JPH01218597A

JPH01218597A - ピロロキノリンキノンの製造方法

Info

Publication number: JPH01218597A
Application number: JP4197888A
Authority: JP
Inventors: Sadaji Uragami; 貞治浦上; Kazuya Yashima; 八島　一也
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1989-08-31
Anticipated expiration: 2013-05-18
Also published as: JP2751183B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ピロロキノリンキノンの製造法に関し、さら
に詳細には、細菌を使用したピロロキノリンキノンの製
造法に係わる。

ピロロキノリンキノン（以下　ＰＱＱと記ス）は、別名
２，７．９−トリカルボキシ−ＩＨ−ピー口（２、３ｆ
）キノリン−４，５−ジオンであり、補酵素として酵素
反応または物質代謝系を活性化し、また、ビタミン作用
を有することも明らかとなっており、医薬品として重要
な役割を果す物質と考えられている。

〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕従来、Ｐ
ＱＱの製造法としては、有機化学的合成法が知られてい
る（例えば、ＪＡＣ３，。

１０３巻、５５９９〜５６００頁（１９８１））。

しかしながら有機化学的合成法は、多段階の合成反応か
ら成るために、製造に長時間を要し、異性体をはじめと
する副生物の除去のために、煩雑な操作を必要とし、ま
た、ＰＱＱの収率も低いという問題がある。

他方、発酵法による製造法も知られているが、その多く
は、ＰＱＱの生産菌自体に関するものであり、ＰＱＱの
培養法については、たとえば、特開昭６２−１２６９８
８公報に開示されている。この公開公報において示され
ている方法は、「メタノール資化性細菌を４０■／１以
上のマグネシウム（ＭｇＳ０４．７ＨｚＯで０．４９７
１以上）を含有する栄養培地で培養する方法」であるが
、そのＰＱＱの生−性は工業的に生産するには、不十分
である。また、この方法に用いられている培地中の鉄の
濃度は、約０．２１１Ｆ／１　（ＦｅＳＣ）４．７Ｈｚ
ｏ　　ＩＷ／ｌ）であって低いものである。

また、今まで報告されているメタノール資化性細菌の培
養において、培地組成として、鉄に着目したものはみら
れず、ジャーファメンターを用いて、メタノールを少量
ずつ添加しながら回分培養する、いわゆる流加培養ある
いは連続培養においては、鉄として５ｐｐｍ　以上の鉄
化合物が添加されているのが一般である。しかし、これ
らの培養においてＰＱＱの生産性は極めて低い。

本発明者らは、ＰＱＱの生産性の向上を目的として、Ｐ
ＱＱの生化学的製造方法を種々検討した。

ｒ問題を解決するための手段、作用〕本発明者らは、ＰＱＱの生産性を向上させるへく、培養
法を種々検討したところ、メタノールを主炭素源とし°
てＰＱＱ生産菌を培養するに際し、培養液中の鉄化合物
の濃度が、ＰＱＱの生産性に大きく関与することを発見
し、この発見にもとづき、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、メタノールの資化性を有シ、かつ
、ピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を
用いて、炭素源として少くともメタノールを含有する培
地で培養して、ピローキノリンキノンを生産するに際し
、培養液の鉄化合物の濃度を鉄として０．３〜２ｐｐｍ
に制御して培養液中にピロロキノリンキノンを蓄積せし
めることを特徴とするピロロキノリンキノンの製造方法
である。

本発明において使用される細菌としては、メタノールの
資化性を有し、ピロロキノリンキノンを生産する能力を
有する細菌であればよく、その代表例としては、次のよ
うなものがある。

すなわち、メチロバチルス　グリコゲネス、メチルフィ
ラス　メチートロファス、プートモナス　エクストロク
エンス、メチ−バクテリウム　オルガノフイラム、アセ
トバクター　７キユアテイクス、ハイホミクロビウム　
プルガレ、ハイホミクロビウム　メチロポラム、キサン
トバクタ−オートトロフイカス、キサントバクタ−フラ
パス、アセトバクター　メタツリカス、パラプツカス　
デニトリ７−イカンス、チオバチラス　ノペルスおよび
ミコバクテリウム　メタノリカなどがある。

メチルフィラス　メチロトロファスは、１９８７年ｓ　
Ｊｅｎｋｉｎらがメチ−バチルス　グリコゲネスに含ま
れていた一部の菌株をメチ−バチルス属から分離独立さ
せ設立したものである（Ｊｅｎｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

ど、ｐ、４４６〜４４８　（１９８７））。

また、７セトバクター　サデュ（特開昭６ｌ−２４７３
９７）は、浦上と駒形との分類により、アセトバクター
　メタツリカスに再同定されている（Ｕｒａｋａｍｉ　
ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ、Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３３．ｐ、１３５〜
１６５（１９８７））。

さらに、これらの菌種の他に、以前は７クーモバクター
属、メタノモナス属、メチ−モナス属、プロタミノバク
タ−属、シュードモナス属、ミコプラナ属、ミクーチク
ルス属およびアルテロモナス属に属する菌株もあった（
たとえば特開昭５９−１１３８９６．特開昭６０−２５
１８９５、特開昭６１−２４７３９７および特開昭６２
−１９０９４など）が、これらの菌については、その後
、分類上の改訂が行なわれている、すなわち、浦上と駒
形との分類では、アクロモバクタ−属、メタノモナス属
、およびメチ−モナス属のそれぞれに属するメタノール
資化性細菌はメチリバチルス　グリコゲネスに、ミコプ
ラナ属に属するメタノール資化性細菌はプートモナス　
エクストロクエンスに、ミクーチクルス属に属するメタ
ノール資化性細菌はアンシロバクター　７キユ７テイク
スに、また、アルテロモナス属に属するメタノール資化
性細菌はメチロファーガ属に含まれ、プロタミノパクタ
ー属およびシュードモナス属のそれぞれに属するメタノ
ール資化性細菌は、それぞれメチロバチルス　グリコゲ
ネスおよびプｐトモナスエクストｐクエンスに含まれて
いる（　Ｕｒａｋａｍｉａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａｅ　
Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｅ
３４、　　ｐ、１８８〜２０１　　（１９８４）、Ｉｎ
ｔ。

Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　３６．　
ｐ、４１５〜４２１（１９８６）　、Ｉｎｔ、　Ｊ、　
５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　３６゜ｐ、　５
０２〜５１１　（１９８６）　、　Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓ
ｔ、Ｂａ−ｃｔｅｒｉｏｌ、、　３７．　ｐ、４０２〜
４０６　　（１９８７）　）。

これらのメタノールの資化性を有し、ＰＱＱを生産する
能力を有する細菌（以下　ＰＱＱ生産菌　と記すことも
ある）を培養するにあたって、培養液の鉄化合物の濃度
を鉄として０．３〜２ｐｐｍ　に制御する以外は、メタ
ノール資化性細菌の培養に使用される通常の培養法と異
なるところはない。

培地または培養液に添加された鉄化合物は、極めて短い
時間で菌体内に取９込まｈｌその鉄化合物のま工で、菌
体内に滞留する。

従って、培養液の鉄化合物の濃度は、培養液中の菌体に
取り込まれた鉄化合物の鉄分の重量と培地中の鉄化合物
の鉄分の重量との和を培養液の重量で除した商または培
地もしくは培養液に添加された鉄化合物の鉄分の総重量
を培養液の重量で除した商として定義される。

培養液の鉄化合物の濃度を所定の値に制御するためには
、回分培養では（イ）予め培地を調製する際に培地の鉄
化合物の濃度を所定の値とするζ口）鉄化合物を含有し
ない培養液に培養開始時に鉄化合物を添加して、培養液
の鉄化合物の濃度を所定の値とする　および　（／１鉄
化合物を含有しないかまたは所定量の鉄化合物の中の一
部を含有した培養液に残部の鉄化合物を培養期間内に数
回に分割して、または連続的に添加する。

この場合にも、添加された鉄化合物の鉄分全量（＝所定
量）を培養液の重量で除した商が培養液の鉄化合物の濃
度となる。

また、連続培養ではに）鉄化合物を培養槽に補充しない
場合と（ホ）鉄化合物を培養槽に分割して、または連続
的に補充する場合とがある。に）の場合には培養液の鉄
化合物の濃度は、培養槽入口と培養槽出口とでは、実質
的に差はなく、ともに所定の値とされ、また（ホ）の場
合には培養液の鉄化合物の濃度は培養槽出口で所定の値
とされる。

培養液の鉄化合物の濃度は、鉄として０．３〜２ｐｐｍ
　　であり、この範囲の外では、ＰＱＱの生産性は著し
く低下する。なお、培地に使用する水として、工業用水
、井戸水などの鉄を含の濃度が前記の範囲に入るように
鉄化合物を補充すればよい。

鉄化合物の種類は、水溶性で、かつ、ＰＱＱ酸鉄、硝酸
鉄およびリン酸鉄などが好適に用いられ、培地または培
養液に溶解していることが必要である。また、主炭素源
として、メタノールを含有することが必要である。

培地中または培養液中のメタノール濃度は、使用する細
菌が生育、増殖できる濃度であればよいが、一般的には
、１．５重量％を越えると生育、増殖速度が遅くなり、
３重量０（以上では、生育、増殖速度はさらに低下し、
６重量９にでは生育、増殖しない。

従って、回分培養においては、培養液中のメタノール濃
度を１００　ｐｐｍ　〜１．５重量０〈にｌｌｆｆ１Ｌ
、ながら培養することが好ましい。また、連続培養にお
いては、培養液中のメタノール濃度が０．５重量π以下
、好ましくは１？ＩＩ量Ｏ〈になるように培養すればよ
く、供給する培地中のメタノール濃度には、特に制限は
ない。しかし、実質的には１重量π〜１５重量％が好ま
しい。

培養液中のメタノール濃度の測定は、培養液中のメタノ
ール濃度をガスクルマドグラフィーで分析する方法、排
ガス中のメタノールを分析し弁士ダ培養液中のメタノー
ル濃度を知る方法などによって行なわれる。

さらに培地成分として、通常の窒素源、無機物の適量が
使用される。

窒素源としては、通常は、たとえば硫酸アンモニウム、
尿素、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムなど
が用いられ、生育に必要な量を添加する。窒素源として
、アンモニウム塩を使用する場合は、細胞が増殖するに
伴って培養液中のｐＨが低下するので、培養液中のｐＨ
ヲ所定の値に保つために、アンモニア、苛性カリもしく
は苛性ソーダ等を添加して培養液の田を調節する必要が
ある。これらの中でアンモニアが特に好ましい。

無機塩類としては、通常は、たとえばリン酸塩、マグネ
シウム塩およびその他必要に応じて微量金属塩が用いら
れる。鉄以外の無機塩類の添加量は、特に制限はなく、
通常用いられる量でよいが、ＰＱＱの生産量を高めるた
めには、高い菌体濃度が好ましいので、細菌の生育、増
殖にとって、十分な量の添加が好ましい。また、使用菌
株が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質を培地
に添加する必要がある。

なお、メチロファーガ属細菌は、生育に食塩を必要とす
るので、培地に食塩を２〜４重量％添加するか、あるい
は培地に用いる水として海水を使用する必要がある。培
養条件は、使用する細菌が生育し得る条件であればよい
。たとえば培養ｐＨは、通常はｐＨ６〜８とされるが、
用いる細菌によっては、この範囲をはずれることもある
。たとえば、アセトバクター　メタツリカスなどは、通
常はｐＨ２，５〜５．５とされる。

連続培養で生産を行なう場合は、供給培地中の鉄含量を
０．３〜２ｐｐｍ　　とし、かつ、他の成分を十分量と
した培地を使用し、培養液中にメタノールが存在するよ
うな滞留時間あるいは、メタノールの添加量を調節する
ことにより、ＰＱＱの生産を行なう。

このような培養を行なうことにより、ＰＱＱ生産菌は、
メタノールを消費してＰＱＱを生産し、このＰＱＱは培
養液中に排出蓄積されるが、ＰＱＱは酸性物質であるの
でその蓄積に従い、培養液のｐＨが低下する。従って、
アンモニア水などのアルカリを添加し、培養液のｐＨを
使用された細菌の生育ｐＨの範囲に調節する必要がある
。

このようにして得られた培養液から、たとえば、ろ過も
しくは遠心分離などの通常の固液分離手段によって、菌
体を除去し、培養上澄液を得る。得られた培養上澄液あ
るいは、場合によっては、菌体な含有する培養液からＰ
ＱＱを発情製は、通常の方法によって行なうことが出来
る。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、濃縮物
のゲルろ適法、凍結乾燥物の溶媒抽出法あるいはアフィ
ニティー　クロマトグラフィーなどが利用できる。

このようにして得られたＰＱＱは、高速液体りｐマドグ
ラフィー、元素分析、核磁気共鳴スペクトルおよび質量
分析などによって同定される。

また、定量法としては、大腸菌のＤ−グルコース脱水素
酵素を用いる方法（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　　第４９巻、第１２２７〜１２３１頁
１９８５）あるいは、高速液体クロマトグラフィー（検
出器、紫外検出あるいは蛍光分析）などがある。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例　１純水１ノあたり、（ト）Ｈ４）　２ＳＯ４３，０ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１，４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４２、１＆、Ｍｇ５
Ｏ＜　、　７Ｈ２００，２９、ＦｅＣ５ＨｓＯｚ　、Ｘ
Ｈ２Ｏ３０４、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２０５ｊｌ、ＣａＣ４
ｚ、２ＨｚＯ３０！、ＭｎＣＡ’ｚ、４Ｈ２０５〜、Ｃ
ｕＳＯ４，５ＨｚＯｏ、ｓｉｙ　　およびメタノール　
８−を溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００−を
１！容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌し
、これを培地とした。

これに、ハイホミクロビウム　エスピー　ＤＳＭ　　１
８６９　　を接種し、３０℃でロータリーシェーカーで
回転数２２０回／分の回転振とう培養を行なった。この
培養液を種母液とした。

純水１１あたり、（ト）Ｈ４）　２ＳＯ４１、０９、Ｍ
ｇ５Ｏ＋　。

７Ｈｚ０１．０１、ＫＨｚＰＯ４１，４９含む培地１５
ノを３０１容培養槽に入れ、殺菌した。

純水１０ｍ１あたり、ＦｅＳＯ４，７Ｈｚ０７５Ｍ’、
ＺｎＳＯ４，７ＨｚＯ１５０＋Ｗ、ＣａＣ１ｚ−２Ｈｚ
Ｏ１５０１１１９、ＮａＣ１１５０１ｎ９、ＭｎＳＯ４
，４−５ＨｚＯ４５ｒ４、Ｈ３Ｂ０３３■、ＣｕＳＯ４
，５ＨｚＯ１，５＃、ＣｏＣ１２−２Ｈ２０１，５■、
ＫＩ　　１．５■、（ト）Ｈ４）　ｓＭｏ７０２．。

４Ｈ２０１，５〜を含むミネラル溶液を殺菌した。

３０１培養槽内の培地の温度が３０℃に低下したのち、
このミネラル溶液１０ｒｎｔを無菌的に加え、さらにア
ンモニア水を無菌的に添加して、培養液のｐＨを６．８
に調整した。この培養槽に、メタノールを１５０ｍｌお
よび前記の種母液２００ｍ１を無菌的に加え、通気量　
１０１　／ｍｉｎ。

攪拌数３０　Ｏｒｐｍ　で温度３０℃、培養ｐＨを６．
８になるようにアンモニア水を添加しながら培養した。

細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノール濃度が
低下したが、それを排気ガス中のメタノールをガスクロ
マトグラフィーで分析することにより検出し、培養液中
のメタノール濃度がｏ、ｔ〜０．５重量％になるように
メタノールを供給した。

また、ミネラル溶液の１ＯＡ！あたりのＦｅＳＯ４゜７
Ｈ２０量をそれぞれ１１．２５＃、２２．５ｍ１３７．
５ｗｈ９．１１２．５＃、１５０ｊ１９および２２５■
に変更した以外は、前記と同様にしてそれぞれ１０日間
培養した。

培養液の菌体量（６１０ｎｍの吸光度で示す）およびＰ
ＱＱの蓄積量を表１に示す。

実施例　２菌株としてノ・イホミクロビウム　プルガレＮＣＩＢ　
　９７７５　　を使用し、３０１容培養槽へ入れるミネ
ラル溶液組成を１０ｆｎｔあたつＦｅＣＪ３．６Ｈｚ０
７５■、ＺｎＳＯ４−７ＨｚＯ１５１ｎ９、ＣａＣ１ｚ
　、　２Ｈ２０１５＃　、ＮａＣ１１５＃、ＭｎＳＯ４
゜４−５Ｈ２０４，５１Ｒ９、Ｈ３ＢＯ３０，３＋１’
＋９、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２００，１５■、Ｃ０ＣＡ！２
−２Ｈ２００，１５η、ＫＩＯ，１５Ｑ、（ＮＨ４）　
ｓＭｏ７０２４−４ＨｚＯ０，１５Ｉｎ９とした以外は
、実施例１と同様にして、１０日間培養した。

実施例　３菌株として、ハイホミクｐビウム　メチロボＦｅ５（Ｐ
Ｏ４）　２．８Ｈ２０４５＋１１９、ＺｎＳＯ４，７Ｈ
ｚ０１５■、Ｃａ（Ｊｚ、２ＨｚＯ１５１１１９、Ｎａ
Ｃ１１５＃、ＭｎＳＯ４゜４−５Ｈ２０４，５Ｗ、Ｈ３
ＢＯ３０，３＃　、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２００，１５′ｍ
ｇ、ＣｏＣｌ２−２ＨｚＯ０，１５＋９、Ｋ１０．１５
■、　ωＨ４）　ｓＭｏ７０□、、４Ｈ２００，１５〜
とした以外は実施例１と同様にして１０日間培養した。

菌体量は、６１０　ｎｍの吸光度として、２２であり、
培養上澄液中のＰＱＱ蓄積量は１４６■／ｊであった。

実施例　÷ 菌株として、メチロバチルス　グリコゲネスＴ　Ｋ　０
１９３　（＝Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｍｅｔｈｙｌ
ｏｎｉｃａ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｍｅｔｈａｎ
ｏｌｉｓ　　ＢＮＫ−８４−微工研菌寄第２２４７号）
　　（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｓ　３６ｔｐ　、　５０２〜５１
１）を使用した以外は、実施例２と同様にして、４日間
培養した。

菌体量は６１０　ｎｍの吸光度として２８であり、培養
上澄液中のＰＱＱ蓄積量は４１０ダ／ｌでありだ。

〔発明の効果〕

本発明により、ＰＱＱの生産性が大福に増大し、ＰＱＱ
を工業的に効率よく生産することが可能となる。

特許出願人　　三菱瓦斯化学株式会社代表者長野和吉

Claims

【特許請求の範囲】

メタノールの資化性を有し、かつ、ピロロキノリンキノ
ンを生産する能力を有する細菌を用いて、炭素源として
少なくともメタノールを含有する培地で培養してピロロ
キノリンキノンを生産するに際し、培養液の鉄化合物の
濃度を鉄として０．３〜２ｐｐｍに制御して、培養液中
にピロロキノリンキノンを蓄積せしめることを特徴とす
るピロロキノリンキノンの製造方法。