
％以上である５′リボヌクレオチドを分離することを特
徴としている。
【０００８】さらに、上記安定同位体標識ＲＮＡの製造
方法及び安定同位体標識リボヌクレオチドの製造方法に
おいては、13Ｃ標識化合物が13ＣＨ3ＯＨ、13ＣＨ3 13Ｃ
ＯＯＨ及びその塩類、13Ｃ6Ｈ12Ｏ6、13Ｃ2Ｈ5ＯＨのう
ちのいずれか一種を用いることが好ましい。またこれら
の製造方法においては、上記13Ｃ標識化合物を資化する
酵母菌として、キャンディダ属酵母を用いることが望ま
しい。
方法及び安定同位体標識リボヌクレオチドの製造方法に
おいては、13Ｃ標識化合物が13ＣＨ3ＯＨ、13ＣＨ3 13Ｃ
ＯＯＨ及びその塩類、13Ｃ6Ｈ12Ｏ6、13Ｃ2Ｈ5ＯＨのう
ちのいずれか一種を用いることが好ましい。またこれら
の製造方法においては、上記13Ｃ標識化合物を資化する
酵母菌として、キャンディダ属酵母を用いることが望ま
しい。
【０００９】
【作用】本発明の安定同位体標識ＲＮＡ及びリボヌクレ
オチドの製造方法では、炭素源及び／又は窒素源として
13Ｃと15Ｎの標識化合物を用いた培地で、核酸画分のＲ
ＮＡ含有率が細菌よりも高い酵母を培養し、培養した酵
母菌体から安定同位体標識ＲＮＡを抽出し、或いはその
ＲＮＡを分解、精製して安定同位体標識リボヌクレオチ
ドを生産することにより、従来の細菌を用いた安定同位
体標識ＲＮＡやリボヌクレオチドの製造方法に比べ生産
効率に優れている。また、培養菌体より抽出した核酸画
分中のＲＮＡ含量が高く、その核酸画分からＲＮＡを分
離精製する際に混在するＤＮＡの分離操作が容易とな
る。
オチドの製造方法では、炭素源及び／又は窒素源として
13Ｃと15Ｎの標識化合物を用いた培地で、核酸画分のＲ
ＮＡ含有率が細菌よりも高い酵母を培養し、培養した酵
母菌体から安定同位体標識ＲＮＡを抽出し、或いはその
ＲＮＡを分解、精製して安定同位体標識リボヌクレオチ
ドを生産することにより、従来の細菌を用いた安定同位
体標識ＲＮＡやリボヌクレオチドの製造方法に比べ生産
効率に優れている。また、培養菌体より抽出した核酸画
分中のＲＮＡ含量が高く、その核酸画分からＲＮＡを分
離精製する際に混在するＤＮＡの分離操作が容易とな
る。
【００１０】また本発明では13Ｃと15Ｎの標識化合物を
用いた培地で酵母を培養し、培養酵母菌体より安定同位
体標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを製造するので、標
識化合物、特に13Ｃ標識炭素源として安価なＣ１〜Ｃ２
化合物、例えば13ＣＨ3ＯＨと13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ及びそ
の塩類を用いて効率良く培養することができる。
用いた培地で酵母を培養し、培養酵母菌体より安定同位
体標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを製造するので、標
識化合物、特に13Ｃ標識炭素源として安価なＣ１〜Ｃ２
化合物、例えば13ＣＨ3ＯＨと13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ及びそ
の塩類を用いて効率良く培養することができる。
【００１１】以下、本発明の詳細について説明する。本
発明に係る標識ＲＮＡとは、13Ｃで標識された安定同位
体標識ＲＮＡ、15Ｎで標識された安定同位体ＲＮＡ、及
び13Ｃと15Ｎの両方で標識された安定同位体標識ＲＮＡ
であり、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比（以下13Ｃ標
識化率という）及び／または全窒素原子に占める15Ｎ原
子の存在比（以下15Ｎ標識化率という）が９５％以上で
あることを特徴としている。
発明に係る標識ＲＮＡとは、13Ｃで標識された安定同位
体標識ＲＮＡ、15Ｎで標識された安定同位体ＲＮＡ、及
び13Ｃと15Ｎの両方で標識された安定同位体標識ＲＮＡ
であり、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比（以下13Ｃ標
識化率という）及び／または全窒素原子に占める15Ｎ原
子の存在比（以下15Ｎ標識化率という）が９５％以上で
あることを特徴としている。
【００１２】この安定同位体標識ＲＮＡを得るには、13
Ｃ標識の場合は培養に用いる炭素源を全て13Ｃとし、15
Ｎ標識の場合は窒素源を15Ｎにして酵母を培養し、その
菌体からＲＮＡを抽出する。13Ｃ標識炭素源としては、
安価に入手でき、かつ酵母により容易に資化される13Ｃ
標識化合物が望ましい。具体的な炭素源としては、13Ｃ
6Ｈ12Ｏ6，13ＣＨ3ＯＨ，13Ｃ2Ｈ5ＯＨ，13ＣＨ3 13ＣＯ
ＯＨ等の化合物が考えられる。13ＣＨ3 13ＣＯＯＨの場
合には、そのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩（15Ｎ標識アンモニウムでも良い）などの塩の形でも
使用できる。これら13Ｃ標識標識化合物の中で価格、及
び酵母の資化性を考慮すれば、13ＣＨ3ＯＨ及び13ＣＨ3
13ＣＯＯＨとその塩類が特に好ましい炭素源である。
Ｃ標識の場合は培養に用いる炭素源を全て13Ｃとし、15
Ｎ標識の場合は窒素源を15Ｎにして酵母を培養し、その
菌体からＲＮＡを抽出する。13Ｃ標識炭素源としては、
安価に入手でき、かつ酵母により容易に資化される13Ｃ
標識化合物が望ましい。具体的な炭素源としては、13Ｃ
6Ｈ12Ｏ6，13ＣＨ3ＯＨ，13Ｃ2Ｈ5ＯＨ，13ＣＨ3 13ＣＯ
ＯＨ等の化合物が考えられる。13ＣＨ3 13ＣＯＯＨの場
合には、そのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩（15Ｎ標識アンモニウムでも良い）などの塩の形でも
使用できる。これら13Ｃ標識標識化合物の中で価格、及
び酵母の資化性を考慮すれば、13ＣＨ3ＯＨ及び13ＣＨ3
13ＣＯＯＨとその塩類が特に好ましい炭素源である。
【００１３】また本発明に用いる15Ｎ標識窒素源につい
ては、15Ｎを含むアンモニウム塩、例えば（15ＮＨ4）2
ＳＯ4，15ＮＨ4Ｃｌ，15ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4等及び硝酸塩
類、例えばＫ15ＮＯ3，Ｎａ15ＮＯ3，また15ＮＨ4 15Ｎ
Ｏ3等である。その他酵母の生育上必須の金属イオン等
は通常の酵母の培養と同様に添加する必要がある。一
方、ビタミン類や微量生育因子については生成ＲＮＡ及
び５′ヌクレオチドの13Ｃおよび15Ｎの安定同位体標識
化率を低下させる可能性を有する物質はできるだけ避け
る必要があるが、ビタミン類や微量生育因子を含む材料
として、予め13Ｃおよび15Ｎの安定同位体で高度に標識
された酵母からの抽出液（安定同位体標識酵母エキス）
を添加することにより、13Ｃおよび15Ｎの安定同位体標
識化率を低下させずにビタミン類や微量生育因子を添加
することが可能となる。
ては、15Ｎを含むアンモニウム塩、例えば（15ＮＨ4）2
ＳＯ4，15ＮＨ4Ｃｌ，15ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4等及び硝酸塩
類、例えばＫ15ＮＯ3，Ｎａ15ＮＯ3，また15ＮＨ4 15Ｎ
Ｏ3等である。その他酵母の生育上必須の金属イオン等
は通常の酵母の培養と同様に添加する必要がある。一
方、ビタミン類や微量生育因子については生成ＲＮＡ及
び５′ヌクレオチドの13Ｃおよび15Ｎの安定同位体標識
化率を低下させる可能性を有する物質はできるだけ避け
る必要があるが、ビタミン類や微量生育因子を含む材料
として、予め13Ｃおよび15Ｎの安定同位体で高度に標識
された酵母からの抽出液（安定同位体標識酵母エキス）
を添加することにより、13Ｃおよび15Ｎの安定同位体標
識化率を低下させずにビタミン類や微量生育因子を添加
することが可能となる。
【００１４】次に本発明に用いる酵母について説明す
る。一般に酵母は菌体内に含まれる核酸のうち、ＤＮＡ
に対するＲＮＡの比率が高く、大腸菌などの細菌類より
もＲＮＡの原料としては適しており、調味料用の核酸の
製造のためには酵母が用いられている。特に、標識炭素
源及び窒素源のような高価な原料を用いる本発明の場合
には、炭素源に対する菌体収率およびＲＮＡ収率が高い
ことが重要である。
る。一般に酵母は菌体内に含まれる核酸のうち、ＤＮＡ
に対するＲＮＡの比率が高く、大腸菌などの細菌類より
もＲＮＡの原料としては適しており、調味料用の核酸の
製造のためには酵母が用いられている。特に、標識炭素
源及び窒素源のような高価な原料を用いる本発明の場合
には、炭素源に対する菌体収率およびＲＮＡ収率が高い
ことが重要である。
【００１５】本発明に用いる酵母はこのような条件を満
足することが必要であり、具体的には次のような酵母が
用いられる。例えば、サッカロミセス（Saccharomyce
s）属、キャンディダ（Camdida）属、ピキア（Pichia）
属、ハンセヌラ（Hansenula）属、トルロプシス（Torul
opsis）属、クレッケラ（Kloeckera）属等の酵母に分類
されている通常の酵母菌株を使用することができる。
足することが必要であり、具体的には次のような酵母が
用いられる。例えば、サッカロミセス（Saccharomyce
s）属、キャンディダ（Camdida）属、ピキア（Pichia）
属、ハンセヌラ（Hansenula）属、トルロプシス（Torul
opsis）属、クレッケラ（Kloeckera）属等の酵母に分類
されている通常の酵母菌株を使用することができる。
【００１６】これらの中で特に上記目的のために好まし
い酵母としては、例えば13Ｃ6Ｈ12Ｏ6を炭素源とする場
合には、キャンディダ（Candida）属、例えばキャンデ
ィダ・ウチリス（Candida utilis）、キャンディダ・ト
ロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・リ
ポリチカ（Candida lypolitica）等の種に属する菌株が
好ましい。また、13ＣＨ3ＯＨを炭素源とする場合の好
ましい酵母としては、例えばハンセヌラ・ポリモルファ
（Hansenula polymorpha）、特にハンセヌラ・ポリモル
ファＡＴＣＣ ２６０１２、同ＩＦＯ １４７６、クレッ
ケラ（Kloeckera）属酵母、特にクレッケラ・ｓｐ NO22
01、キャンディダ・ボイディニ（Candida boiddinii）
等が挙げられる。また、13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ及びその塩
類を炭素源とする場合の好ましい酵母としてはキャンデ
ィダ（Candida）属酵母が挙げられる。具体的にはキャ
ンディダ・ウチリスＩＦＯ ０３９６、キャンディダ・
トロピカリス（Candida tropicalis）種に属する酵母、
特に、キャンディダ・トロピカリスＩＦＯ １６４７、
キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）種酵母、キ
ャンディダ・クルセイ（Candida krusei）種酵母等が好
ましい。
い酵母としては、例えば13Ｃ6Ｈ12Ｏ6を炭素源とする場
合には、キャンディダ（Candida）属、例えばキャンデ
ィダ・ウチリス（Candida utilis）、キャンディダ・ト
ロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・リ
ポリチカ（Candida lypolitica）等の種に属する菌株が
好ましい。また、13ＣＨ3ＯＨを炭素源とする場合の好
ましい酵母としては、例えばハンセヌラ・ポリモルファ
（Hansenula polymorpha）、特にハンセヌラ・ポリモル
ファＡＴＣＣ ２６０１２、同ＩＦＯ １４７６、クレッ
ケラ（Kloeckera）属酵母、特にクレッケラ・ｓｐ NO22
01、キャンディダ・ボイディニ（Candida boiddinii）
等が挙げられる。また、13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ及びその塩
類を炭素源とする場合の好ましい酵母としてはキャンデ
ィダ（Candida）属酵母が挙げられる。具体的にはキャ
ンディダ・ウチリスＩＦＯ ０３９６、キャンディダ・
トロピカリス（Candida tropicalis）種に属する酵母、
特に、キャンディダ・トロピカリスＩＦＯ １６４７、
キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）種酵母、キ
ャンディダ・クルセイ（Candida krusei）種酵母等が好
ましい。
【００１７】次に、上述した炭素源、窒素源、及び酵母
菌株を用いて標識されたＲＮＡ及び５′リボヌクレオチ
ドを生産する方法について述べる。上記標識された炭素
源及び／又は窒素源を炭素源及び／又は窒素源とし、更
にカリウム、マグネシウム、リン酸イオン等を、さらに
必要に応じてその他の微量金属イオンを含有する培地を
作製する。ここで注意するべきことは、13Ｃおよび15Ｎ
の標識化率を高めるためには、培地中に混入している標
識されていない炭素及び窒素の量を可能な限り少なくす
ることである。従って、上記標識炭素源及び／又は窒素
源を唯一の炭素源及び／又は窒素源とする培地が望まし
い。ここで注意すべきことは、炭素源の中には、高濃度
で酵母の生育を阻害するものがあることである。一般に
菌の生育が阻害された場合には、菌体収率が低く、ＲＮ
Ａ含量も低い。このような場合には、培地中の炭素源の
濃度を低く抑えるために、炭素源を分割して添加する
か、培地中の炭素源の濃度をモニターしつつ、炭素源を
連続的に培地に供給することが望ましい。このような炭
素源としては、酢酸、メタノール及びエタノール等が挙
げられる。例えば酢酸の場合には培地中の濃度が５ｇ／
ｌ以下、メタノールの場合には、７ｇ／ｌ以下、エタノ
ールの場合には１０ｇ／ｌ以下であることが好ましい。
その他の培地の条件としては特に制限されず、炭素源と
窒素源の量、金属イオン濃度、ｐＨ等は通常で良い。こ
のような培地に上記酵母菌株を接種する。酵母の培養条
件は個々の菌株により異なるが、特に限定されるもので
はなく、通常の酵母の生育に適した培養温度、通気条件
等であれば良い。培養時間は通常、酵母菌の指数増殖期
後期か、定常期に入った時点までとするのが望ましい。
菌株を用いて標識されたＲＮＡ及び５′リボヌクレオチ
ドを生産する方法について述べる。上記標識された炭素
源及び／又は窒素源を炭素源及び／又は窒素源とし、更
にカリウム、マグネシウム、リン酸イオン等を、さらに
必要に応じてその他の微量金属イオンを含有する培地を
作製する。ここで注意するべきことは、13Ｃおよび15Ｎ
の標識化率を高めるためには、培地中に混入している標
識されていない炭素及び窒素の量を可能な限り少なくす
ることである。従って、上記標識炭素源及び／又は窒素
源を唯一の炭素源及び／又は窒素源とする培地が望まし
い。ここで注意すべきことは、炭素源の中には、高濃度
で酵母の生育を阻害するものがあることである。一般に
菌の生育が阻害された場合には、菌体収率が低く、ＲＮ
Ａ含量も低い。このような場合には、培地中の炭素源の
濃度を低く抑えるために、炭素源を分割して添加する
か、培地中の炭素源の濃度をモニターしつつ、炭素源を
連続的に培地に供給することが望ましい。このような炭
素源としては、酢酸、メタノール及びエタノール等が挙
げられる。例えば酢酸の場合には培地中の濃度が５ｇ／
ｌ以下、メタノールの場合には、７ｇ／ｌ以下、エタノ
ールの場合には１０ｇ／ｌ以下であることが好ましい。
その他の培地の条件としては特に制限されず、炭素源と
窒素源の量、金属イオン濃度、ｐＨ等は通常で良い。こ
のような培地に上記酵母菌株を接種する。酵母の培養条
件は個々の菌株により異なるが、特に限定されるもので
はなく、通常の酵母の生育に適した培養温度、通気条件
等であれば良い。培養時間は通常、酵母菌の指数増殖期
後期か、定常期に入った時点までとするのが望ましい。
【００１８】培養終了後、生成した菌体を遠心分離し
て、これからＲＮＡの抽出を行う。ＲＮＡの抽出精製法
は、機械的に又は酵素的に細胞壁を破壊し細胞の内容物
からＲＮＡを精製する方法、菌体を加温下に食塩水で処
理してＲＮＡを抽出する方法、種々の方法を用いること
ができ、特に制限されないが、ＤＮＡの混入の可能性の
少ない方法がより好ましい。
て、これからＲＮＡの抽出を行う。ＲＮＡの抽出精製法
は、機械的に又は酵素的に細胞壁を破壊し細胞の内容物
からＲＮＡを精製する方法、菌体を加温下に食塩水で処
理してＲＮＡを抽出する方法、種々の方法を用いること
ができ、特に制限されないが、ＤＮＡの混入の可能性の
少ない方法がより好ましい。
【００１９】抽出精製したＲＮＡより、５′リボヌクレ
オチド、即ち、５′シチジル酸（ＣＭＰと略記する）、
５′アデニル酸（ＡＭＰと略記する）、５′グアニル酸
（ＧＭＰと略記する）及び５′ウリジル酸（ＵＭＰと略
記する）を製造するためには、通常は酵素リボヌクレア
ーゼによる加水分解を行い、生成した４種類の５′リボ
ヌクレオチドをイオン交換樹脂によるカラムクロマトグ
ラフィー等により分画、分取することにより得られる。
以下に本発明方法について実施例を挙げて説明する。
オチド、即ち、５′シチジル酸（ＣＭＰと略記する）、
５′アデニル酸（ＡＭＰと略記する）、５′グアニル酸
（ＧＭＰと略記する）及び５′ウリジル酸（ＵＭＰと略
記する）を製造するためには、通常は酵素リボヌクレア
ーゼによる加水分解を行い、生成した４種類の５′リボ
ヌクレオチドをイオン交換樹脂によるカラムクロマトグ
ラフィー等により分画、分取することにより得られる。
以下に本発明方法について実施例を挙げて説明する。
【００２０】
（実施例１）キャンディダ・ウチリス ＩＦＯ ０３６９
株を、予め三角フラスコで種母培養し、これをジャーフ
ァメンターに１％植菌した。種母培養及び本培養におけ
る培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国アイソテック社
製；＞９９atom％）７ｇ／ｌ、15ＮＨ4Ｃｌ（同アイソ
テック社製）２.５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、
Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／
ｌを用い、バッチ培養を行った。培養条件としては、槽
内液量３リットル、培養温度２８℃、通気量３リットル／分、攪
拌数３５０r.p.m.、ｐＨ６.５（４ＮＨＣｌによる自動
調整）で５０時間培養を行った。培養終了後、５０００
r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠心分離し、蒸留水で水
洗を３回行った後、湿菌体２６.６ｇ（乾物重量にして
４.７４ｇ）を得た。なおこの菌体の全核酸量及びＲＮ
Ａ量をシュミット−タンハウザー−シュナイダー（Schm
idt-Thannhauser-Schnider；ＳＴＳ法と略記する）の変
法（熱酸抽出法）及びＳＴＳ法で測定した。その測定値
はそれぞれ乾物重量当り８.７％及び７.８％であった。
次にこの湿菌体１０.０ｇ（乾燥重量１.７８ｇ）をと
り、７％ＮａＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁させ、９５℃で
４時間攪拌しながら、ＲＮＡの抽出を行った。冷却後、
遠心分離により上清を得た。この上清に６Ｎ ＨＣｌを
加えてｐＨ１.５とし、ＲＮＡを沈澱させた。さらに遠
心分離を行ってＲＮＡの沈澱を得た。６７％エタノー
ル、９５％エタノール、９９.５％エタノールでこの沈
澱を洗浄し、その後乾燥してＲＮＡの粗抽出粉末を得
た。これはＲＮＡ量にして約１０４ｍｇであった。得ら
れたＲＮＡを元素分析計により成分中の炭素分を二酸化
炭素ガスとし、窒素分を窒素ガスに変換し、これらのガ
スを質量分析計で測定し、各々の標識化率を測定した結
果、このＲＮＡの13Ｃおよび15Ｎの標識化率は約９８％
および約９９％であった。
株を、予め三角フラスコで種母培養し、これをジャーフ
ァメンターに１％植菌した。種母培養及び本培養におけ
る培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国アイソテック社
製；＞９９atom％）７ｇ／ｌ、15ＮＨ4Ｃｌ（同アイソ
テック社製）２.５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、
Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／
ｌを用い、バッチ培養を行った。培養条件としては、槽
内液量３リットル、培養温度２８℃、通気量３リットル／分、攪
拌数３５０r.p.m.、ｐＨ６.５（４ＮＨＣｌによる自動
調整）で５０時間培養を行った。培養終了後、５０００
r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠心分離し、蒸留水で水
洗を３回行った後、湿菌体２６.６ｇ（乾物重量にして
４.７４ｇ）を得た。なおこの菌体の全核酸量及びＲＮ
Ａ量をシュミット−タンハウザー−シュナイダー（Schm
idt-Thannhauser-Schnider；ＳＴＳ法と略記する）の変
法（熱酸抽出法）及びＳＴＳ法で測定した。その測定値
はそれぞれ乾物重量当り８.７％及び７.８％であった。
次にこの湿菌体１０.０ｇ（乾燥重量１.７８ｇ）をと
り、７％ＮａＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁させ、９５℃で
４時間攪拌しながら、ＲＮＡの抽出を行った。冷却後、
遠心分離により上清を得た。この上清に６Ｎ ＨＣｌを
加えてｐＨ１.５とし、ＲＮＡを沈澱させた。さらに遠
心分離を行ってＲＮＡの沈澱を得た。６７％エタノー
ル、９５％エタノール、９９.５％エタノールでこの沈
澱を洗浄し、その後乾燥してＲＮＡの粗抽出粉末を得
た。これはＲＮＡ量にして約１０４ｍｇであった。得ら
れたＲＮＡを元素分析計により成分中の炭素分を二酸化
炭素ガスとし、窒素分を窒素ガスに変換し、これらのガ
スを質量分析計で測定し、各々の標識化率を測定した結
果、このＲＮＡの13Ｃおよび15Ｎの標識化率は約９８％
および約９９％であった。
【００２１】（実施例２）先の実施例１で得られたＲＮ
Ａ ５０ｍｇを０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５.５）１５ｍｌに溶解し、４５℃に加温
し、ここにリボヌクレアーゼＰ1（生化学工業（株）
製）をＲＮＡｍｇ当り０.３単位となるように添加し
た。この分解反応はＴＬＣでモニターし、２時間後に反
応が完結したら０.５ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、さらに2
分間９０℃に加熱し酵素を失活させた。この反応後の溶
液を２倍に希釈し、１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化させた陰
イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ＡＧ−１Ｘ４(200-400メッシュ)
（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製，2.0×64cm）にアプライし、１
０ｍＭ ＨＣｌ ２容と１０ｍＭ ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣｌ
１容の濃度勾配溶出法により５′リボヌクレオチドを
溶出し、１５ｍｌ毎分画し、波長２６０ｎｍで吸光度を
モニターしながら、ＣＭＰ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ画
分を分取した。次に、これらの個々の５′リボヌクレオ
チド画分を集めて、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５
（Pharmacia社製）カラムを用いて脱塩した。これらの
処理により最終的に取得した５′リボヌクレオチド量
は、ＣＭＰが１２ｍｇ、ＡＭＰが１８ｍｇ、ＧＭＰが１
３ｍｇ、ＵＭＰが８ｍｇであった。得られたＣＭＰを元
素分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに、窒素分を窒
素ガスに変換し、それらのガスを質量分析計で測定した
結果、ＣＭＰの13Ｃおよび15Ｎの標識化率は約９７％お
よび約９８％であった。
Ａ ５０ｍｇを０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５.５）１５ｍｌに溶解し、４５℃に加温
し、ここにリボヌクレアーゼＰ1（生化学工業（株）
製）をＲＮＡｍｇ当り０.３単位となるように添加し
た。この分解反応はＴＬＣでモニターし、２時間後に反
応が完結したら０.５ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、さらに2
分間９０℃に加熱し酵素を失活させた。この反応後の溶
液を２倍に希釈し、１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化させた陰
イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ＡＧ−１Ｘ４(200-400メッシュ)
（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製，2.0×64cm）にアプライし、１
０ｍＭ ＨＣｌ ２容と１０ｍＭ ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣｌ
１容の濃度勾配溶出法により５′リボヌクレオチドを
溶出し、１５ｍｌ毎分画し、波長２６０ｎｍで吸光度を
モニターしながら、ＣＭＰ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ画
分を分取した。次に、これらの個々の５′リボヌクレオ
チド画分を集めて、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５
（Pharmacia社製）カラムを用いて脱塩した。これらの
処理により最終的に取得した５′リボヌクレオチド量
は、ＣＭＰが１２ｍｇ、ＡＭＰが１８ｍｇ、ＧＭＰが１
３ｍｇ、ＵＭＰが８ｍｇであった。得られたＣＭＰを元
素分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに、窒素分を窒
素ガスに変換し、それらのガスを質量分析計で測定した
結果、ＣＭＰの13Ｃおよび15Ｎの標識化率は約９７％お
よび約９８％であった。
【００２２】（実施例３）13ＣＨ3ＯＨ（アイソテック
社製；＞９９atom％）５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／ｌ、ビタミン混合液１％を溶
解した培地１リットルを、５リットル容の三角フラスコに入れ、
これにメタノール資化性の酵母であるハンセヌラ・ポリ
モルファＩＦＯ １４７６株を接種し、25℃の温度下で
２２０r.p.m.で回転振とう培養した（ビタミン混合液
は、チアミン１ｍｇ／ｌ、リボフラビン１ｍｇ／ｌ、パ
ントテン酸１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１ｍｇ／ｌ、ｐ-ア
ミノ安息香酸２００μｇ／ｌ、葉酸１０μｇ／ｌ、ビオ
チン１０μｇ／ｌを含有）。培養中、培地中のメタノー
ル（13Ｃ標識メタノール）濃度が０.３〜０.７％となる
ように13ＣＨ3ＯＨを逐次添加し、最終的に全量２０ｇ
の13ＣＨ3ＯＨを使用し７日間培養を行った。培養終了
後、５０００r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠沈し、蒸
留水で水洗を３回行ったのち、湿菌体１０.５ｇを得
た。この菌体の乾物重量は１.８５ｇであり、乾物重当
りの核酸含量は５.２％であった。この菌体の全量を用
いて実施例１と同様の方法でＲＮＡの抽出を行い９０ｍ
ｇのＲＮＡ粉末を得た。得られたＲＮＡを元素分析計に
より炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガスを質量
分析計で測定した結果、ＲＮＡの13Ｃ標識化率は約９８
％であった。
社製；＞９９atom％）５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／ｌ、ビタミン混合液１％を溶
解した培地１リットルを、５リットル容の三角フラスコに入れ、
これにメタノール資化性の酵母であるハンセヌラ・ポリ
モルファＩＦＯ １４７６株を接種し、25℃の温度下で
２２０r.p.m.で回転振とう培養した（ビタミン混合液
は、チアミン１ｍｇ／ｌ、リボフラビン１ｍｇ／ｌ、パ
ントテン酸１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１ｍｇ／ｌ、ｐ-ア
ミノ安息香酸２００μｇ／ｌ、葉酸１０μｇ／ｌ、ビオ
チン１０μｇ／ｌを含有）。培養中、培地中のメタノー
ル（13Ｃ標識メタノール）濃度が０.３〜０.７％となる
ように13ＣＨ3ＯＨを逐次添加し、最終的に全量２０ｇ
の13ＣＨ3ＯＨを使用し７日間培養を行った。培養終了
後、５０００r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠沈し、蒸
留水で水洗を３回行ったのち、湿菌体１０.５ｇを得
た。この菌体の乾物重量は１.８５ｇであり、乾物重当
りの核酸含量は５.２％であった。この菌体の全量を用
いて実施例１と同様の方法でＲＮＡの抽出を行い９０ｍ
ｇのＲＮＡ粉末を得た。得られたＲＮＡを元素分析計に
より炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガスを質量
分析計で測定した結果、ＲＮＡの13Ｃ標識化率は約９８
％であった。
【００２３】（実施例４）実施例３で得られたＲＮＡ５
０ｍｇより実施例２と同様の方法で、５′リボヌクレオ
チドへの酵素分解、および各ヌクレオチドのカラムクロ
マト分離、分取を行った。最終的に取得した５′リボヌ
クレオチド量は、ＣＭＰが１３ｍｇ、ＡＭＰが１５ｍ
ｇ、ＧＭＰが１１ｍｇ、ＵＭＰが１０ｍｇであった。得
られた５′リボヌクレオチドのうちＡＭＰについて元素
分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガ
スを質量分析計で測定した結果、ＡＭＰの13Ｃ標識化率
は約９７％であった。
０ｍｇより実施例２と同様の方法で、５′リボヌクレオ
チドへの酵素分解、および各ヌクレオチドのカラムクロ
マト分離、分取を行った。最終的に取得した５′リボヌ
クレオチド量は、ＣＭＰが１３ｍｇ、ＡＭＰが１５ｍ
ｇ、ＧＭＰが１１ｍｇ、ＵＭＰが１０ｍｇであった。得
られた５′リボヌクレオチドのうちＡＭＰについて元素
分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガ
スを質量分析計で測定した結果、ＡＭＰの13Ｃ標識化率
は約９７％であった。
【００２４】（実施例５）キャンディダ・ウチリス Ｉ
ＦＯ ０３６９株を、予め三角フラスコで種母培養し、
これをジャーファメンターに１％植菌した。種母培養及
び本培養における培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国
アイソテック社製；＞９９atom％）２.０ｇ／ｌ、15Ｎ
Ｈ4Ｃｌ（同アイソテック社製）２.５ｇ／ｌ、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 １.０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・7Ｈ2Ｏ ５０ｍｇ／ｌを用い、本培養では培地中の13Ｃ
標識酢酸濃度が常に２ｇ／ｌ以下を保つように13Ｃ標識
酢酸の添加を行い、最終添加標識酢酸量が３０ｇになる
まで培養を行った。培養条件としては、槽内液量３リット
ル、培養温度２８℃、通気量３リットル／min、攪拌数７００
r.p.m.、ｐＨ６.５（自動調整）で２５時間培養を行っ
た。培養終了後、５０００Ｇにて１０分間酵母菌体を遠
心分離し、蒸留水で水洗を３回行った後、湿菌体６６.
０ｇ（乾物重量にして１１.９ｇ）を得た。なおこの菌
体の全核酸量及びＲＮＡ量をＳＴＳ法（Schmidt-Thannh
auser-Schnider法）により測定した。その測定値は乾物
重量当り１０.７％であった。
ＦＯ ０３６９株を、予め三角フラスコで種母培養し、
これをジャーファメンターに１％植菌した。種母培養及
び本培養における培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国
アイソテック社製；＞９９atom％）２.０ｇ／ｌ、15Ｎ
Ｈ4Ｃｌ（同アイソテック社製）２.５ｇ／ｌ、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 １.０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １.０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・7Ｈ2Ｏ ５０ｍｇ／ｌを用い、本培養では培地中の13Ｃ
標識酢酸濃度が常に２ｇ／ｌ以下を保つように13Ｃ標識
酢酸の添加を行い、最終添加標識酢酸量が３０ｇになる
まで培養を行った。培養条件としては、槽内液量３リット
ル、培養温度２８℃、通気量３リットル／min、攪拌数７００
r.p.m.、ｐＨ６.５（自動調整）で２５時間培養を行っ
た。培養終了後、５０００Ｇにて１０分間酵母菌体を遠
心分離し、蒸留水で水洗を３回行った後、湿菌体６６.
０ｇ（乾物重量にして１１.９ｇ）を得た。なおこの菌
体の全核酸量及びＲＮＡ量をＳＴＳ法（Schmidt-Thannh
auser-Schnider法）により測定した。その測定値は乾物
重量当り１０.７％であった。
【００２５】（実施例６）実施例１の培地組成におい
て、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ ７ｇ／ｌを13Ｃ6Ｈ12Ｏ6（米
国アイソテック社製；９９atom％）１０ｇ／ｌに置き換
えた培地でキャンディダ・ウチリス ＩＦＯ ０３６９株
を培養した。培養中のｐＨは６.５とし、４ＮのＮａＯ
Ｈで自動調節した。その他の条件は、全て実施例１と同
一の条件で１５時間培養を行った。培養終了後、実施例
１と同様の処理を行い、湿菌体６８.５ｇ（乾物重量に
して１４.２ｇ）を得た。この菌体のＲＮＡ含量は乾物
重量当り１１.２％であった。
て、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ ７ｇ／ｌを13Ｃ6Ｈ12Ｏ6（米
国アイソテック社製；９９atom％）１０ｇ／ｌに置き換
えた培地でキャンディダ・ウチリス ＩＦＯ ０３６９株
を培養した。培養中のｐＨは６.５とし、４ＮのＮａＯ
Ｈで自動調節した。その他の条件は、全て実施例１と同
一の条件で１５時間培養を行った。培養終了後、実施例
１と同様の処理を行い、湿菌体６８.５ｇ（乾物重量に
して１４.２ｇ）を得た。この菌体のＲＮＡ含量は乾物
重量当り１１.２％であった。
【００２６】（実施例７）実施例３の培地組成におい
て、13ＣＨ3ＯＨ ５ｇ／ｌを13ＣＨ3 13ＣＨ2ＯＨ（米国
アイソテック社製；９９atom％）５ｇ／ｌに置き換えた
培地でハンセヌラ・ポリモルファ ＩＦＯ １４７６株を
培養した。培養１日後から、１日毎に13ＣＨ3 13ＣＨ2Ｏ
Ｈを１５ｇづつ添加し、その他の条件は全て実施例３と
同一の条件で３日間培養を行った。培養終了後、実施例
３と同様の処理を行い、湿菌体４２.５ｇ（乾物重量に
して７.５ｇ）を得た。この菌体のＲＮＡ含量は乾物重
量当り６.４％であった。
て、13ＣＨ3ＯＨ ５ｇ／ｌを13ＣＨ3 13ＣＨ2ＯＨ（米国
アイソテック社製；９９atom％）５ｇ／ｌに置き換えた
培地でハンセヌラ・ポリモルファ ＩＦＯ １４７６株を
培養した。培養１日後から、１日毎に13ＣＨ3 13ＣＨ2Ｏ
Ｈを１５ｇづつ添加し、その他の条件は全て実施例３と
同一の条件で３日間培養を行った。培養終了後、実施例
３と同様の処理を行い、湿菌体４２.５ｇ（乾物重量に
して７.５ｇ）を得た。この菌体のＲＮＡ含量は乾物重
量当り６.４％であった。
【００２７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の安定同位
体標識ＲＮＡおよびリボヌクレオチドの製造方法は、炭
素源及び／又は窒素源として13Ｃと15Ｎの標識化合物を
用いた培地で、核酸画分のＲＮＡ含有率が細菌よりも高
い酵母を培養し、培養した酵母菌体から安定同位体標識
ＲＮＡを抽出し、或いはそのＲＮＡを分解、精製して安
定同位体標識リボヌクレオチドを生産することにより、
従来の細菌を用いた安定同位体標識ＲＮＡやリボヌクレ
オチドの製造方法に比べ生産効率に優れている。また、
培養菌体より抽出した核酸画分中のＲＮＡ含量が高く、
その核酸画分からＲＮＡを分離精製する際に混在するＤ
ＮＡの分離操作が容易となる。また本発明では13Ｃと15
Ｎの標識化合物を用いた培地で酵母を培養し、培養酵母
菌体より安定同位体標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを
製造するので、標識化合物、特に13Ｃ標識炭素源として
安価なＣ１〜Ｃ２化合物、例えば13ＣＨ3ＯＨと13ＣＨ3
13ＣＯＯＨ及びその塩類を用いて効率良く培養すること
ができる。従って、本発明によれば、標識率の高い安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良
く、安価に製造することが可能となる。
体標識ＲＮＡおよびリボヌクレオチドの製造方法は、炭
素源及び／又は窒素源として13Ｃと15Ｎの標識化合物を
用いた培地で、核酸画分のＲＮＡ含有率が細菌よりも高
い酵母を培養し、培養した酵母菌体から安定同位体標識
ＲＮＡを抽出し、或いはそのＲＮＡを分解、精製して安
定同位体標識リボヌクレオチドを生産することにより、
従来の細菌を用いた安定同位体標識ＲＮＡやリボヌクレ
オチドの製造方法に比べ生産効率に優れている。また、
培養菌体より抽出した核酸画分中のＲＮＡ含量が高く、
その核酸画分からＲＮＡを分離精製する際に混在するＤ
ＮＡの分離操作が容易となる。また本発明では13Ｃと15
Ｎの標識化合物を用いた培地で酵母を培養し、培養酵母
菌体より安定同位体標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを
製造するので、標識化合物、特に13Ｃ標識炭素源として
安価なＣ１〜Ｃ２化合物、例えば13ＣＨ3ＯＨと13ＣＨ3
13ＣＯＯＨ及びその塩類を用いて効率良く培養すること
ができる。従って、本発明によれば、標識率の高い安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良
く、安価に製造することが可能となる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】（実施例３）13ＣＨ3ＯＨ（アイソテック
社製；＞９９atom％）５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１．０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4１．０ｇ／
ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／ｌ、ビタミン混合液
１％を溶解した培地１リットルを、５リットル容の三角フラスコ
に入れ、これにメタノール資化性の酵母であるハンセヌ
ラ・ポリモルファＩＦＯ １４７６株を接種し、25℃の
温度下で２２０r.p.m.で回転振とう培養した（ビタミン
混合液は、チアミン１ｍｇ／ｌ、リボフラビン１ｍｇ／
ｌ、パントテン酸１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１ｍｇ／ｌ、
ｐ−アミノ安息香酸２００μｇ／ｌ、葉酸１０μｇ／
ｌ、ビオチン１０μｇ／ｌを含有）。培養中、培地中の
メタノール（13Ｃ標識メタノール）濃度が０.３〜０.７
％となるように13ＣＨ3ＯＨを逐次添加し、最終的に全
量２０ｇの13ＣＨ3ＯＨを使用し７日間培養を行った。
培養終了後、５０００r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠
沈し、蒸留水で水洗を３回行ったのち、湿菌体１６.２
ｇを得た。この菌体の乾物重量は２.８５ｇであり、乾
物重当りの核酸含量は５.２％であった。この菌体の全
量を用いて実施例１と同様の方法でＲＮＡの抽出を行い
９０ｍｇのＲＮＡ粉末を得た。得られたＲＮＡを元素分
析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガス
を質量分析計で測定した結果、ＲＮＡの13Ｃ標識化率は
約９８％であった。
社製；＞９９atom％）５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１．０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4１．０ｇ／
ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ５０ｍｇ／ｌ、ビタミン混合液
１％を溶解した培地１リットルを、５リットル容の三角フラスコ
に入れ、これにメタノール資化性の酵母であるハンセヌ
ラ・ポリモルファＩＦＯ １４７６株を接種し、25℃の
温度下で２２０r.p.m.で回転振とう培養した（ビタミン
混合液は、チアミン１ｍｇ／ｌ、リボフラビン１ｍｇ／
ｌ、パントテン酸１ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１ｍｇ／ｌ、
ｐ−アミノ安息香酸２００μｇ／ｌ、葉酸１０μｇ／
ｌ、ビオチン１０μｇ／ｌを含有）。培養中、培地中の
メタノール（13Ｃ標識メタノール）濃度が０.３〜０.７
％となるように13ＣＨ3ＯＨを逐次添加し、最終的に全
量２０ｇの13ＣＨ3ＯＨを使用し７日間培養を行った。
培養終了後、５０００r.p.m.にて１０分間酵母菌体を遠
沈し、蒸留水で水洗を３回行ったのち、湿菌体１６.２
ｇを得た。この菌体の乾物重量は２.８５ｇであり、乾
物重当りの核酸含量は５.２％であった。この菌体の全
量を用いて実施例１と同様の方法でＲＮＡの抽出を行い
９０ｍｇのＲＮＡ粉末を得た。得られたＲＮＡを元素分
析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、このガス
を質量分析計で測定した結果、ＲＮＡの13Ｃ標識化率は
約９８％であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｒ 33/28 (Ｃ１２Ｐ 19/30 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 福田 裕章 茨城県つくば市大久保10 日本酸素株式会 社つくば研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち
一方または両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培
養酵母菌体より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及
び／又は全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％
以上であるＲＮＡを抽出することを特徴とする安定同位
体標識ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項２】 13Ｃ標識化合物が13ＣＨ3ＯＨ、13ＣＨ3
13ＣＯＯＨ及びその塩類、13Ｃ6Ｈ12Ｏ6、13Ｃ2Ｈ5ＯＨ
のうちのいずれか一種であることを特徴とする請求項１
記載の安定同位体標識ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項３】 上記酵母菌がキャンディダ属酵母である
ことを特徴とする請求項１又は２記載の安定同位体標識
ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項４】 13Ｃ標識化合物と15Ｎ標識化合物のうち
一方または両方を原料として酵母菌を培養し、次いで培
養酵母菌体よりＲＮＡを抽出し、さらに該ＲＮＡを分解
して全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比及び／又は全
窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上である
５′リボヌクレオチドを分離することを特徴とする安定
同位体標識リボヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項５】 13Ｃ標識化合物が13ＣＨ3ＯＨ、13ＣＨ3
13ＣＯＯＨ及びその塩類、13Ｃ6Ｈ12Ｏ6、13Ｃ2Ｈ5ＯＨ
のうちのいずれか一種であることを特徴とする請求項４
記載の安定同位体標識リボヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項６】 上記酵母菌がキャンディダ属酵母である
ことを特徴とする請求項４又は５記載の安定同位体標識
リボヌクレオチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6019669A JPH06319581A (ja) | 1993-03-15 | 1994-02-16 | 安定同位体標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5375793 | 1993-03-15 | ||
| JP5-53757 | 1993-03-15 | ||
| JP6019669A JPH06319581A (ja) | 1993-03-15 | 1994-02-16 | 安定同位体標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319581A true JPH06319581A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=26356516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6019669A Pending JPH06319581A (ja) | 1993-03-15 | 1994-02-16 | 安定同位体標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06319581A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999062924A1 (fr) * | 1996-01-26 | 1999-12-09 | Nippon Sanso Corporation | 5'-ribonucleotide marque par d et son procede de production |
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
| AT501629A1 (de) * | 2005-04-05 | 2006-10-15 | Erber Ag | Herstellung von hochgradig isotopenmarkierten, sekundären, mikrobiellen stoffwechselprodukten sowie stoffwechselprodukte |
-
1994
- 1994-02-16 JP JP6019669A patent/JPH06319581A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999062924A1 (fr) * | 1996-01-26 | 1999-12-09 | Nippon Sanso Corporation | 5'-ribonucleotide marque par d et son procede de production |
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
| AT501629A1 (de) * | 2005-04-05 | 2006-10-15 | Erber Ag | Herstellung von hochgradig isotopenmarkierten, sekundären, mikrobiellen stoffwechselprodukten sowie stoffwechselprodukte |
| AT501629B1 (de) * | 2005-04-05 | 2007-10-15 | Erber Ag | Herstellung von hochgradig isotopenmarkierten, sekundären, mikrobiellen stoffwechselprodukten sowie stoffwechselprodukte |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050308 |