SU667558A1 - Способ получени -рибулозо-1,5дифосфата - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к получению oj ганичесжих биологически активных веществ с помощью иммобилизованных ферментов. Б Рибупозо«-1,5« ифосфат занимает ценгральное место в биосинтезе органичес- кйх веществ во всех зеленых растени х : н в р де микроорганизмов,  вл  сь акцептором углекислоты в цикле Кальвина, Соответствующую реакцию катализует фермент рибулозо-дифосфаг карбоксрлаза (КФ 4.1.1.39). Предпосылкой всестороннего иэуче1а и  мв анизма действи  этого фер- НА «О I Нй-ОЙ не- он J I о HiC-o-p- о Д- fuSne-S - фвс9ат .€«0 Яле-о Д PaSy ffffC менга  вл етс  наличие достаточного количества Ti -рибулозо-1,5-дифосфата. Получение Т)-рибулозо 1,5-дифосфата основываетс  на ферментативном превращении D - ибозо-5-фосфата в Б-рибулозо-1 ,5-дифосфат. Реакци  протекает в две Ьтадии с участием ферментов рибозофосфатизомеразы (Б-рибозо-5-фосфат-кетол- -изомераза КФ 5.3.1.6) и фосфорибулаки назы (АТФ:Д-рибулозо-5-ф6сфат« 1-фосфат трансфераза КФ 2.7.1.19) по следующей схеме . . I HjC-o-p I НС-он I локиназл не- он -о- О - Р - 0 Г A-PU 5 -5- вифосфат Известен способ получени  D -рибуло« зо--1,5-дифосфага, имеюший промышленное значение l. По этому способу целевой продукт получают ферментативно из В -рибоао-5-фосфата и аденозин- -трифос 4«та {АТФ) с применением в качестве биркатализатора бесклеточного экстракта тионовых бактерий ThioboiciEEtis S&R , По йучение целевого продукта по этому спосо бу предусматривает проведение трех ос- новных стадий: получение ферментных препаратов рибо- зофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы; синтез Э -рибулозо-1,5-дифосфата фер ментным путем из D -.рибозо-б-фосфата и АТФ в атмосфере инертного газа, предпочтительно при рН 7,5-7,8} выделение препарата Б -рибулозо-1,5- -дифосфата обычно в виде бариевой соли и его.очистка. Недостатком этого способа  вл етс  применение в качестве ферментного катализатора водорастворимого бесклеточного экстракта тионовых бактерий. Водораство- ри;мый бесклеточный экстракт тионовых бактерий можно примен ть только однокра но, .В ходе вьщелени  и очистки D -рибу- л6зо-1,5- дифрсфата из реакционной смеси ферменты бесклёточного экстракта инакти вируютс  необратимо. В то же врем  выращйвание бактерий и выделение бёсклеточного экстракта  вл ютс  наиболее трудоемкими этапами получении О -риб гтлозо-1«5-дифосфага . Целью изобретени  ЯБЛ е1 ;  упрощение способа получени  ТЗ-рибулозо-1,5-йи фосфата и пов ышение выхода целевого продукта . - . ,. . : . . - . Указанна  цель достигаетс  тем, что белки бесклеточного экстракт св зывают на пористой стекле, активированием фос- . геном и полученньШ иммобилизованный ферментный препарат используетс  много- .кратно.. Согласно изобретению описываетс  спо соб получени  В -рибулозо-1,5-иифосфа ,га путем взаимодействи  13 -рибозо-5- -фосфата и АТФ в атмосфере инертного газа с использованием в качестве биокатализатора бесклеточного экстракта штамма ТЫ о bacitE us 581 (Институт микробиопогин АН СССР), иммобилизованного на пористом стекле, активированном фоогеном . Процесс обычно провод т в атмосфере аргона при рН среды 8,4-8,6. Примен емый катализатор можно ио- пользовать многократно. Предпочтительно процесс провод т слб- дуюшим образом. Исходное сырье: получают иммобилизованные экстракты тионовых бактерий посредством св зывани  их с пористым стеклом , активированным при помощи последовательной обработки - -аминопропилтриэтоксисиланом и фосгеном {изоцианатное стекло). Белки бесклеточного экстракта (Ю мг/мл) св зывают с активированным изоцианатными группами стеклом (0,5г/мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,6-7,8) в течение 15-20 ч на холоду. Препарат отмывают от несв занных белков iMpacT вором NaCt. Целевой продукт готов т следующим образом. Готов т реакционную смесь, содержащую следующие компоненты (указаны конечные концентрации), ммоль: MgCE. 27; цистеин 6,6; D-рибозо-5-фосфат 27; АТФ 27. рН раствора довод т до 8,4 8 ,6 с помощью 2 н. КаОН, Прибавл ют It смеси иммобилизованный ферментный: препарат (33 г на 1 л). Реакцию провод т в атмосфере аргона, отсутствие:угпекислого газа в системе 5гол етс  необходимым условием, при коь1натной темпера- .туре, рН раствора поддерживают при 8,48 ,6 титрованием 2,0 н. раствором NaOH. Тродолжительнорть реакции 2-3 ч. ЖийKyip фазу бтдел 1бт п6средст1вом декантиров ни . Стекло отмьшают водой. Основной раствор и иромывньш воды объедин ют , затем провод т частичную очистку целе вого продукта и выдел ют обычно в виде бариевой сойи иэвеетньп методом. ТехНйко-экономическа  эффективность oi йсйоЯЬзованй  предлагаемо1х способа дл  получени  D рибулозс -1,5-диф6сфата выражаетс  в обеспечении по сравне- рий с сущест1вующими с о 6бами следук. щйх преийуЩеётв: .в св зи с многократ HbiM применением биокатали тора уменьшаютс  расходы на выратцйвание микроорганизмов и выделение ферментного препарата , применение твердого биокатализа- тора по ол ёт увеличить выход IJ - ибулозо-1 ,3 йнгфс ::фата-в 1,8 раз по сравне ВИЮ с растворимым ферментным п|эепаратомП р и м е р. Исходное сырье: 10 г пористого стекла о6рабать1вают в течение 30 ч 5%.ым раствором -аминопропи этриэтоксисилйвд в абсолютном толуоле (1ОО мл) при темпе ратуре кипени  раст вора. После охлаждени  стеклопромыва ют толуолЬм и обрабатьгоают в течение 2 ч 0,25 М раствором фосгена в абсолкугном толуоле (20 мл) при гемперагуре ки пени  толуола. В ходе обработки аминогруппы на поверхности стекла переход т в изоцианатные. Полученное изоцианатное стекло высушивают в вакууме при темпеpa туре ниже 100 С. Клетки тионовых бактерий ThiofeacttCus 58R (штамм выделен в Институте микробиологии АН СССР) разрушают озвучиванием суспензии микробов в дес тикратном количестве 0,i М фосфатного буфера (рН 7,6) при в аппарате УЗДН-1 У 4.2 при ч&сгоке 22 кГц в теч&ние Ю мин Оболочки клеток осаждают центрифугирова нием при 2ОООО в течение 40 мин. Св зывание белков бесклеточнЬшэйр тракта тионовых бактерий провод т в ОД М фосфатном буфере (рН 7,6-7,8)7 10 г активированйохх изоцианатными группами стекла суспендируют в 20 мл раствора, содержащего 10 мг белка el мл. Полученную суспензию вакуумируют дл  удалени  воздуха из пор стекла и ос тавл ют в холодильнике (4С) на 15 «« 20 ч при посто нном иеремешиванйй. По- лученный препарат промывают 1 л 1,ОМ pacJBopa N аСЕ в колонке в течейие 3 ч -И хран т в холодильнике ()вОД5 М растеора КаСЬ, При составлении реакциошюй смеси дл  превращени  Ц -)Ри6оЗо 5-фосфазга в 1) рибулозо-.1,5-йифосфат за основу 61лш прин та методика, предложенна  дл  ostipe деленй   рибулокиназы; Н-О (8 ммоль) - навеску 1,63 г рас1«о{} ют в 20 мл воды. Цистеин сол нокислый (2 ммойь) - навеску 0,355 г раствор ют в 10 мл воды, рйбозо-5-фосфат рп  щеревод т В нйт)риевую соль. Дл  этого |8 м:Моль;-риб6зо-5-фосфата (навеска 3,36 г с учетом содержани  в препаг -рате i5i% воды) раствор ют в 40 йл ох« (Лажденнрй до ОД н. сол ной KHcrio-i те и добавл ют 8 ммоль (1,136 г безвод ной соли) сульфата натри . Осадок BaSQ4 удал ет «ентрифугирСванием. Аденоз1ш-5 -трифосфорна  кислота, наТ риева  сойь (АТФ) - 8 ммоль{ навеску 5,О7 г раствор ют в ЗО кстводы.. В четьфехгорлую ко;йу емкостью 50О мл, снабженную механической мешалкой , электродами рН-стата и трубками дл  введени  газа н титрующего раствору заливают 15О мл бидистиллированной во ды, 20 мл раствора хлористого магйй , 1О мл растеора цистеина, 4О мл jpacieopa рибозо-5-фосфата натри  и 30 мл рает вора АТФ. Добавлением 2,О н. раствора hTaOil при интенсивном перемешивании повод т pf{ раствора до 8,4-8,6. Прибавл ют 10 г ферментного препарата и воды до общего объема ЗОО м.л. Реакцию провод т в атмосфере аргона при комнатной температуре, рН раствора поддерживают при 8,4-8,6 титрованием 2,0 в. раствором N аОН. Продолжительность реакции 2-3 ч. Жидкую фазу реакционной смеси отдел ют от стекла декантированием. Стекло промывают двум  порци ми воды по 15мл, Основной раствор и промывные воды обье дин ют и нанос т на колонку (3,0x30 см) с сильноосновным анионитом JBowex-M в СЕ-форме со скоростью 100 мл/ч. Адсорбированные веществй элюируют линейным градиентом соли и кислоты, составленным из 2,0 л бидистиллированной водыи2,0 п 6,3 М КаСС + 0,ОЗ М нее при скороог ти 1ОО мл/ч. В -Рибулоэо-1,5-дифосфат вьЕсодиТ из колонки сразу после АТФ. Разделение  вл етс  неполным, фракции, содержащие В -рибулозо-1,5-дифосфат, объедин ют , довод т рН раствора до 2,0 прибавлением 2,0 н. раствора НС. Прибавл ют 15,0 г активированного медицин- ского угл , п|эедварительно промытого в колонке 1 н. НС, а затем 1О%-ноЙ трихлоруксусной кислотой, и отмьгтого до нейтральной реакции.. Жидкую фазу отделйют от фильтрованием, угопъ много ipaTHO (4-5 раз) промывают водой до 20 мл, каждый раз суспендиру  уголь в воде. Промьгеныё воды объедин ют с осHOBHbiM раствором и довод т до рН 6,0 добавлением растеора МаОН. Затем к раствору добавлшот 15 мл 1,0 М j cTBOpa уксуснокислого бари  н бариевук) соль В -рибулозо-1,5-дифосфата осфвдают добавлением 96%.ч1ого этанола до конйентрадии 30% (по объему). Осадок отдеп к)Т дёнтрифугирснванием, про мывают 8О%««ым этанолом и высушива- . , .,, т до посто нного веса в вакууме над Вес подученного продукта (2,95 г) оогвётс;Твует выходу 5О% от теорети еского. Анализ препарата на содер)йанив шелоч олабильного фосфора показьтает, что пре арат содержит 75% D -рибулЬзо -1,5 йифосфата . Проверку способности препарата акцепировать углекислоту провод т с 14С«ме« енным бикарбонатом натри  в щзнсутст-ни гомогената ЕЛГСШИХ растений. Рвзуль

,. 667558

. ,, Q

tarbi ЬпрёДелени  радиоакгивносги свиде в качестве биокагализатора примен ют

tenbCTByiot о высоком качестве получен-бесклеточньтй экстракт штамма Thiobacittus

него препарата как реактива-акцептора58R {Институт микробиологии АН СССР),

С0„.иммобилизованный на пористом стекле, акФорму .ла изобретени 2. Способ по п. 1. о т л и ч а ю 1 . Способ получени  D -фибулозо« 1,5«-щи и с   тем, что процесс ведут при

-дифосфаГа путем взаимодействи  ТЗ-ри-рН 8,,в в атмосфере аргона. / бозр-5-фосфата и аденозинтрифосфата ватмосфере инертнохч) га:за с использовани-10 Источники информации, прин тые во

ем бибкаталйзат-ора, о т л и ч а к ш и и внШа йв 1фн экспертизе с   тем, чго, с йелью упрощени  процес 1. АвторскЬе свидетельство СССР

са и повышени  выхода целевого продукта, 1 3б9610,кл,С12 1)13/16,30.11.71.

5тивированном фосгеном.