WO2011102387A1 - 還元型ピロロキノリンキノンの製造方法 - Google Patents

還元型ピロロキノリンキノンの製造方法 Download PDF

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WO2011102387A1
WO2011102387A1 PCT/JP2011/053283 JP2011053283W WO2011102387A1 WO 2011102387 A1 WO2011102387 A1 WO 2011102387A1 JP 2011053283 W JP2011053283 W JP 2011053283W WO 2011102387 A1 WO2011102387 A1 WO 2011102387A1
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ascorbic acid
pyrroloquinoline quinone
solution
reduced
salt
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PCT/JP2011/053283
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French (fr)
Inventor
池本　一人
中野　昌彦
純一 枝廣
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三菱瓦斯化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a production method of reduced pyrroloquinoline quinone and a reduced pyrroloquinoline quinone obtained by the production method.
  • the present invention also relates to a method for stabilizing reduced pyrroloquinoline quinone.
  • PQQ Pyrroloquinoline quinone
  • Non-patent Document 1 Pyrroloquinoline quinone
  • PQQ is present not only in bacteria but also in eukaryotic fungi and yeast, and plays an important role as a coenzyme.
  • These PQQs can be produced by an organic chemical synthesis method (Non-patent Document 2), a fermentation method (Patent Document 1), or the like.
  • Reduced PQQ has been reported to have much higher antioxidant activity than conventional PQQ (Non-patent Document 3), nutritional functional food, food for specified health use, nutritional supplement, nutritional supplement, beverage, feed, It is a compound useful as an animal drug, cosmetics, pharmaceutical, therapeutic drug, prophylactic drug and the like.
  • Reduced PQQ can be obtained by reducing oxidized PQQ using a common reducing agent such as sodium borohydride and sodium hyposulfite, hydrogen reduction with a platinum catalyst, and reduction with glutathione.
  • a common reducing agent such as sodium borohydride and sodium hyposulfite
  • hydrogen reduction with a platinum catalyst has been reported (Non-Patent Documents 3, 4, and 5).
  • a general reducing agent is highly likely to be toxic to the living body, and a process for removing it is necessary.
  • ascorbic acid is well known as a substance having an action of reducing a substance. Therefore, a combination of PQQ and ascorbic acid may be proposed as a composition having antioxidative activity.
  • the reduced form of PQQ has higher antioxidant activity than ascorbic acid. Reduction with ascorbic acid has been considered difficult.
  • reduced PQQ is easily oxidized to oxidized PQQ by molecular oxygen. Therefore, it is necessary to take measures for the storage method.
  • the present inventors have found that reduced pyrroloquinoline quinone can be obtained in a high yield from a solution having a pH of 3.5 or less obtained by mixing a pyrroloquinoline quinone solution having a pH of 4 or less and an ascorbic acid solution.
  • the present invention is based on this finding.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing reduced pyrroloquinoline quinone which is highly safe, simple and low in cost, and a reduced pyrroloquinoline quinone obtained by the production method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for stabilizing reduced pyrroloquinoline quinone.
  • a method for producing reduced pyrroloquinoline quinone wherein a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof adjusted to pH 4 or less and an ascorbic acid analog are mixed to have a pH of 3 containing reduced pyrroloquinoline quinone.
  • a production method comprising a step of obtaining a solution of 5 or less.
  • reduced pyrroloquinoline quinone can be produced with high safety, convenience and low cost, and no expensive equipment is required for producing reduced pyrroloquinoline quinone. It is advantageous.
  • the present invention is also advantageous in that reduced pyrroloquinoline quinone can be stably stored.
  • reduced pyrroloquinoline quinone can be produced by mixing a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof having a pH of 4 or less with an ascorbic acid analog to obtain a solution having a pH of 3.5 or less. it can.
  • reduced pyrroloquinoline quinone means a compound represented by the following formula (1).
  • the pyrroloquinoline quinone (free form) used in the present invention means a compound represented by the formula (2).
  • the pyrroloquinoline quinone used in the present invention can be used as a pyrroloquinoline quinone (free form) or a salt of pyrroloquinoline quinone.
  • Examples of the “pyrroloquinoline quinone salt” used in the present invention include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and ammonium salts of pyrroloquinoline quinone, with alkali metal salts being preferred.
  • the pyrroloquinoline quinone used in the present invention is not particularly limited as long as it is a free form or an alkali metal salt. It is particularly easy to use a free body, a dinatrim body, and a dipotassium body, which are easily available.
  • Examples of the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used in the present invention include salts of sodium, potassium, lithium, cesium, rubidium and the like. Preferably, a sodium salt and a potassium salt are more preferable in terms of easy availability.
  • the substitution number of the salt in the alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone is 1 to 3, and any of a monoalkali metal salt, a dialkali metal salt, and a trialkali metal salt is preferable, but a dialkali metal salt is preferable.
  • disodium salt and dipotassium salt are particularly preferable.
  • pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention a commercially available one can be obtained, and it can be produced by a known method.
  • the pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention can be used as a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof.
  • the solvent used is not particularly limited as long as the reaction proceeds, and pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be used by dissolving in a solvent such as water, alcohol, dimethyl sulfoxide, etc. Water (aqueous solution) is preferable because it does not cause a problem.
  • a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be prepared to be, for example, 0.001 to 30 g / l, preferably 0.01 to 15 g / l, more preferably 0.1 to 5 g. / L.
  • the pH of the solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof can be adjusted to 4 or less in order to obtain reduced PQQ efficiently. Moreover, in order to raise the solubility of pyrroloquinoline quinone, it can be set to 1 or more.
  • the pH of the solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3.5, still more preferably 2 to 3.5, and still more preferably. 2 to 2.5.
  • an acidic substance for example, hydrochloric acid or the like
  • an alkaline substance for example, sodium hydroxide or the like
  • the ascorbic acid analog is not particularly limited, and for example, ascorbic acid, rhamno-ascorbic acid, arabo-ascorbic acid, gluco-ascorbic acid, fuco-ascorbic acid, glucohepto-ascorbic acid, xyllo-ascorbic acid, galacto-ascorbine
  • examples thereof include those similar to ascorbic acid such as acid, gulo-ascorbic acid, allo-ascorbic acid, erythro-ascorbic acid and 6-desoxyascorbic acid. , Calcium salt, etc.).
  • L form eg. L-ascorbic acid, sodium L-ascorbate, etc.
  • D form eg. D-arabo-ascorbic acid, D-arabo-sodium ascorbate, etc.
  • racemate There may be.
  • examples include L-ascorbic acid, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid stearate, D-arabo-ascorbic acid and the like.
  • any of the above ascorbic acid analogs can be suitably used, but considering the ease of separation from the produced reduced pyrroloquinoline quinone, the above ascorbic acid analogs Of these, water-soluble ones are particularly preferred. Most preferred are free forms such as L-ascorbic acid and D-arabo-ascorbic acid from the viewpoints of availability and price.
  • ascorbic acid analog used in the present invention a commercially available product can be obtained, or can be produced by a known method.
  • the ascorbic acid analog used in the present invention can be used as an ascorbic acid analog or as a solution of an ascorbic acid analog.
  • the ascorbic acid analog can be used by dissolving it in a solvent such as water, alcohol or dimethyl sulfoxide, but it is preferably used as an aqueous solution of the ascorbic acid analog.
  • the solution of ascorbic acid analog can be prepared to be, for example, 0.1 to 500 g / l, and preferably 0.5 to 100 g / l.
  • the step of “mixing a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof with an ascorbic acid analog to obtain a solution having a pH of 3.5 or less comprising reduced pyrroloquinoline quinone” comprises pyrroloquinoline It is only necessary to obtain reduced pyrroloquinoline quinone by reacting quinone or a salt thereof with an ascorbic acid analog in a solvent and reducing pyrroloquinoline quinone.
  • a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and ascorbic acid can also be performed by mixing with a solution of an analog, or by adding an ascorbic acid analog to a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof.
  • the above process also includes an aspect in which a solution comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and an ascorbic acid analog is orally administered to a mammal and reacted in vivo (for example, oral cavity, stomach, intestine). .
  • mixing can be performed by adding one mixing object to the other mixing object, or by adding the mixing object to another container.
  • an additive can be added to an addition target at a time or can be gradually added.
  • the molar ratio of ascorbic acid analog to pyrroloquinoline quinone or its salt is thought to react with equimolar amounts of pyrroloquinoline quinone or its salt and ascorbic acid analog, and should be determined according to the desired reductant content. Can do. Practically, it is preferable to use 0.5 to 1000 times mole of ascorbic acid analog relative to PQQ. In the case of isolating reduced PQQ, 0.9 to 10 times is preferable. When the content is lower than this range, the expected effect cannot be obtained because the content of the reductant is low. There is no problem if it is added excessively, but if it is too much, the cost becomes high.
  • the molar ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to an ascorbic acid analog is 1: 0.5 to 1000, preferably 1: 1.5 to 1000, more preferably in a solvent.
  • the ratio may be 1: 1.5 to 100, and more preferably 1: 1.5 to 10.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but can be, for example, ⁇ 10 ° C. to 180 ° C., and preferably 0 ° C. to 100 ° C.
  • the reaction proceeds sufficiently even at room temperature.
  • the reaction time is not particularly limited, but can be, for example, 0.2 to 48 hours, and preferably 0.5 to 24 hours.
  • Any solvent may be used as long as the reaction proceeds, but an aqueous solution that does not cause a big problem even if it remains in the product is preferable. Since the reaction is difficult to proceed under alkaline conditions, an aqueous solution having a pH of 5 or lower is particularly preferable, and a pH of 4 or lower is more preferable. In order to adjust pH, there is no particular problem in adjusting by adding acid or alkali. What is necessary is just to use it as needed.
  • the reaction is not particularly limited, but it is preferably performed in an environment with little oxygen.
  • the above operation can be performed in an inert gas such as nitrogen or argon according to a conventional method.
  • Reduction of the oxidation reaction can be achieved by substitution with an inert gas, reduced pressure, boiling, or a combination thereof. It is preferable to use at least substitution with an inert gas, that is, an inert gas atmosphere.
  • the inert gas include nitrogen gas, helium gas, argon gas, hydrogen gas, carbon dioxide gas, and the like, preferably nitrogen gas.
  • the pH of a solution (reaction solution) obtained by reacting a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof with an ascorbic acid analog is the pH of a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof or ascorbic acid.
  • the amount of the analog can be adjusted to pH 3.5 or lower, and the pH can be adjusted to 3 through a step of adjusting pH using an acidic substance (for example, hydrochloric acid) or an alkaline substance (for example, sodium hydroxide). .5 or less.
  • the pH of the obtained solution can be 3.5 or less, but is preferably 3 or less, more preferably 2.8 or less, and even more preferably 2.6 or less.
  • the production method according to the present invention can be carried out as follows.
  • Pyrroloquinoline quinone is prepared at an aqueous solution concentration of 0.01 to 15 g / L. This concentration is described as the concentration at which dissolution occurs, but if it is higher than this, the reaction tends to occur in a suspended state.
  • the reaction is completed by a simple operation of mixing ascorbic acid powder or solution here.
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 100 ° C., and the reaction time depends on the temperature, but about 0.2 to 48 hours is easy to use.
  • an acid or a base may be added.
  • the obtained precipitate can be reduced pyrroloquinoline quinone.
  • precipitate means a solid phase (solid) appearing from a liquid phase (solution).
  • Precipitate can be separated from the solution.
  • a precipitate (deposited reductant) can be obtained by filtration, centrifugation, and decantation. Further, it can be washed with water or alcohol. It is also possible to obtain a solid by drying under reduced pressure. Or it is also possible to provide it as it is without performing such separation operation.
  • Recrystallization may be performed by an operation of dissolving in a good solvent such as dimethyl sulfoxide to lower the solubility, specifically lowering the temperature, adding a poor solvent, or concentrating. Further, it can be purified by column chromatography.
  • a good solvent such as dimethyl sulfoxide
  • the composition contains 0.5 to 1000 times ascorbic acid analog to pyrroloquinoline quinone or a salt thereof.
  • it can be generated in a container such as a cup immediately before edible, or can be generated in the oral cavity, stomach, or intestine of a living body.
  • compositions containing 0.5 to 1000-fold moles of ascorbic acid analog with respect to pyrroloquinoline quinone or a salt thereof is prepared and used for the above purpose is consistent with the object of the present invention. To do. Whether the composition is in the form of a solid or a solution, it reacts in a solution state when administered orally.
  • a method for producing reduced pyrroloquinoline quinone wherein a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof having a pH of 2 to 3.5, an ascorbic acid analog or a solution thereof And a process for obtaining a solution having a pH of 3 or less comprising reduced pyrroloquinoline quinone.
  • a method for producing reduced pyrroloquinoline quinone comprising a solution of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof having a pH of 2 to 2.5, an ascorbic acid analogue or
  • This is a production method comprising a step of mixing a solution to obtain a solution having a pH of 2.6 or less comprising reduced pyrroloquinoline quinone.
  • the composition containing 0.5 to 1000 moles of ascorbic acid with respect to reduced pyrroloquinoline quinone can suppress oxidation, can be stably stored without purification, and is provided as it is can do. This is one of the excellent points of the production method of the present invention.
  • reduced pyrroloquinoline quinone in order to stably store reduced pyrroloquinoline quinone, reduced pyrroloquinoline quinone can be provided as a solution comprising an ascorbic acid analog.
  • compositions by adding an ascorbic acid analog after the separation operation.
  • This composition can be provided in the form of a solid, a suspension, or a solution, and a composition that is suspended in water can be easily provided from the reaction conditions.
  • a method for stabilizing reduced pyrroloquinoline quinone is provided.
  • the stabilization method according to the present invention is characterized in that reduced pyrroloquinoline quinone is protected from oxidation by molecular oxygen.
  • the stabilization method according to the present invention can stabilize reduced pyrroloquinoline quinone by allowing reduced pyrroloquinoline quinone or a salt thereof together with an ascorbic acid analog in a solvent.
  • the molar ratio of reduced pyrroloquinoline quinone and ascorbic acid analog can be 1: 0.5 to 1000, preferably 1: 1 to 500 in a solvent.
  • the dosage form of reduced pyrroloquinoline quinone obtained in the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended use.
  • the composition for oral consumption of the present invention can be used as food, functional food, pharmaceuticals or quasi drugs for humans or animals.
  • the functional food here means foods taken for the purpose of maintaining nutrition or supplementing nutrition, such as health foods, nutritional supplements, functional nutritional foods, and nutrition insurance foods. Specific forms include, but are not limited to, capsules, tablets, chewable tablets, drinks and the like.
  • additives used in food such as sweeteners, coloring agents, preservatives, thickening stabilizers, antioxidants, coloring agents, bleaching agents, antibacterial and antifungal agents, gum bases Bitterings, enzymes, brighteners, acidulants, seasonings, emulsifiers, fortifiers, manufacturing agents, fragrances, spice extracts and the like can be used.
  • it can also be added to ordinary foods such as miso, soy sauce, instant miso soup, ramen, fried noodles, curry, corn soup, merbaudofu, marvo eggplant, pasta sauce, pudding, cake, bread and the like.
  • composition for producing reduced PQQ is provided.
  • composition for producing reduced PQQ that is resistant to oxidation and can be stably stored is provided.
  • a method for producing reduced pyrroloquinoline quinone comprising mixing pyrroloquinoline quinone and ascorbic acid in a solvent.
  • the production method according to (1) wherein the solvent is water.
  • NMR measurement was performed using a JEOL 500 MHz NMR, JNM-ECA500 spectrum meter, and 13 C-NMR was measured at room temperature.
  • UV measurement was performed using a HITACHI U-2000 Spectrophotometer.
  • Example 1 The reagent pyrroloquinoline quinone disodium used was a reagent (trade name: Bio PQQ) manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company. L-ascorbic acid manufactured by Wako Pure Chemicals was used.
  • Pyrroloquinolinequinone disodium (1.53 g) was dissolved in water (500 g) to a concentration of 0.01 mol / l.
  • L-ascorbic acid was dissolved in 1001 g of water to give a concentration of 0.2 mol / l.
  • the obtained solid was washed with a degassed aqueous hydrochloric acid solution and dried by a nitrogen stream. Heavy dimethyl sulfoxide was added thereto, and it was placed in an NMR tube under a nitrogen stream, and 13 C-NMR was measured at room temperature.
  • Example 2 20 g of pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration (pH 3.5) and L-ascorbic acid solution 0.2 mol / l concentration 10 g were mixed (pH 3).
  • L-ascorbic acid has a molar amount 10 times that of pyrroloquinolinequinone 1.
  • the two solutions were mixed and stirred at room temperature. The color changed immediately and a solid precipitated. After standing at room temperature overnight, the pH was measured with a pH test paper to be 3. The solid was taken out by centrifugation (1000 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure to obtain 0.073 g of a reduced water-containing solid containing no oxidant. Analysis of the UV spectrum indicated a reduced state.
  • Example 3 20 g of pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration (pH 3.5) and L-ascorbic acid solution 0.2 mol / l concentration 5 g were mixed (pH 3).
  • L-ascorbic acid is 5 times the molar amount of pyrroloquinoline quinone 1.
  • the two solutions were mixed and stirred at room temperature. The color changed immediately and a solid precipitated. After standing at room temperature overnight, the pH was measured with a pH test paper to be 3. The solid was removed by centrifugation (1000 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure to obtain 0.044 g of a reduced solid.
  • the isolated crude yield was 66%.
  • Example 4 20 g of pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.001 mol / l concentration (pH 3.5) and L-ascorbic acid solution 0.2 mol / l concentration 10 g were mixed (pH 2).
  • L-ascorbic acid has a molar amount 100 times that of pyrroloquinolinequinone 1.
  • the two solutions were mixed and stirred at room temperature. The color changed immediately and a solid precipitated. After being allowed to stand overnight at room temperature, the pH was 2 when measured with a pH test paper. The solid was removed by centrifugation (1000 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure to obtain 0.006 g of a reduced solid.
  • Example 5 A pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration (pH 3.5) 0.5 g and an L-ascorbate sodium solution 0.5 mol / l concentration 0.5 g were mixed. The pH at this time was 6-7. L-ascorbic acid is 50 times the molar amount of pyrroloquinolinequinone 1. The two solutions were mixed at room temperature, and the mixed solution was added to 10 ml of artificial gastric juice (pH 1.2). When left at room temperature overnight, a reduced solid precipitated. Reaction becomes easy to advance by making it into acidic conditions. It is also considered that it is reduced in vivo.
  • Example 6 1 g of pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration (pH 3.5) and L-ascorbic acid solution 0.011 mol / l concentration 1 g were mixed (pH 2.5). The molar ratio at this time is 1: 1.1. By reacting at 30 ° C. for 8 days (pH 2.5), 82% of PQQ reacted to obtain a reduced product-containing product.
  • Comparative Example 2 A pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration 0.5 g and a sodium L-ascorbate solution 0.5 mol / l concentration 0.5 g were mixed at room temperature. The pH at this time was 6-7. L-ascorbic acid is 50 times the molar amount of pyrroloquinolinequinone 1. When the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 days, there was no change in the solution (pH 7), and no reduced product was obtained.
  • L-ascorbic acid is 20 times the molar amount of pyrroloquinoline quinone 1.
  • the pH was 2 as measured with a pH test paper. This mixed solution was reacted at room temperature overnight (pH 2). After the reaction, a reductant solid was precipitated. In this state, L-ascorbic acid is present in a 15-fold molar amount even when the amount used in the reduction reaction and the amount oxidized in air are taken into consideration. Then, when it preserve
  • Example 3 The reductant solid obtained in Example 6 was removed by centrifugation, and the supernatant was discarded and washed with water. This treatment removed L-ascorbic acid. Sodium hydroxide aqueous solution was added here so that it might become pH7. All changed to an oxidant after 30 minutes.
  • Example 8 1 g of pyrroloquinoline quinone disodium solution 0.01 mol / l concentration (pH 3.5) and L-ascorbic acid solution 0.014 mol / l concentration 1 g were mixed. When 1 g of this mixed solution was put into a 15 ml container and brought into contact with air, 14% of oxidized PQQ was contained (pH 3). When this oxidized type-containing reduced PQQ was allowed to stand at 30 ° C. for 1 week, it contained 18% oxidized PQQ.
  • Example 9 Pyrroloquinoline quinone disodium was dissolved in water and adjusted to 2 g / l. The pH of the aqueous solution was adjusted to pH 1 or less using hydrochloric acid and NaOH. L-ascorbic acid was dissolved in water and adjusted to 4 g / l.
  • Example 10 Pyrroloquinoline quinone disodium was dissolved in water and adjusted to 2 g / l. The pH of the aqueous solution was adjusted to pH 2.2 using hydrochloric acid and NaOH. L-ascorbic acid was dissolved in water and adjusted to 4 g / l.
  • the above two aqueous solutions were mixed in 0.5 ml containers in a 1.5 m container and reacted at room temperature for 24 hours. The pH after the reaction was 2.6. Thereafter, the obtained mixture was centrifuged (1000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was discarded to obtain a solid. The obtained solid was washed with about 9% hydrochloric acid, dissolved in dimethyl sulfoxide, and the reductant yield was calculated by UV measurement and found to be 100%.
  • Example 11 Pyrroloquinoline quinone disodium was dissolved in water and adjusted to 2 g / l. The pH of the aqueous solution was adjusted to pH 2.6 using hydrochloric acid and NaOH. L-ascorbic acid was dissolved in water and adjusted to 4 g / l.
  • the above two aqueous solutions were mixed in 0.5 ml containers in a 1.5 m container and reacted at room temperature for 24 hours.
  • the pH after the reaction was 3.
  • the obtained mixture was centrifuged (1000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was discarded to obtain a solid.
  • the obtained solid was washed with about 9% hydrochloric acid, dissolved in dimethyl sulfoxide, and the reductant yield was calculated by UV measurement and found to be 66%.
  • Example 12 Pyrroloquinoline quinone disodium was dissolved in water and adjusted to 2 g / l. The pH of the aqueous solution was adjusted to pH 3.5 using hydrochloric acid and NaOH. L-ascorbic acid was dissolved in water and adjusted to 4 g / l.
  • the above two aqueous solutions were mixed in 0.5 ml containers in a 1.5 m container and reacted at room temperature for 24 hours.
  • the pH after the reaction was 3.5.
  • 100 ⁇ l of concentrated hydrochloric acid was added to adjust the pH to 1.
  • the obtained mixture was centrifuged (1000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was discarded to obtain a solid.
  • the obtained solid was washed with about 9% hydrochloric acid, dissolved in dimethyl sulfoxide, and the reductant yield was calculated by UV measurement and found to be 54%.
  • the above two aqueous solutions were mixed in 0.5 ml containers in a 1.5 m container and reacted at room temperature for 24 hours.
  • the pH after the reaction was 3.5.
  • the obtained mixture was centrifuged (1000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was discarded to obtain a solid.
  • the obtained solid was washed with about 9% hydrochloric acid, dissolved in dimethyl sulfoxide, and the reductant yield was calculated by UV measurement and found to be 1%.
  • the above two aqueous solutions were mixed in 0.5 ml containers in a 1.5 m container and reacted at room temperature for 24 hours.
  • the pH after the reaction was 3.5.
  • the obtained mixture was centrifuged (1000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was discarded to obtain a solid.
  • the obtained solid was washed with about 9% hydrochloric acid, dissolved in dimethyl sulfoxide, and the yield of the reduced product was calculated by UV measurement.

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  • Organic Chemistry (AREA)
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Abstract

　本発明は、酸化型ピロロキノリンキノンから高価な設備を必要とせず簡便に還元型ピロロキノリンキノンを製造する方法、および還元型ピロロキノリンキノンを安定に保存することができる方法の提供を目的とする。本発明によれば、ピロロキノリンキノンとアスコルビン酸を溶媒中で混合することにより、工業的規模での生産に適した方法で、高品質の還元型ピロロキノリンキノンを簡便且つ効率的に得ることができる。

Description

還元型ピロロキノリンキノンの製造方法 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１０年２月１６日に提出された日本出願である特願２０１０－３１６３７の利益を享受する。これらの先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、還元型ピロロキノリンキノンの製造方法および該製造方法により得られる還元型ピロロキノリンキノンに関する。本発明は、また、還元型ピロロキノリンキノンの安定化方法に関する。
　ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」と表すことがある）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて注目を集めている（非特許文献１）。さらには、ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについては、近年までに、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ－作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ－ゼＩ阻害作用－制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。このＰＱＱ類は、有機化学的合成法（非特許文献２）および発酵法（特許文献１）などにより製造することが可能である。
　還元型ＰＱＱは、従来のＰＱＱよりも抗酸化活性が非常に高いことが報告されており（非特許文献３）、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、飲料、飼料、動物薬、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬等として有用な化合物である。還元型ＰＱＱは、酸化型ＰＱＱを、水素化ホウ素ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム等の一般的な還元剤を使用して還元すること、白金触媒により水素還元すること、グルタチオンにより還元することで得られることが報告されている（非特許文献３、４、５）。しかし、一般的な還元剤は生体に毒性を示す可能性が高く、それを除去する工程が必要である。また、触媒を使用する場合も、漏えいしやすく、また、爆発しやすい水素を使用するために特別な施設が必要になってくる。グルタチオンによる還元は安全性も高く、使用しやすいがグルタチオンの価格が高い点が問題となる。よって安全性が高く、簡便であり、かつ、低コストである方法が求められている。
　ところで、物質を還元する作用を有する物質としてアスコルビン酸はよく知られている。そのため、抗酸化活性を有する組成物としてＰＱＱとアスコルビン酸の組み合わせが提案されることがあるが、非特許文献３に記載されているようにＰＱＱの還元体はアスコルビン酸より抗酸化活性が高いため、アスコルビン酸による還元は困難であると考えられてきた。さらに還元型ＰＱＱは、分子酸素によって酸化型ＰＱＱに酸化されやすい。そのため、保存方法についても対策が必要である。
特開平１－２１８５９７号公報
nature,vol.422, 24, April,3003, p832 JACS、第103巻、第5599～5600頁（1981） J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 450-456 Bull. Chem. Soc. Jpn, 59, 1911-1914 (1986) Eur.J. Biochem.118, 395-399(1981)
　本発明者らは、ｐＨ４以下のピロロキノリンキノン溶液と、アスコルビン酸溶液とを混合して得られたｐＨ３．５以下の溶液から還元型ピロロキノリンキノンを高収率で得られることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　本発明は、安全性が高く、簡便で、低コストである還元型ピロロキノリンキノンの製造方法と、該製造方法により得られた還元型ピロロキノリンキノンの提供を目的とする。本発明は、また、還元型ピロロキノリンキノンの安定化方法の提供を目的とする。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）還元型ピロロキノリンキノンの製造方法であって、ｐＨ４以下に調整されたピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とアスコルビン酸類似体とを混合させて、還元型ピロロキノリンキノンを含んでなるｐＨ３．５以下の溶液を得る工程を含んでなる、製造方法。
（２）ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液が、水溶液である、（１）に記載の製造方法。
（３）ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨが、２～３．５である、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体のモル比が、１：０．５～１０００である、（１）に記載の製造方法。
（５）アスコルビン酸類似体が、アスコルビン酸、ｒｈａｍｎｏ－アスコルビン酸、ａｒａｂｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏ－アスコルビン酸、ｆｕｃｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏ－アスコルビン酸、ｘｙｌｏ－アスコルビン酸、ｇａｌａｃｔｏ－アスコルビン酸、ｇｕｌｏ－アスコルビン酸、ａｌｌｏ－アスコルビン酸、ｅｒｙｔｈｒｏ－アスコルビン酸、６－デスオキシアスコルビン酸、並びに、これらのエステル体および塩からなる群から選択される、（１）に記載の製造方法。
（６）溶液から還元型ピロロキノリンキノンを分離する工程をさらに含んでなる、（１）に記載の製造方法。
（７）（１）～（６）に記載の製造方法により製造される還元型ピロロキノリンキノン。
（８）アスコルビン酸類似体を含んでなる溶液として提供される、（７）に記載の還元型ピロロキノリンキノン。
（９）還元型ピロロキノリンキノンの安定化方法であって、還元型ピロロキノリンキノンまたはその塩を、アスコルビン酸類似体とともに溶媒中に存在させることを含んでなる、方法。
　本発明によれば、安全性が高く、簡便、かつ低コストで還元型ピロロキノリンキノンを製造することができ、また、還元型ピロロキノリンキノンの製造の際に高価な設備を必要としない点で有利である。本発明によれば、また、還元型ピロロキノリンキノンを安定して保存できる点で有利である。
　本発明によれば、ｐＨ４以下のピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液と、アスコルビン酸類似体とを混合させて、ｐＨ３．５以下の溶液を得ることにより、還元型ピロロキノリンキノンを製造することができる。
　本願明細書において、「還元型ピロロキノリンキノン」とは、下記式（１）で表される化合物を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明において用いられるピロロキノリンキノン（フリー体）は、式（２）で表される化合物を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明によれば、ピロロキノリンキノンをアスコルビン酸類似体で還元して還元型ＰＱＱを製造することが可能である。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、ピロロキノリンキノン（フリー体）として使用することもできるし、ピロロキノリンキノンの塩として使用することもできる。
　本発明において用いられる「ピロロキノリンキノンの塩」としてはピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩が挙げられるが、好ましくは、アルカリ金属塩である。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、フリー体、アルカリ金属塩であればよく特に限定されない。特に入手しやすい、フリー体、ジナトリム体、ジカリウム体が使用しやすい。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。好ましくは、入手しやすい点で、ナトリウム塩およびカリウム塩がより好ましい。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩における塩の置換数は、１～３であり、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくは、ジナトリウム塩およびジカリウム塩である。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液として使用することができる。用いられる溶媒は、反応が進行すれば特に限定されず、ピロロキノリンキノンまたはその塩を、水、アルコール、ジメチルスルホキシド等の溶媒に溶解して使用することができるが、製品に残留しても大きな問題とならないという点から、水（水溶液）が好ましい。
　ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液は、例えば、０．００１～３０ｇ／ｌとなるように調製することができるが、好ましくは、０．０１～１５ｇ／ｌ、より好ましくは、０．１～５ｇ／ｌである。
　ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨは、還元型ＰＱＱを効率よく得るために４以下に調整することができる。また、ピロロキノリンキノンの溶解度を上げるために１以上とすることができる。ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨは、好ましくは、１～４であり、より好ましくは、１～３．５であり、さらに好ましくは、２～３．５であり、さらにより好ましくは、２～２．５である。ｐＨを調整するために、酸性物質（例えば、塩酸等）やアルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム等）を使用することができる。
　アスコルビン酸類似体としては、特に制限されず、例えば、アスコルビン酸、ｒｈａｍｎｏ－アスコルビン酸、ａｒａｂｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏ－アスコルビン酸、ｆｕｃｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏ－アスコルビン酸、ｘｙｌｏ－アスコルビン酸、ｇａｌａｃｔｏ－アスコルビン酸、ｇｕｌｏ－アスコルビン酸、ａｌｌｏ－アスコルビン酸、ｅｒｙｔｈｒｏ－アスコルビン酸、６－デスオキシアスコルビン酸等のアスコルビン酸に類するものが挙げられ、これらのエステル体や塩（例えば、パルミテート、ステアレート、ナトリウム塩、カルシウム塩等）であってもよい。さらに、これらは、Ｌ体（例えば、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム等）、Ｄ体（例えば、Ｄ－ａｒａｂｏ－アスコルビン酸、Ｄ－ａｒａｂｏ－アスコルビン酸ナトリウム等）、あるいは、ラセミ体であってもよい。
　より具体的には、例えば、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、Ｄ－ａｒａｂｏ－アスコルビン酸等を挙げることができる。
　還元型ピロロキノリンキノンの製造において、上記アスコルビン酸類似体は、いずれも好適に使用できるが、生成した還元型ピロロキノリンキノンとの分離のしやすさ等を考慮すると、上記のアスコルビン酸類似体のうち、特に水溶性のものが好適に用いられる。最も好ましくは、入手容易性、価格等の観点から、Ｌ－アスコルビン酸、Ｄ－ａｒａｂｏ－アスコルビン酸等のフリー体である。
　本発明において用いられるアスコルビン酸類似体は、市販されているものを入手することもできるし、公知の方法により製造することもできる。
　本発明において用いられるアスコルビン酸類似体は、アスコルビン酸類似体として使用することもできるし、アスコルビン酸類似体の溶液として使用することもできる。アスコルビン酸類似体を溶液として使用する場合は、水、アルコール、ジメチルスルホキシド等の溶媒に溶解して使用することができるが、アスコルビン酸類似体の水溶液として使用することが好ましい。
　アスコルビン酸類似体の溶液は、例えば、０．１～５００ｇ／ｌとなるように調製することができるが、好ましくは、０．５～１００ｇ／ｌである。
　本発明による製造方法において、「ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とアスコルビン酸類似体とを混合させて、還元型ピロロキノリンキノンを含んでなるｐＨ３．５以下の溶液を得る」工程は、ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体とを溶媒中で反応させ、ピロロキノリンキノンを還元することにより、還元型ピロロキノリンキノン得ることができればよく、例えば、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とアスコルビン酸類似体の溶液とを混合して行うこともできるし、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液にアスコルビン酸類似体を添加して行うこともできる。
　上記工程には、また、ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体とを含んでなる溶液を哺乳類等に経口投与し、生体内（例えば、口腔、胃、腸）で反応させる態様も含まれる。
　本願明細書において、「混合」については、一方の混合対象物を他方の混合対象物に添加して行うこともできるし、混合対象物を別の容器に添加して行うこともできる。
　本願明細書において、「添加」については、添加物を添加対象に一時に添加することもできるし、徐々に添加することもできる。
　反応においてピロロキノリンキノンまたはその塩に対しアスコルビン酸類似体のモル比は、ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体は等モルで反応すると考えられ、欲しい還元体の含有量に合わせて決めることができる。実際的にはＰＱＱに対しアスコルビン酸類似体０．５から１０００倍モル使用することが好ましい。還元型ＰＱＱを単離する場合は０．９から１０倍が好ましい。この範囲より低い場合は還元体の含有量が低いため、期待した効果を出すことができない。過剰に加えても問題がないが、多すぎるとコストが高くなる。
　本発明による製造方法において、ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体のモル比は、溶媒中で、１：０．５～１０００、好ましくは、１：１．５～１０００、より好ましくは、１：１．５～１００、さらにより好ましくは、１：１．５～１０とすることができる。
　本発明による製造方法において、反応温度は、特に制限がないが、例えば、－１０℃から１８０℃とすることができ、好ましくは０℃から１００℃である。室温でも十分に反応は進行する。より反応速度を上げたい場合、温度を上げるのが好ましく、溶解度の面では高い温度が溶解しやすいため、生産性を高めるためには、５０℃以上にするのが好ましい。
　本発明による製造方法において、反応時間は、特に制限がないが、例えば、０．２から４８時間とすることができ、好ましくは、０．５～２４時間とすることができる。
　反応は進行すれば特にどの溶媒を使用してもかまわないが、製品に残留しても大きな問題とならない水溶液が好ましい。アルカリ条件では反応が進行しにくいため、特にｐＨ５以下の水溶液で、より好ましくは４以下である。ｐＨを調整するために酸やアルカリを入れて調整するのは特に問題がない。必要に応じて使用すればよい。
　本発明による製造方法において、反応は、特に制限がないが、酸素の存在が少ない環境で行うのが好ましい。空気中の酸素により還元型ＰＱＱが酸化型に変わるのを防ぐために、上記の操作を、定法に従って、窒素、アルゴン等の不活性ガス中で行うことができる。不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより酸化反応の低減を達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
　本発明による製造方法において、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とアスコルビン酸類似体とを反応させて得られた溶液（反応液）のｐＨは、ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨやアスコルビン酸類似体の量を調整してｐＨ３．５以下とすることもできるし、酸性物質（例えば、塩酸等）やアルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム等）を使用してｐＨを調整する工程を経てｐＨ３．５以下とすることもできる。
　得られた溶液のｐＨは、３．５以下とすることができるが、好ましくは、３以下であり、より好ましくは、２．８以下であり、さらにより好ましくは、２．６以下である。
　本発明による製造方法は、より具体的には、下記のように実施することができる。
　ピロロキノリンキノンは０．０１ｇ/Lから１５ｇ/Lの水溶液濃度で用意する。この濃度は溶解をする濃度として記載しているが、これより高い場合は縣濁状態での反応になりやすい。ここにアスコルビン酸類を粉末もしくは溶液を混合する単純な作業で反応は終了する。反応温度は通常０℃から１００℃で、反応時間は温度に依存するが０．２から４８時間程度が使用しやすい。
　この時、ｐＨを調整するのであれば酸や塩基を添加すればよい。
　反応を経て、得られた溶液には、最終的には還元体が析出されている。得られた析出物を還元型ピロロキノリンキノンとすることができる。
　本願明細書において「析出物」とは、液相（溶液）から表れた固相（固体）を意味する。
　析出物は溶液から分離することができる。析出物（析出した還元体）は、ろ過、遠心分離、デカンテーションで得ることができる。さらにこれを水洗やアルコールで洗うことも可能である。そして減圧乾燥で乾燥して固体を得ることも可能である。もしくはこういった分離操作を行わず、そのままで提供することも可能である。
　さらに純粋な物質が要求される場合には再結晶を行うことで純度を上げることができる。ジメチルスルホキシド等の良溶媒に溶解させ、溶解度を下げる操作、具体的には温度を下げる、貧溶媒を加える、濃縮を行う操作で再結晶を行えばよい。さらにカラムクロマトグラフィーで精製することも可能である。
　本発明の還元型ピロロキノリンキノンの製造方法は反応が室温付近での十分に進行することから、ピロロキノリンキノンまたはその塩に対しアスコルビン酸類似体を０．５から１０００倍モルを含む組成物として提供することで、食用の直前に、コップ等の容器内で発生させたり、生体の口腔、胃、腸で発生させたりすることが可能である。
　室温でも反応が進行するためにピロロキノリンキノンまたはその塩に対しアスコルビン酸類似体を０．５から１０００倍モルを含む組成物を作成し、上記の目的に使用するのは本発明の目的と合致する。この組成物は固体、溶液のどちらの形態であっても、経口投与した場合には、溶液状態となって反応する。
　本発明の製造方法の好ましい態様によれば、還元型ピロロキノリンキノンの製造方法であって、ｐＨが２～３．５であるピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液と、アスコルビン酸類似体またはその溶液とを混合させて、還元型ピロロキノリンキノンを含んでなるｐＨ３以下の溶液を得る工程を含んでなる製造方法である。
　本発明の製造方法のより好ましい態様によれば、還元型ピロロキノリンキノンの製造方法であって、ｐＨが２～２．５であるピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液と、アスコルビン酸類似体またはその溶液とを混合させて、還元型ピロロキノリンキノンを含んでなるｐＨ２．６以下の溶液を得る工程を含んでなる製造方法である。
　本発明によれば、本発明による製造方法により製造される還元型ピロロキノリンキノンが提供される。
　還元型ピロロキノリンキノンは酸化されやすいため、分離精製後の保存には酸化を防ぐために厳密な管理が必要とされる。酸化を抑制するには還元雰囲気に置けばよいが、通常の還元剤は有毒であることが多く使用できない。本発明では、還元型ピロロキノリンキノンに対しアスコルビン酸を０．５から１０００倍モルを含む組成物とすることで、酸化を抑制することができ、精製しなくても安定に保存でき、そのまま提供することができる。本発明の製造方法のすぐれた点の一つである。
　本発明によれば、還元型ピロロキノリンキノンを安定的に保存するために、還元型ピロロキノリンキノンを、アスコルビン酸類似体を含んでなる溶液として提供することができる。
　分離操作を行ったのちにアスコルビン酸類似体を添加することで組成物を生成することも可能である。この組成物は固体、若しくは縣濁液、溶液の状態で提供することができ、反応条件から容易に提供できるのは水に縣濁状態の組成物である。
　本発明によれば、還元型ピロロキノリンキノンの安定化方法が提供される。本発明による安定化方法は、還元型ピロロキノリンキノンを分子酸素による酸化から防護することを特徴とする。本発明による安定化方法は、還元型ピロロキノリンキノンまたはその塩を、アスコルビン酸類似体とともに溶媒中に存在させることにより、還元型ピロロキノリンキノンを安定化することができる。
　本発明による安定化方法において、還元型ピロロキノリンキノンとアスコルビン酸類似体のモル比は、溶媒中で、１：０．５～１０００、好ましくは、１：１～５００とすることができる。
　本発明で得られる還元型ピロロキノリンキノンの投与剤形は、特に制限されることなく、使用する用途により適宜選択することができる。本発明の経口摂取用組成物は、ヒト用または動物用として、食品、機能性食品、医薬品または医薬部外品として使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味している。具体的な形態としてはカプセル剤、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防菌防黴剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等を用いることができる。一般的には通常の食品、例えば味噌、醤油、インスタントみそ汁、ラーメン、焼きそば、カレー、コーンスープ、マーボードーフ、マーボーなす、パスタソース、プリン、ケーキ、パン等に加えることも可能である。
　本発明によれば、還元型ＰＱＱを製造するための組成物が提供される。
　本発明によれば、酸化に強く、安定して保存できる還元型ＰＱＱを製造するための組成物が提供される。
　本発明によれば、以下の発明も提供される。
（１）　ピロロキノリンキノンとアスコルビン酸を溶媒中で混合することを特徴とする還元型ピロロキノリンキノンの製造方法。
（２）溶媒が水であることを特徴とする（１）に記載の製造方法。
（３）混合液のpＨが５以下であることを特徴とする（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）ピロロキノリンキノンに対しアスコルビン酸を０．５から１０００倍モル使用することを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）ピロロキノリンキノンに対しアスコルビン酸を０．５から１０００倍モルを含む組成物。
（６）ピロロキノリンキノンが還元型であることを特徴とする（５）記載の組成物。
　実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。また、特に断りのない限り本文中の％は重量％を示す。
　本実施例および比較例において、ＮＭＲ測定は、ＪＥＯＬ製500MHz ＮＭＲ, JNM-ECA500 スペクトルメーターを使用し、１３Ｃ－ＮＭＲを室温測定した。
　本実施例および比較例において、ＵＶ測定は、ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２０００　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
還元反応確認実験
実施例１
　原料のピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱瓦斯化学社製の試薬（商品名：バイオＰＱＱ）を使用した。L-アスコルビン酸は和光純薬製を使用した。
　ピロロキノリンキノンジナトリウム１．５３ｇを水５００ｇに溶かし、０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度にした。Ｌ－アスコルビン酸は３．５１ｇを水１００ｇに溶かし、０．２ｍｏｌ／ｌ濃度にした。
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）２０ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．２ｍｏｌ／ｌ濃度２０ｇを混合した（ｐＨ２．５）。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は２０倍のモル量である。この二つの溶液を室温で混合し、７０℃、２時間反応させた（ｐＨ２．５）。反応後、固体が析出した。この溶液に、塩酸を加えてｐＨを１以下にした。これを１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、脱気した塩酸水溶液で洗い、窒素気流によって乾燥した。ここに重ジメチルスルホキシドを加え、窒素気流下でＮＭＲ管につめ、１３Ｃ－ＮＭＲを室温測定した。
　その結果、105.7, 111.0, 119.4, 122.9, 123.6, 128.1, 131.3, 134.2, 137.8, 140.9, 142.6, 162.2, 165.5, 170.1 ppm (DMSO-d6: 39.5ppm基準)であった。
　この値は非特許文献５（Eur.J. Biochem.118, 395-399(1981)）に記載の還元体と一致しており、還元体の生成が確認できた。また、この測定データには、キノン構造に由来する１７３．３、１７８．０ｐｐｍのピークは存在しなかった。
比較例１
　ピロロキノリンキノンジナトリウムの飽和水溶液に塩酸を加えｐＨを１以下にした。赤色個体が析出したのをフィルターでろ過し、ピロロキノリンキノンのフリー体を得た。これに重ジメチルスルホキシドを加え、ＮＭＲ管につめて、１３Ｃ－ＮＭＲを室温測定した。
　その結果、113.5, 124.5, 126.4, 127.6, 129.2, 134.3. 136.3, 146.8, 148.7, 160.9, 164.9, 168.7, 173.3, 178.0ppm (DMSO-d6: 39.5ppm基準)であった。実施例１のピークとは異なり、還元されたＰＱＱに存在するはずのピークは測定されなかった。
実施例２
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）２０ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．２ｍｏｌ／ｌ濃度１０ｇを混合した（ｐＨ３）。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は１０倍のモル量である。この二つの溶液を室温で混合し攪拌した。すぐに色が変わり、固体が析出した。一晩、室温で放置したのち、ｐＨをｐＨ試験紙で測ると３であった。固体を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）で取り出し、減圧乾燥して、０．０７３ｇの酸化体の存在しない還元体含水固体を得た。ＵＶスペクトルの分析は還元状態であることを示していた。
実施例３
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）２０ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．２ｍｏｌ／ｌ濃度５ｇを混合した（ｐＨ３）。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は５倍のモル量である。この二つの溶液を室温で混合し攪拌した。すぐに色が変わり、固体が析出した。一晩、室温で放置したのち、ｐＨをｐＨ試験紙で測ると３であった。固体を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）で取り出し、減圧乾燥して、０．０４４ｇの還元体固体を得た。単離粗収率は６６％であった。
実施例４
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．００１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）２０ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．２ｍｏｌ／ｌ濃度１０ｇを混合した（ｐＨ２）。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は１００倍のモル量である。この二つの溶液を室温で混合し攪拌した。すぐに色が変わり、固体が析出した。一晩、室温で放置したのち、ｐＨをｐＨ試験紙で測ると２であった。固体を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）で取り出し、減圧乾燥して、０．００６ｇの還元体固体を得た。
実施例５
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）０．５ｇとＬ－アスコルビン酸ナトリウム溶液０．５ｍｏｌ／ｌ濃度０．５ｇを混合した。この時のｐＨは６－７であった。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は５０倍のモル量である。この二つの溶液を室温で混合し、この混合溶液を人工胃液１０ｍｌに添加した（ｐＨ１．２）。一晩、室温で放置すると還元体の固体が析出した。酸性条件にすることで反応は進行しやすくなる。また、生体内でも還元されると考えられる。
実施例６
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）１ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．０１１ｍｏｌ／ｌ濃度１ｇを混合した（ｐＨ２．５）。この時のモル比は１：１．１である。３０℃で８日間反応することで（ｐＨ２．５）、８２％のＰＱＱが反応し、還元体含有物を得ることができた。
比較例２
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度０．５ｇとＬ－アスコルビン酸ナトリウム溶液０．５ｍｏｌ／ｌ濃度０．５ｇを室温で混合した。この時のｐＨは６－７であった。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は５０倍のモル量である。混合液を３日間室温で放置したところ、溶液に変化はなく（ｐＨ７）、還元体は得られなかった。
保存試験
実施例７
　ピロロキノリンキノンジナトリウム１．５３ｇを水５００ｇに溶かし０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度にした。Ｌ－アスコルビン酸は３．５１ｇを水１００ｇに溶かし０．２ｍｏｌ／ｌ濃度にした。
　上記のピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）２０ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．２ｍｏｌ／ｌ濃度２０ｇとを室温で混合した。ピロロキノリンキノン１に対してＬ－アスコルビン酸は２０倍のモル量である。ｐＨ試験紙で測定したところｐＨは２であった。この混合溶液を室温で一晩反応させた（ｐＨ２）。反応後、還元体固体が析出された。この状態では、Ｌ－アスコルビン酸は還元反応に使用された量と空気酸化された量を考慮しても１５倍モルは存在していることになる。その後、室温で１週間保存したところ、還元状態を維持していた。
比較例３
　実施例６で得られた還元体固体を遠心分離で取り出し、上澄みを捨て、水で洗浄した。この処理により、Ｌ－アスコルビン酸は除去された。ここにｐＨ７になるように水酸化ナトリウム水溶液を加えた。３０分後すべて酸化体に変化した。
実施例８
　ピロロキノリンキノンジナトリウム溶液０．０１ｍｏｌ／ｌ濃度（ｐＨ３．５）１ｇとＬ－アスコルビン酸溶液０．０１４ｍｏｌ／ｌ濃度１ｇを混合した。この混合液１ｇを１５ｍｌ容器に入れ空気に接触させたところ、酸化型ＰＱＱが１４％含まれていた（ｐＨ３）。この酸化型含有還元型ＰＱＱを３０℃で１週間放置すると酸化型ＰＱＱが１８％含まれていた。
ｐＨ条件確認試験
実施例９
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ１以下となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは１であった。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、６８％であった。
実施例１０
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ２．２となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは２．６であった。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、１００％であった。
実施例１１
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ２．６となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは３であった。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、６６％であった。
実施例１２
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ３．５となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは３．５であった。さらに濃塩酸を１００μｌ加えてｐＨを１にした。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、５４％であった。
比較例４
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ４．３となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは３．５であった。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、１％であった。
比較例５
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを水に溶かし、２ｇ／ｌに調整した。水溶液のｐHは、塩酸およびＮａＯＨを用い、ｐＨ７．６となるように調整した。また、Ｌ－アスコルビン酸を水に溶かし、４ｇ／ｌに調整した。
　上記２種の水溶液を０．５ｍｌずつ１．５ｍ容器で混合し、室温で２４時間反応させた。反応後のｐＨは３．５であった。その後、得られた混合液について遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄みを捨てて、固体を得た。得られた固体を、約９％の塩酸で洗い、ジメチルスルホキシドに溶解し、ＵＶ測定により還元体収率を算出したところ、９％であった。

Claims (9)

  1. 　還元型ピロロキノリンキノンの製造方法であって、ｐＨ４以下に調整されたピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液とアスコルビン酸類似体とを混合させて、還元型ピロロキノリンキノンを含んでなるｐＨ３．５以下の溶液を得る工程を含んでなる、製造方法。
  2. 　ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液が、水溶液である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　ピロロキノリンキノンまたはその塩の溶液のｐＨが、２～３．５である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　ピロロキノリンキノンまたはその塩とアスコルビン酸類似体のモル比が、１：０．５～１０００である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　アスコルビン酸類似体が、アスコルビン酸、ｒｈａｍｎｏ－アスコルビン酸、ａｒａｂｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏ－アスコルビン酸、ｆｕｃｏ－アスコルビン酸、ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏ－アスコルビン酸、ｘｙｌｏ－アスコルビン酸、ｇａｌａｃｔｏ－アスコルビン酸、ｇｕｌｏ－アスコルビン酸、ａｌｌｏ－アスコルビン酸、ｅｒｙｔｈｒｏ－アスコルビン酸、６－デスオキシアスコルビン酸、並びに、これらのエステル体および塩からなる群から選択される、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　溶液から還元型ピロロキノリンキノンを分離する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の製造方法。
  7. 　請求項１～６に記載の製造方法により製造される還元型ピロロキノリンキノン。
  8. 　アスコルビン酸類似体を含んでなる溶液として提供される、請求項７に記載の還元型ピロロキノリンキノン。
  9. 　還元型ピロロキノリンキノンの安定化方法であって、還元型ピロロキノリンキノンまたはその塩を、アスコルビン酸類似体とともに溶媒中に存在させることを含んでなる、方法。
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