WO2020189753A1 - ピロロキノリンキノン分析方法 - Google Patents

ピロロキノリンキノン分析方法 Download PDF

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pqq
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ヌルシャフィカ モハマドイシャク
池本　一人
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三菱瓦斯化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitative analysis of oxidized and reduced pyrroloquinoline quinone or a salt thereof.
  • Pyrroloquinoline quinone (hereinafter sometimes referred to simply as "PQQ") is a substance having an o-quinone structure obtained by condensing a pyrrole ring and a quinoline ring. This substance is sometimes referred to as oxidized PQQ. This quinone structure is easily reduced to reduced pyrroloquinoline quinone. Further, the reduced PQQ is changed to the oxidized PQQ by oxidation with air. As described above, it is known that redox is easily carried out between oxidized pyrroloquinoline quinone and reduced pyrroloquinoline quinone. It is known that the oxidized PQQ and the reduced PQQ have different UV spectra (Non-Patent Document 1).
  • PQQ has many effects such as cell proliferation promoting action, anticatabolism action, liver disease prevention / therapeutic action, wound healing promoting action, antiallergic action, reverse transcription enzyme inhibitory action, glioxylase I inhibitory action and anticancer action. It is said to have important physiological activity, and the industrial importance of using PQQ is increasing.
  • pyrroloquinoline quinone disodium is used as a food (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 is a method in which HPLC analysis is performed after a step of removing ascorbic acid by air oxidation before measurement in order to suppress interference by ascorbic acid. Under these analytical conditions, the oxidized and reduced forms of pyroquinoline quinone cannot be separated, so ascorbic acid, which is a reducing agent, is removed and all are detected as oxidized forms.
  • reducing agents such as ascorbic acid are blended in various foods. Especially in beverages, it is blended in large quantities because it also serves as an acidulant.
  • reduced pyrroloquinoline quinone has a problem of stability under the measurement conditions such as being oxidized by air (including dissolved oxygen contained in the liquid). Therefore, an accurate method for quantifying reduced pyrroloquinoline quinone has not been established.
  • reduced pyrroloquinoline quinone can be stabilized under measurement conditions and its amount can be quantified, reduced PQQ and oxidized PQQ can be separated by a method using HPLC, and the oxidized PQQ can be separated. An accurate quantifiable method of the reduced form can be established. In addition to this, if it is desired to know the total amount of oxidized and reduced pyrroloquinoline quinone contained in the sample, it is possible to establish a new method for measuring by reducing all of them.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a high performance liquid chromatography method capable of quantitative analysis while maintaining the stability of reduced pyrroloquinoline quinone under measurement conditions. To do.
  • the pH of the eluent is 2.8 or less.
  • a reduction treatment step of adding a reducing agent to the sample is further provided prior to the sample preparation step.
  • [5] The reducing agent is an ascorbic acid solution.
  • [6] The sample is a beverage, The high performance liquid chromatography analysis method according to any one of [1] to [5].
  • the PQQ contained in the measurement object can be quickly and easily measured without being affected by the coexisting components. It is possible to provide an analysis method that can be quantified. In particular, when reducing substances are contained, the quantification of PQQ in various products including foods can be established in a wide concentration range by detecting it as reduced PQQ, which contributes to the development of health foods and pharmaceuticals related to PQQs. Can be done.
  • Example 1 The chromatograph obtained in Example 1 is shown.
  • the absorption spectrum of UV-VIS of the fraction with an elution time of 10.2 minutes in the chromatogram in FIG. 1 is shown.
  • the absorption spectrum of UV-VIS of the fraction having an elution time of 17.4 minutes in the chromatogram in FIG. 1 is shown.
  • a graph showing the relationship between the peak area in Quantitative Experiment 1 and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample is shown.
  • a graph showing the relationship between the peak area in Quantitative Experiment 2 and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample is shown.
  • the chromatograph obtained in Example 28 is shown.
  • the chromatograph obtained in Comparative Example 7 is shown.
  • the PQQ aqueous solution (40 mg / L) chromatograph before the pretreatment obtained in Example 29 is shown.
  • the PQQ aqueous solution chromatograph after the pretreatment obtained in Example 29 is shown.
  • the absorption spectrum of UV-VIS of the fraction having an elution time of 6.4 minutes in the chromatogram in FIG. 8 is shown.
  • the absorption spectrum of UV-VIS of the fraction having an elution time of 18.9 minutes in the chromatogram in FIG. 9 is shown.
  • the present embodiment will be described in detail, but the present invention is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the gist thereof. Is.
  • the high performance liquid chromatography analysis method of the present embodiment includes a sample preparation step of preparing a sample for HPLC containing reduced pyroloquinolinquinone or a salt thereof from a sample, a reverse phase column as a stationary phase, and 0.
  • reduced pyrroloquinoline quinone is easily oxidized by air. If the oxidation of reduced pyrroloquinoline quinone progresses during the analysis, accurate analysis results cannot be obtained.
  • the analysis method of the present embodiment it is possible to suppress the conversion of reduced pyrroloquinoline quinone to the oxidized form during measurement, and the stability of reduced pyrroloquinoline quinone is maintained. It is possible to analyze with.
  • the separability of reduced pyrroloquinoline quinone and oxidized pyrroloquinoline quinone is improved, and it is possible to separate and quantify each of them.
  • the sample preparation step is a step of preparing a sample for HPLC containing reduced pyrroloquinoline quinone or a salt thereof from the sample. Before the sample preparation step, if necessary, a pretreatment step, a reduction treatment step, a liquid separation step, and a centrifugation step described later may be performed.
  • PQQ Pyrroloquinoline quinone to be analyzed in the analysis method of this embodiment is shown below.
  • PQQ includes an oxidized PQQ represented by the following formula (1) and a reduced PQQ represented by the following formula (2).
  • oxidized PQQ represented by the following formula (1)
  • reduced PQQ represented by the following formula (2).
  • Pyrroloquinoline quinone disodium n hydrate is sold as a food product and is also included in the analysis target.
  • various states can be taken from a state in which the oxidized PQQ is relatively large to a state in which the reduced PQQ is relatively large.
  • the total amount of oxidized PQQ and reduced PQQ can be quantified.
  • the salt of the pyrroloquinoline quinone to be analyzed is not particularly limited, and examples thereof include salts with metals such as alkali metals and alkaline earth metals; and salts with non-metals such as ammonium cations.
  • disodium salt which is a kind of alkali metal salt, is widely used as food and is important as an analysis target.
  • the sample (measurement object) containing pyrroloquinoline quinone is not particularly limited, and examples thereof include foods (including beverages), pharmaceuticals, and quasi-drugs.
  • foods include general foods, foods with insurance function (for example, foods for specified health use, foods with functional claims, and foods with nutritional function).
  • More specific samples include, for example, drugs and supplements for oral administration such as capsules, tablets, powders, granules; beverages; jellies; gummies; other foods such as retort pouch foods.
  • cosmetics, cleaning agents, and other external preparations that are not foods and drinks can be targeted, and all products including PQQ can be targeted.
  • a pretreatment step may be performed according to the form of the object to be measured. For example, if the object to be measured is a capsule, the capsule is cut, or if the object is a tablet, the tablet is crushed, and the sample can be appropriately processed so as to be easily mixed.
  • a reduction treatment step of adding a reducing agent to the sample may be performed prior to the sample preparation step.
  • a reduction treatment step of adding a reducing agent to the sample may be performed prior to the sample preparation step.
  • the sample contains oxidized pyrroloquinoline quinone
  • the sample may contain a component that reacts with oxidized PQQ before and after the sample preparation step or during the step to form an unspecified analog.
  • Such components can interfere with the analysis.
  • amino group-containing substances tend to cause such interference. More specifically, essential amino acids, theanine, ornithine, protein-containing substances can be mentioned.
  • the operation of reducing PQQ can be performed.
  • a reduction treatment step may be performed in which an oxidized PQQ in the sample is converted into a reduced PQQ by adding a reducing agent to the sample.
  • the reduced PQQ which is the main measurement target in the analysis method of the present embodiment, is excellent in stability in that it does not react with arbitrary components such as amino acids. This enables quantitative analysis without being disturbed by any component coexisting in the HPLC sample.
  • the elution time of reduced PQQ in liquid chromatography is different from that of oxidized PQQ, and the peaks of the chromatogram can be easily separated.
  • the reducing agent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known substances such as ascorbic acid.
  • a reducing agent By using a reducing agent, the production of reduced PQQ proceeds efficiently and preferentially, and the influence of the above-mentioned interfering substance can be eliminated.
  • the mode of ascorbic acid added as a reducing agent is not particularly limited, and may be an aqueous solution or a powder. When it is an aqueous solution, water may be used as a solvent or a buffer solution may be used.
  • the method of adding the reducing agent to the sample is not particularly limited, and examples thereof include a method in which pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and ascorbic acid coexist in an aqueous solution such as water or a buffer solution.
  • the temperature and time of the reaction for producing reduced PQQ by the method can be adjusted by the PQQ concentration and the concentration of interfering substances, and are not particularly limited.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 120 ° C, more preferably 10 to 90 ° C, and even more preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time is preferably 5 minutes to 2 days, more preferably 10 minutes to 24 hours, and even more preferably 10 minutes to 10 hours.
  • the pH of the aqueous solution is preferably 1 to 3, more preferably 1.5 to 2.5.
  • the amount of the reducing agent used is preferably large in excess of that of pyrroloquinoline quinone. More specifically, the amount of the reducing agent used is preferably 100 to 1,000,000 parts by mass, more preferably 500 to 500,000 parts by mass, and further preferably 1,000 to 100,000 parts by mass with respect to 1 part by mass of pyrroloquinoline quinone. It is a mass part.
  • the sample may also contain compounds that may interfere with the analysis by inhibiting the extraction of PQQ during the sample preparation process.
  • Such compounds are not particularly limited, and examples thereof include fat-soluble components. More specifically, the fat-soluble components include fats and oils such as edible fats and oils, non-edible fats and oils, animal fats and oils, and vegetable fats and oils; lipoic acid; docosahexaenoic acid (DHA), eikosapentaenoic acid (EPA), lecithin and the like.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eikosapentaenoic acid
  • lecithin lecithin and the like.
  • Lipids fat-soluble vitamins such as vitamin E and derivatives thereof; glycerylphosphorylcholine, magnesium stearate and the like. Among these, fats and oils have a high interfering effect and tend to hinder quantification.
  • the sample contains a fat-soluble component in this way, an operation to remove it can be performed.
  • the fat-soluble component in the object to be measured was removed by further mixing an organic solvent incompatible with water, dissolving the fat-soluble component in the object to be measured in the organic solvent, and then removing the organic solvent.
  • a liquid separation step may be performed to prepare a sample for HPLC.
  • the object to be measured contains a fat-soluble component
  • the fat-soluble component is extracted from the organic layer and PQQ (oxidized or reduced type) is extracted from the aqueous layer by performing a liquid separation operation.
  • PQQ oxidized or reduced form
  • the organic solvent that can be used in the liquid separation treatment is not particularly limited, and examples thereof include ethyl acetate, chloroform, methylene chloride, cyclohexane, toluene, hexane, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and acetone.
  • ethyl acetate, chloroform and methylene chloride are preferable, and ethyl acetate having high biodegradability is more preferable, from the viewpoint of low water solubility. If it is considered that the liquid separation operation does not contain a fat-soluble component, it can be omitted. By performing the liquid separation operation, the quantification accuracy of PQQ tends to be further improved.
  • a powder component As another substance that inhibits the extraction of PQQ in the sample preparation step, a powder component can be mentioned.
  • the powder component is not particularly limited, and examples thereof include inorganic powders such as silica; and organic powders such as rice flour.
  • the sample contains a powder component in this way, an operation to remove it can be performed.
  • a centrifugation operation may be performed (centrifugation step).
  • a centrifugal separation operation may be used to separate the aqueous layer and the organic layer in the process of the liquid separation operation.
  • Diluents may be added to the HPLC sample to adjust the concentration of PQQ or other components to a concentration suitable for HPLC measurement.
  • the diluent is not particularly limited, and examples thereof include an organic solvent miscible with water such as methanol and acetonitrile, and water. Moreover, you may use these mixed solvent as a diluent.
  • the diluent contains water, it is preferably acidic. Further, a reducing agent such as ascorbic acid may be further added when the diluent is added. As a result, the reduced PQQ can be kept more stable.
  • an HPLC eluent may be used as the diluent. This reduces the difference between the sample composition introduced into the HPLC and the composition of the HPLC eluent. Therefore, it is possible to suppress the shock peak, the disorder of the peak shape, and the fluctuation of the elution time.
  • HPLC sample obtained as described above is unreacted ascorbin with oxidized pyrroquinolinquinone, reduced pyrroquinolinquinone, or reduced PQQ obtained by reacting a salt thereof with ascorbic acid or a salt thereof. It may contain an acid and other components contained in the object to be measured.
  • the content of ascorbic acid contained in the HPLC sample is preferably 1 to 40% by mass, more preferably 3 to 20% by mass, and further preferably 3 to 10% by mass.
  • the separation step uses a reverse phase column as the stationary phase and comprises 0.050 to 1.5% by mass of phosphoric acid and / or hydrochloric acid and 20 to 50% by volume of methanol and / or acetonitrile as the mobile phase.
  • This is a step of separating reduced pyrroloquinoline quinone or a salt thereof contained in a sample for HPLC from a sample by utilizing an interaction with a stationary phase and a mobile phase by a high performance liquid chromatography method using an eluent.
  • the quantification method is not particularly limited, and examples thereof include a standard addition method, an internal standard method, and an absolute calibration curve method.
  • the quantitative method may be adopted in consideration of the required accuracy and correction.
  • the standard addition method that can be used in the present embodiment is the same as that of the conventional method.
  • a chromatogram of a sample for HPLC is obtained by using a detector capable of detecting oxidized PQQ or reduced PQQ and a salt thereof.
  • a method of quantifying imidazopyrroloquinoline and a salt thereof contained in a sample for HPLC can be mentioned from a calibration curve determined in advance based on the area of the peak.
  • a standard solution having a known concentration is prepared in advance, and the standard solution is added to a sample for HPLC to prepare a sample group for preparing a calibration curve.
  • Examples of this embodiment include liquid chromatography (LC) such as high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the HPLC apparatus includes a separation column and a pump that pumps the separation solution onto the separation column.
  • the HPLC apparatus may include other elements such as an autosampler, a heater, a detector for detecting separated components, and the like. Examples of the detector include a UV detector, a fluorescence detector, and a mass spectrometer.
  • a reverse phase column is used as the separation column that becomes the stationary phase.
  • the reversed-phase column include a column packed with an octadecylsilylated silica gel filler (octadecylsilyl (ODS) column), a column packed with silica gel having an octyl group introduced (C8 column), and silica gel having an ethyl group introduced therein.
  • ODS octadecylsilyl
  • Examples thereof include a column (C2 column) and a column in which an ion exchange resin is blended, and an ODS column is particularly preferable.
  • the particle size of the filler is preferably 5.0 ⁇ m or less, more preferably 1.7 to 5.0 ⁇ m. When the particle size of the filler is within the above range, the separability tends to be further improved.
  • the mobile phase eluent contains 0.050 to 1.5% by weight of phosphoric acid and / or hydrochloric acid and 20 to 50% by volume of methanol and / or acetonitrile.
  • the eluent contains either phosphoric acid or hydrochloric acid, or both phosphoric acid and hydrochloric acid.
  • "0.050 to 1.5% by mass of phosphoric acid and / or hydrochloric acid” refers to the concentration of the eluent when it contains either phosphoric acid or hydrochloric acid, and the eluent contains both phosphoric acid and hydrochloric acid. When included, it means the total amount. Based on this, the concentration of phosphoric acid and / or hydrochloric acid is 0.050 to 1.5% by mass, preferably 0.085 to 1.5% by mass, and more preferably 0.1 to 1. It is 5% by mass, more preferably 0.2 to 1% by mass.
  • the concentration of phosphoric acid and / or hydrochloric acid is within the above range, the separation ability is further improved, the reduced PQQ can be measured in a stable state, and the oxidized PQQ and the reduced PQQ are separated. It is also possible.
  • other acidic components may be added.
  • the eluent contains either methanol or acetonitrile, or both methanol and acetonitrile.
  • "20 to 50% by volume of methanol and / or acetonitrile” means the concentration thereof when the eluent contains either methanol or acetonitrile, and the total amount when the eluent contains both methanol and acetonitrile.
  • the content of methanol and / or acetonitrile is 20 to 50% by volume, preferably 25 to 45% by volume, and more preferably 27.5 to 42.5% by volume.
  • the content of methanol and / or acetonitrile is 30 to 50% by volume, 30 to 45% by volume, or 30 to 42.5% by volume.
  • the content of methanol and / or acetonitrile is within the above range, the separability is further improved, the reduced PQQ can be measured in a stable state, and the oxidized PQQ and the reduced PQQ are separated. It is also possible.
  • other organic solvents may be added.
  • the pH of the eluent is preferably 2.8 or less, more preferably 2.3 or less, and even more preferably 2.1 or less.
  • the separability is further improved, the reduced PQQ can be measured in a stable state, and the oxidized PQQ and the reduced PQQ can be separated. Become.
  • the elution method is not particularly limited, and for example, an isocratic elution method in which the composition of the mobile phase (eluent) is not changed during the feed, and a mobile phase (eluent) composition is changed during the feed.
  • a gradient elution method can be mentioned.
  • the elution method can be appropriately selected depending on the separating ability.
  • the analysis method of this embodiment has the following advantages and features in PQQ quantitative analysis.
  • oxidized PQQ and reduced PQQ can be detected even when a reducing substance such as ascorbic acid is contained.
  • quantitative calculation is facilitated by detecting all as reduced PQQ.
  • ascorbic acid which converts oxidized PQQ to reduced PQQ, is inexpensive and safe.
  • Example 1 Oxidized PQQ and reduced PQQ separation conditions
  • Eluent 1 The eluent used in Example 1 was prepared by mixing water and methanol at a volume ratio of 73:27, and adding phosphoric acid to the mixed solution so as to be 0.34% by mass.
  • the ascorbic acid aqueous solution alone and the pyrroloquinoline quinone disodium aqueous solution alone, which had been sufficiently exposed to air to be oxidized were used as samples, and the analysis operation was performed under the above HPLC analysis conditions to obtain chromatograms. .. From the chromatogram when the ascorbic acid aqueous solution alone was used as a sample, it was found that the ascorbic acid elution time was 1.1 minutes. In addition, from the chromatogram when the aqueous solution of pyrroloquinoline quinone disodium sufficiently exposed to air was used as a sample, it was found that the elution time of oxidized pyrroloquinoline quinone disodium was 10.2 minutes.
  • the elution time of each component identified as described above indicates ascorbic acid, oxidized pyrroloquinoline quinone disodium, and reduced pyrroloquinoline quinone disodium, respectively. Therefore, in addition to the above detector UV, the absorption of UV-VIS at each elution time was measured by photodiode array analysis.
  • Analysis sample 1 was prepared in the same manner as above. Within 120 minutes from the preparation of the analytical sample 1, the analytical operation was carried out under the above HPLC analytical conditions to obtain a chromatogram. Separately, using ascorbic acid aqueous solution alone and pyrroloquinoline quinone disodium aqueous solution alone sufficiently exposed to air as samples, an analysis operation was performed under the above HPLC analysis conditions to obtain chromatograms, respectively.
  • Examples 2 to 7, Comparative Example 2 The analysis was performed in the same manner as in the analysis conditions of Example 1 except that the columns and eluents used were changed as shown in Table 1 below, and the oxidized pyrroloquinoline quinone disodium and the reduced pyrrolo in the analysis sample 1 were analyzed. It was confirmed whether or not quinoline quinone disodium could be separated.
  • Table 1 shows the analytical conditions of Examples 2 to 7 and Comparative Example 2 and the elution times of ascorbic acid, oxidized pyrroloquinoline quinone disodium, and reduced pyrroloquinoline quinone disodium.
  • Oxidized PQQ Oxidized pyrroloquinoline quinone disodium
  • Reduced PQQ Reduced pyrroloquinoline quinone disodium
  • Examples 8 to 16 Analysis including pretreatment step
  • An aqueous solution containing oxidized pyrroloquinoline quinone disodium (100 mg / L) and the pretreatment solution shown in Table 2 were mixed and left to stand under predetermined conditions (pretreatment step) to prepare each analytical sample.
  • pretreatment step pretreatment step
  • analysis was performed under the following HPLC analysis conditions.
  • Examples 17 to 27 Stability of reduced PQQ
  • An aqueous solution containing oxidized pyrroloquinoline quinone disodium (100 mg / L or 500 mg / L) and the pretreatment solution shown in Table 2 were mixed and left at 50 ° C. for 1 hour (pretreatment step) for each analysis. Samples were prepared. Using each of the obtained analytical samples, analysis was performed under the following HPLC analysis conditions. After 24 hours or more, the precipitation of reduced PQQ was confirmed and then analyzed.
  • the peak area of reduced pyrroloquinoline quinone disodium was calculated with respect to the total area of the peaks of oxidized pyrroloquinoline quinone disodium and the peak of reduced pyrroloquinoline quinone disodium.
  • the calculated area ratio is shown in Table 3 as the ratio of reduced PQQ.
  • the peak area appearing at the elution time 4.0 of reduced pyrroloquinoline quinone disodium is a chromatogram obtained by absorption of the detector UV at a wavelength of 259 nm and a chromatogram obtained by absorption of a wavelength of 320 nm. It was calculated by both.
  • the vertical axis is the peak area based on the chromatogram obtained by absorption at a wavelength of 259 nm
  • the horizontal axis is the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium used in the preparation of the analysis sample.
  • the relationship with the sodium concentration is shown in Fig. 4.
  • the relationship between the peak area and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample is shown in FIG.
  • the straight line A is a straight line showing the relationship between the peak area and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample based on the chromatogram obtained by absorption at a wavelength of 259 nm
  • the straight line B is obtained by absorption at a wavelength of 320 nm. It is a straight line showing the relationship between the peak area and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample based on the obtained chromatogram.
  • the peak area appearing at the elution time 9.7 of the reduced pyrroloquinoline quinone disodium was calculated.
  • the peak area appearing at the elution time 9.7 of the reduced pyrroloquinoline quinone disodium was calculated by the chromatogram obtained by absorption at a wavelength of 320 nm.
  • the vertical axis is the peak area based on the chromatogram obtained by absorption at a wavelength of 320 nm
  • the horizontal axis is the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium used in the preparation of the analysis sample. The relationship with the sodium concentration is shown in FIG.
  • the straight line is a straight line showing the relationship between the peak area and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample based on the chromatogram obtained by absorption at a wavelength of 320 nm.
  • the peak area and the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium in the analysis sample have linearity, and these are good for obtaining the concentration of pyrroloquinoline quinone disodium from the peak area. It turned out that it could be a calibration curve. In this calibration curve, R2 by the least squares method was 0.999 or more, and it was confirmed that a high correlation was maintained at a concentration of 20 to 80 mg / L.
  • Example 28 A beverage having the composition shown in Table 4 was prepared at 500 mL.
  • An analytical sample was prepared by mixing 1 g of an aqueous solution containing 2% by mass of ascorbic acid and 2% by mass of ⁇ -cyclodextrin as a pretreatment liquid with 1 g of the obtained beverage and leaving it at 50 ° C. for 1 hour.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the concentration of pyrroloquinoline quinone contained in the analysis sample was calculated to be 21.8 mg / L.
  • concentration of pyrroloquinoline quinone contained in the analysis sample was calculated from the peak area using the calibration curve obtained in the quantitative test 2, it was estimated to be 21.6 mg / L.
  • the ratio (recovery rate) of the concentration of pyrroloquinoline quinone calculated by the calibration curve to the concentration of pyrroloquinoline quinone actually contained in the analysis sample was 99%. From this analysis result, it was found that a result with excellent quantitativeness can be obtained.
  • Comparative Example 7 The above beverage was analyzed under the conditions of Comparative Example 1. The recovery rate was calculated to be 103%. In addition, the oxidized PQQ and the reduced PQQ were not completely separated, which was not suitable as an analysis method. The result is shown in FIG.
  • FIG. 8 shows a chromatogram of the PQQ aqueous solution (40 mg / L) before the pretreatment. The peak of PQQ was detected at 6.4 minutes.
  • FIG. 9 shows the results of the pretreated PQQ aqueous solution. Ascorbic acid in the pretreatment solution showed a peak at 1.2 minutes, and a peak of reduced PQQ (20 mg / L) was detected at 18.9 minutes.

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Abstract

測定条件下における還元型ピロロキノリンキノンの安定性を維持した状態で定量分析を可能とする高速液体クロマトグラフィー法を提供することを目的とする。前記目的は次の方法により達成することができる。試料から還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を含む高速液体クロマトグラフィー用サンプルを調製するサンプル調製工程と、固定相として逆相カラムを用い、移動相として、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む溶離液を用いる高速液体クロマトグラフィー法により、前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を前記固定相及び前記移動相との相互作用を利用して前記試料から分離する分離工程と、を有する、高速液体クロマトグラフィー分析方法。

Description

ピロロキノリンキノン分析方法
　本発明は、酸化型および還元型ピロロキノリンキノン又はその塩の定量分析方法に関する。
　ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ　ｑｕｉｎｏｎｅ以下、単に「ＰＱＱ」ということがある）は、ピロール環とキノリン環が縮合したものがｏ－キノン構造をとる物質である。この物質は酸化型ＰＱＱと言われることがある。このキノン構造は容易に還元され、還元型ピロロキノリンキノンになる。また、還元型ＰＱＱは空気による酸化で酸化型ＰＱＱに変化する。このように酸化型ピロロキノリンキノンと還元型ピロロキノリンキノンの間で酸化還元が容易におこなわれることが知られている。この酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱは異なるＵＶスペクトルであることが知られている（非特許文献１）。
　またＰＱＱは、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防・治療作用、創傷治癒促進作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキシラーゼＩ阻害作用および制癌作用などの多くの重要な生理活性を有するとされ、ＰＱＱ利用の産業上の重要性が高まっている。実際、食品としてピロロキノリンキノンジナトリウムが使用されている（特許文献１）。
　機能性を利用する機能性表示食品制度では食品中のＰＱＱの正確な測定データを算出する必要が求められている。多くの食品では単独での製品はなく、色々な物質と混合して提供される。一方でＰＱＱは多くの食品成分と反応しやすく、分析時に妨害を受けやすい。また、分析スケールはカプセルや錠剤に含まれるｍｇオーダーの含有量の分析である。
　これまでにＰＱＱの分析方法は酸化型ＰＱＱを対象とする分析方法が使われてきた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は不揮発性の物質を分析する方法であり、高感度分析も開発されている。しかし、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱの定量に適した分析方法は報告されてこなかった。また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱの分離について詳しい報告はされていない。
　ピロロキノリンキノンは還元性物質と反応することで還元型ピロロキノリンキノンに容易に変化する。この分析時の妨害を抑制する方法については非特許文献１に報告されている。この方法はアスコルビン酸による妨害を抑制するために、測定前に空気酸化によるアスコルビン酸を除去する工程を経た後にＨＰＬＣ分析をする方法である。この分析条件ではピロキノリンキノンの酸化型と還元型の分離はできていないために還元剤であるアスコルビン酸を除去し、すべてを酸化型として検出する方法である。
　一方、アスコルビン酸に代表される還元剤は色々な食品に配合されている。特に飲料では酸味料としての役割も合わさって、大量に配合されている。
　このような食品にＰＱＱが同時に配合された場合、還元剤の量が多く、空気酸化で除去する方法では長時間の処理が必要か、分析できない可能性が高い。そのため、還元型ＰＱＱを直接分析可能にして、正確な配合量を算出する分析方法が望まれてきた。
　また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱの分離を行うことで混合物内での状態を知る方法が望まれてきた。さらには定量を行うためにすべてを還元型ＰＱＱに変換させる前処理方法も望まれている。
再表2011/007633
Itoh et al, Bull. Chem. Soc. Jpn, 1986, vol59, pp1911-1914 池本一人ら著、分析化学Vol.65,No.6,pp.339-342(2016)
　従来法では、還元型ピロロキノリンキノンは空気（液体に含まれる溶存酸素を含む）により酸化されるなどその測定条件下における安定性に問題がある。そのため、還元型ピロロキノリンキノンの正確な定量方法は確立されていなかった。
　仮に、還元型ピロロキノリンキノンを測定条件下において安定させることができ、その量を定量することが可能となれば、ＨＰＬＣを用いた方法において還元型ＰＱＱと酸化型ＰＱＱを分離でき、酸化型と還元型の正確な定量可能な方法を確立することができる。また、これに加えて、試料に含まれる酸化型と還元型のピロロキノリンキノンの総量を知りたい場合には、すべてを還元型にして測定する新たな方法を確立することも可能となる。
　本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、測定条件下における還元型ピロロキノリンキノンの安定性を維持した状態で定量分析を可能とする高速液体クロマトグラフィー法を提供することを目的とする。
　また、これにより、飲料のようなｍｇオーダーのＰＱＱとその他の多数の共存成分を含む測定対象物を測定対象とした際に、共存成分による影響を受けることなく、当該測定対象物に含まれるＰＱＱを迅速かつ簡便に定量することができる。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、固定相として逆相カラムを用い、移動相として所定の溶離液を用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
　試料から還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を含む高速液体クロマトグラフィー用サンプルを調製するサンプル調製工程と、
　固定相として逆相カラムを用い、移動相として、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む溶離液を用いる高速液体クロマトグラフィー法により、前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を前記固定相及び前記移動相との相互作用を利用して前記試料から分離する分離工程と、を有する、
　高速液体クロマトグラフィー分析方法。
〔２〕
　前記溶離液のｐＨが、２．８以下である、
　〔１〕に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
〔３〕
　前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルが酸化型ピロロキノリンキノンをさらに含む場合において、
　前記分離工程において、前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノンと前記酸化型ピロロキノリンキノンとを分離する、
　〔１〕又は〔２〕に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
〔４〕
　サンプル調製工程の前に、前記試料に対して還元剤を添加する還元処理工程を、さらに有する、
　〔１〕又は〔２〕に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
〔５〕
　前記還元剤が、アスコルビン酸溶液である、
　〔４〕に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
〔６〕
　前記試料が飲料である、
　〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
　本発明によれば、測定条件下における還元型ピロロキノリンキノンの安定性を維持した状態で定量分析を可能とする高速液体クロマトグラフィー法を提供することができる。
　またこれにより、飲料のようなＰＱＱとその他の多数の共存成分を含む測定対象物を測定対象とした際に、共存成分による影響を受けることなく、当該測定対象物に含まれるＰＱＱを迅速かつ簡便に定量できる分析方法を提供することができる。特に還元性物質を含む場合、還元型ＰＱＱとして検出することで食品をはじめとして様々な製品におけるＰＱＱの定量が広い濃度範囲で確立され、ＰＱＱ類に関連した健康食品や医薬品等の開発に資することができる。
実施例１において得られたクロマトグラフを示す。 図１におけるクロマトグラムにおける、溶出時間１０．２分のフラクションのＵＶ－ＶＩＳの吸収スペクトルを示す。 図１におけるクロマトグラムにおける、溶出時間１７．４分のフラクションのＵＶ－ＶＩＳの吸収スペクトルを示す。 定量性実験１におけるピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を表すグラフを示す。 定量性実験２におけるピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を表すグラフを示す。 実施例２８において得られたクロマトグラフを示す。 比較例７において得られたクロマトグラフを示す。 実施例２９において得られた前処理前のＰＱＱ水溶液（４０ｍｇ／Ｌ）クロマトグラフを示す。 実施例２９において得られた前処理後のＰＱＱ水溶液クロマトグラフを示す。 図８におけるクロマトグラムにおける、溶出時間６．４分のフラクションのＵＶ－ＶＩＳの吸収スペクトルを示す。 図９におけるクロマトグラムにおける、溶出時間１８．９分のフラクションのＵＶ－ＶＩＳの吸収スペクトルを示す。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
〔分析方法〕
　本実施形態の高速液体クロマトグラフィー分析方法は、試料から還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を含むＨＰＬＣ用サンプルを調製するサンプル調製工程と、固定相として逆相カラムを用い、移動相として、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む溶離液を用いる高速液体クロマトグラフィ法により、前記ＨＰＬＣ用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を前記固定相及び前記移動相との相互作用を利用して前記試料から分離する分離工程と、を有する。
　一般に、還元型ピロロキノリンキノンは空気酸化しやすい。分析中で還元型ピロロキノリンキノンの酸化が進行すると、正確な分析結果を得ることができない。これに対して、本実施形態の分析方法によれば、還元型ピロロキノリンキノンが測定中に酸化型に変換されることを抑制することができ、還元型ピロロキノリンキノンの安定性を保った状態で分析をすることが可能となる。
　そのため、還元型ピロロキノリンキノンと酸化型ピロロキノリンキノンを含む試料の測定においては、すべてを還元型ピロロキノリンキノンに変換して測定することができる。これにより、一回の測定により試料に含まれるピロロキノリンキノンの総量を定量することが可能となる。
　また、本実施形態においては、上記所定の移動相を用いることにより、還元型ピロロキノリンキノンと酸化型ピロロキノリンキノンの分離能が向上し、それぞれを分離して定量することも可能となる。
〔サンプル調製工程〕
　サンプル調製工程は、試料から還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を含むＨＰＬＣ用サンプルを調製する工程である。なお、サンプル調製工程前には、必要に応じて、後述する前処理工程、還元処理工程、分液工程、及び遠心分離工程を行ってもよい。
（分析対象）
　本実施形態の分析方法における分析対象となるピロロキノリンキノンを以下に示す。ＰＱＱには、下記式（１）で表される酸化型ＰＱＱと、下記式（２）で表される還元型ＰＱＱがある。通常、ピロロキノリンキノンと表示された場合は酸化型ＰＱＱを示す。食品としてはピロロキノリンキノンジナトリウムn水和物が販売されており、これも分析対象に含まれる。環境に応じて酸化型ＰＱＱが相対的に多い状態から還元型ＰＱＱが相対的に多い状態まで様々取りうる。例えば、溶液中では、還元が進みやすく還元型ＰＱＱが相対的に多く存在し、酸化環境下では酸化型ＰＱＱが相対的に多く存在する。この点、本実施形態の分析方法によれば、酸化型ＰＱＱ及び還元型ＰＱＱの総量を定量することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　また、分析対象となる上記ピロロキノリンキノンの塩としては、特に制限されないが、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属などの金属との塩；アンモニウムカチオン等の非金属との塩が挙げられる。特に、アルカリ金属塩の一種であるジナトリウム塩は、食品として多用されており、分析対象としては重要である。
（試料）
　ピロロキノリンキノンを含む試料（測定対象物）としては、特に制限されないが、例えば、食品（飲料を含む）、医薬品、医薬部外品等が挙げられる。食品としては、例えば、一般食品、保険機能食品（例えば、特定保健用食品、機能性表示食品、及び栄養機能食品）等が挙げられる。より具体的な試料としては、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などの経口投与用の薬剤及びサプリメント；飲料；ゼリー；グミ；レトルト食品などその他食品が挙げられる。試料については、上記の他、飲食品ではない化粧料、洗浄料、その他外用剤なども対象とすることができ、ＰＱＱを含む製品全般を対象とすることができる。
（前処理工程）
　サンプル調製工程において、測定対象物の形態に応じた前処理工程を行ってもよい。例えば、測定対象物がカプセル剤であればカプセルを切断したり、錠剤であれば錠剤を粉砕したりするなど、サンプルが混合されやすいよう適切に処理することができる。
（還元処理工程）
　サンプル調製工程の前には、試料に対して還元剤を添加する還元処理工程が行われてもよい。この際、試料が酸化型ピロロキノリンキノンを含む場合、試料に含まれるすべての酸化型ピロロキノリンキノンが還元型ピロロキノリンキノンに変換することが好ましい。これにより、試料に含まれる還元型ピロロキノリンキノンと酸化型ピロロキノリンキノンの総量を、一回の分析により定量すること可能となる。
　また別の観点として、試料には、サンプル調製工程の前後又はその工程中において酸化型ＰＱＱと反応し、不特定の類縁体を形成する成分が含まれることがある。このような成分は、分析の妨害を起こし得る。特に、アミノ基含有物質はこのような妨害を起こしやすい傾向にある。より具体的には、必須アミノ酸、テアニン、オルニチン、タンパク含有物質が挙げられる。
　このように、試料が酸化型ＰＱＱと反応し得る化合物を含む場合には、ＰＱＱを還元型にする操作を行うことができる。例えば、試料に対して還元剤を添加することにより試料中の酸化型ＰＱＱを還元型ＰＱＱにする還元処理工程が行われてもよい。本実施形態の分析方法における主な測定対象となる還元型ＰＱＱは酸化型ＰＱＱと異なり、アミノ酸等の任意成分と反応をしないという点で、安定性に優れる。これにより、ＨＰＬＣ用サンプル中に共存する任意成分の妨害を受けずに定量分析が可能となる。また、還元型ＰＱＱの液体クロマトグラフィーの溶出時間は、酸化型ＰＱＱと異なり、クロマトグラムのピークの分離も容易になる。
　還元剤としては、特に制限されないが、例えば、アスコルビン酸などの従来公知の物質が挙げられる。還元剤を用いることにより、還元型ＰＱＱの生成が効率的及び優先的に進行し、上記妨害物質による影響を排することができる。還元剤として添加するアスコルビン酸の態様は、特に制限されず、水溶液であっても、粉末状であってもよい。水溶液である場合には、溶媒として水を用いても緩衝液を用いてもよい。
　試料に対する還元剤の添加方法は、特に制限されないが、水又は緩衝液などの水溶液中で、ピロロキノリンキノン又はその塩とアスコルビン酸とを共存させる方法が挙げられる。当該方法により還元型ＰＱＱを生成する反応の温度と時間は、ＰＱＱ濃度や妨害物質濃度によって調整することができ、特に制限されない。
　このなかでも、反応温度は、好ましくは０～１２０℃であり、より好ましくは１０～９０℃であり、さらに好ましくは２０～８０℃である。また、反応時間は、好ましくは５分～２日であり、より好ましくは１０分～２４時間であり、さらに好ましくは１０分～１０時間である。さらに、水溶液のｐＨは、好ましくは１～３であり、より好ましくは１．５～２．５である。
　還元剤の使用量は、ピロロキノリンキノンに対して大過剰で使用することが好ましい。より具体的には、還元剤の使用量は、ピロロキノリンキノン１質量部に対して、好ましくは１００～１００００００質量部であり、より好ましくは５００～５０００００質量部であり、さらに好ましくは１０００～１０００００質量部である。
（分液工程）
　また、試料には、サンプル調製工程においてＰＱＱの抽出を阻害することにより分析の妨害を起こす可能性のある化合物も含まれ得る。このような化合物としては、特に制限されないが、例えば、脂溶性成分が挙げられる。脂溶性成分としては、より具体的には、食用油脂、非食用油脂、動物性油脂、及び植物性油脂等の油脂類；リポ酸；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ），レシチン等の脂質；ビタミンＥ等の脂溶性ビタミン類及びその誘導体；グリセリルホスホリルコリン、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。このなかでも、油脂は妨害効果が高く、定量化の妨げになりやすい。
　このように試料が脂溶性成分を含む場合には、これを除去する操作を行うことができる。例えば、水と相溶しない有機溶剤をさらに混合し、測定対象物中の脂溶性成分を有機溶剤に溶解させた後、有機溶剤を取り除くことにより、測定対象物中の脂溶性成分が除去されたＨＰＬＣ用サンプルを調製する分液工程を行ってもよい。特に、測定対象物が脂溶性成分を含む場合には、分液操作を行うことにより、有機層に脂溶性成分を抽出し、水層にＰＱＱ（酸化型または還元型）を抽出することで、ＰＱＱ（酸化型または還元型）の定量精度がより向上する傾向にある。
　分液処理において用い得る有機溶媒としては、特に制限されないが、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、シクロヘキサン、トルエン、ヘキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトンが挙げられる。このなかでも、水溶性が低いという観点から、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレンが好ましく、より好ましくは生分解性の高い酢酸エチルである。なお、分液操作は脂溶性成分を含まないと考えられる場合には、省略することも可能である。分液操作を行うことにより、ＰＱＱの定量精度がより向上する傾向にある。
（遠心分離工程）
　また、サンプル調製工程においてＰＱＱの抽出を阻害するその他の物質として、粉末成分が挙げられる。粉末成分としては、特に制限されないが、例えば、シリカ等の無機粉体；コメ粉等の有機粉体などが挙げられる。
　このように試料が粉末成分を含む場合には、これを除去する操作を行うことができる。例えば、測定対象物が、難溶性成分等の粉末成分を含む場合には、遠心分離操作を行ってもよい（遠心分離工程）。また、分液操作の過程で水層と有機層を分離させるために遠心分離操作を利用してもよい。
（希釈工程）
　ＨＰＬＣ用サンプルには、ＰＱＱあるいはその他の成分の濃度をＨＰＬＣ測定に適した濃度に調整するために、希釈剤を加えてもよい。希釈剤としては、特に制限されないが、例えば、メタノールやアセトニトリルなど水と混和する有機溶媒や、水が挙げられる。また、希釈剤としてはこれらの混合溶媒を用いてもよい。
　希釈剤が水を含む場合、酸性が好ましい。また、希釈剤の添加時にアスコルビン酸等の還元剤をさらに添加してもよい。これにより、還元型PQQをより安定に保つことができる。
　さらに、希釈剤としては、ＨＰＬＣ溶離液を用いてもよい。これにより、ＨＰＬＣに導入するサンプル組成とＨＰＬＣ溶離液の組成との相違が少なくなる。そのため、ショックピーク、ピーク形状の乱れ、溶出時間の変動を抑止することができる。
（ＨＰＬＣ用サンプル）
　上記のようにして得られるＨＰＬＣ用サンプルは、酸化型ピロロキノリンキノン、還元型ピロロキノリンキノン、又はその塩とアスコルビン酸とが反応して得られた還元型ＰＱＱ又はその塩と、未反応のアスコルビン酸と、測定対象物に含まれるその他の各成分が含まれ得る。
　ＨＰＬＣ用サンプルに含まれるアスコルビン酸の含有量は、好ましくは１～４０質量％であり、より好ましくは３～２０質量％であり、さらに好ましくは３～１０質量％である。
〔分離工程〕
　分離工程は、固定相として逆相カラムを用い、移動相として、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む溶離液を用いる高速液体クロマトグラフィ法により、ＨＰＬＣ用サンプルに含まれる還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を固定相及び移動相との相互作用を利用して試料から分離する工程である。
　これにより、ＨＰＬＣ用サンプルに含まれる還元型ＰＱＱおよび酸化型ＰＱＱを、それぞれ定量することができる。また、還元工程を経る場合には、試料に含まれる還元型ＰＱＱおよび酸化型ＰＱＱの総量を定量することができる。
　なお、定量方法としては、特に制限されないが、例えば、標準添加法、内部標準法、絶対検量線法が挙げられる。また、定量法は求める精度と補正を考慮して採用すればよい。
　本実施形態において用い得る標準添加法は、常法と同様であり、例えば、酸化型ＰＱＱもしくは還元型ＰＱＱ及びその塩を検出可能な検出器を用いて、ＨＰＬＣ用サンプルのクロマトグラムを得て、当該ピークの面積に基づき予め定めた検量線から、ＨＰＬＣ用サンプルに含まれるイミダゾピロロキノリン及びその塩を定量する方法が挙げられる。検量線の作成にあっては、初めに、濃度が既知の標準溶液を予め調製し、当該標準溶液をＨＰＬＣ用サンプルに添加して、検量線作成用のサンプル群を調製する。
　本実施形態に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が挙げられる。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、および分離溶液を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器、質量分析装置が挙げられる。
（固定相）
　固定相となる分離カラムとしては、逆相カラムを用いる。逆相カラムとしては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（オクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラム）、オクチル基を導入したシリカゲルを充填したカラム（Ｃ８カラム）、エチル基を導入したシリカゲルを充填したカラム（Ｃ２カラム）、これらにイオン交換樹脂を配合したカラムが挙げられるが、特にＯＤＳカラムが好ましい。
　充填剤の粒径は、好ましくは５．０μｍ以下であり、より好ましくは１．７～５．０μｍである。充填剤の粒径が上記範囲内であることにより、分離能がより向上する傾向にある。
（移動相）
　移動相となる溶離液は、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む。このような溶離液を用いることにより、還元型ＰＱＱを安定な状態で測定することができ、また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱを分離することも可能となる。
　溶離液は、リン酸又は塩酸の一方、あるいは、リン酸及び塩酸の両方を含む。「０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸」とは、溶離液がリン酸又は塩酸の一方を含む場合にはその濃度をいい、溶離液がリン酸及び塩酸の両方を含む場合には、その総量をいう。これを踏まえて、リン酸及び／又は塩酸の濃度は、０．０５０～１．５質量％であり、好ましくは０．０８５～１．５質量％であり、より好ましくは０．１～１．５質量％であり、さらに好ましくは０．２～１質量％である。リン酸及び／又は塩酸の濃度が上記範囲内であることにより、分離能がより向上し、還元型ＰＱＱを安定な状態で測定することができ、また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱを分離することも可能となる。なお、リン酸及び塩酸に加えて、その他の酸性分を添加してもよい。
　溶離液は、メタノール又はアセトニトリルの一方、あるいは、メタノール及びアセトニトリルの両方を含む。「２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリル」とは、溶離液がメタノール又はアセトニトリルの一方を含む場合にはその濃度をいい、溶離液がメタノール及びアセトニトリルの両方を含む場合には、その総量をいう。これを踏まえて、メタノール及び／又はアセトニトリルの含有量は、２０～５０体積％であり、好ましくは２５～４５体積％であり、より好ましくは２７．５～４２．５体積％である。また、メタノール及び／又はアセトニトリルの含有量が、３０～５０体積％、３０～４５体積％、又は３０～４２．５体積％であることも好ましい。メタノール及び／又はアセトニトリルの含有量が上記範囲内であることにより、分離能がより向上し、還元型ＰＱＱを安定な状態で測定することができ、また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱを分離することも可能となる。なお、メタノール及びアセトニトリルに加えて、その他の有機溶剤を添加してもよい。
　溶離液のｐＨは、好ましくは２．８以下であり、より好ましくは２．３以下であり、さらに好ましくは２．１以下である。溶離液のｐＨが上記範囲内にあることにより、分離能がより向上し、還元型ＰＱＱを安定な状態で測定することができ、また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱを分離することも可能となる。
　溶出法としては、特に制限されないが、例えば、送液中において移動相（溶離液）の組成を変化させないアイソクラティック溶出法、及び、送液中において移動相（溶離液）の組成を変化させるグラジエント溶出法が挙げられる。溶出法は、分離能に応じて適宜選択することができる。
　本実施形態の分析方法は、ＰＱＱ定量分析において以下の利点、特徴を有する。第一に、アスコルビン酸のような還元性物質が入った場合にも酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱを検出することができる。第二に、すべてを還元型ＰＱＱとして検出することで定量計算が容易になる。また、酸化型ＰＱＱを還元型ＰＱＱに変換するアスコルビン酸は安価で安全である。
　以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
　以下に分析に用いた各試料の調製方法を記載する。なお、実施例において用いた試薬は、特に記載がない限り和光特級の試薬を用いた。ピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱瓦斯化学株式会社製ＢｉｏＰＱＱ（登録商標）を使用した。
〔実施例１：酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱ分離条件〕
（溶離液１）
　実施例１で使用した溶離液は、水とメタノールを体積比７３：２７で混合し、その混合液に対して、リン酸を０．３４質量％となるように添加したものである。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series（アジレント・テクノロジー社製）
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲2-7.5）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：２７体積％メタノール／０．３４質量％リン酸　（ｐＨ２．１）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：30min
（分析）
　ピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液（４０ｍｇ／Ｌ）とアスコルビン酸水溶液（２ｇ／Ｌ）を混合して分析サンプル１を調製した。分析サンプル１の調製から１２０分以内に、上記したＨＰＬＣ分析条件で分析操作を行った。そのクロマトグラムを図１に示す。
　また、別途、アスコルビン酸水溶液単独、十分に空気に曝して酸化型としたピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液単独をサンプルとして用いて、上記したＨＰＬＣ分析条件で分析操作を行って、それぞれクロマトグラムを得た。アスコルビン酸水溶液単独をサンプルとした場合のクロマトグラムから、アスコルビン酸の溶出時間が１．１分であることが分かった。また、十分に空気に曝したピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液単独をサンプルとした場合のクロマトグラムから、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間が１０．２分であることが分かった。
　分析サンプル１を用いて得られたクロマトグラムのなかから、アスコルビン酸と酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間に対応するピークを特定するとともに、アスコルビン酸と酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間以外のピークが還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムに由来するものであると同定した。ここで、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間は、１７．４分であった。
　さらに、上記のように同定した各成分の溶出時間が、それぞれアスコルビン酸と、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムと、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムとを示すものであることを別の観点から確認するために、上記検出器ＵＶに加えて、フォトダイオードアレイ分析により、各溶出時間におけるUV-VISの吸収を測定した。
　具体的には、HPLC分析装置で分離しながら、送液を止めることなく逆相カラムから流出する溶離液のスペクトルを測定した。溶出時間１０．２分の時のUV-VISの吸収スペクトルを図２に示し、溶出時間１７．４分の時のUV-VISの吸収スペクトルを図３に示す。
　図２では、２７０ｎｍに最大吸収を示すスペクトルが得られ、図３では、３２０ｎｍに最大吸収を示すスペクトルが得られた。このスペクトルの特徴は、これまで報告されてきた酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムと還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのスペクトルの特徴と一致した（文献（Itohら非特許文献１））。これにより、溶出時間１０．２分におけるピークが酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムに由来するものであり、溶出時間１７．４分におけるピークが還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムに由来するものであることが改めて確認できた。
〔比較例１：既存の分析方法〕
（溶離液２：ＨＰＬＣ溶離液(100mM CH3COOH/100mM CH3COONH4=30/70(pH5.1)）
　６．０ｇのＣＨ３ＣＯＯＨを蒸留水で溶解し、総量が１Ｌとなるようにメスアップして１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ（１液）を調製し、これとは別に、７．７１ｇのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を蒸留水で溶解し、総量が１Ｌとなるようにメスアップして１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（２液）を調製した。その後、３００ｍＬの１液と７００ｍＬの２液を混合して、ＨＰＬＣ溶離液を得た。なお、得られた緩衝液のｐＨが５．１±０．２であることを確認した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　送液ユニット：LC-10AD（島津製作所社製）
　逆相カラム　：YMC-Pack ODS-A
　　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液２　　：100mM CH3COOH/100mM CH3COONH4=30/70(pH5.1)
　流速　　　　：1.5mL/min、
　カラム温度　：40℃
　注入量　　　：3μL
　検出器ＵＶ　：259nm
　分析時間　　：30min
（分析）
　上記と同様にして分析サンプル１を調製した。分析サンプル１の調製から１２０分以内に、上記したＨＰＬＣ分析条件で分析操作を行い、クロマトグラムを得た。また、別途、アスコルビン酸水溶液単独、十分に空気に曝したピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液単独をサンプルとして用いて、上記したＨＰＬＣ分析条件で分析操作を行って、それぞれクロマトグラムを得た。
　アスコルビン酸水溶液単独をサンプルとした場合のクロマトグラムから、アスコルビン酸の溶出時間が１．１分であることが分かった。また、十分に空気に曝したピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液単独をサンプルとした場合のクロマトグラムから、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間が２．１分であることが分かった。
　分析サンプル１を用いて得られたクロマトグラムでは、溶出時間１．１分と２．１分の二か所においてピークが見られ、それ以上のピークは確認できなかった。この結果から、比較例１の分析条件では、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムと、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムとは分離できなかったことが確認できた。
〔実施例２～７、比較例２〕
　下記表１に示すように使用したカラムと溶離液を変更したこと以外は、実施例１の分析条件と同様にして分析を行い、分析サンプル１中の酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムと還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムが分離できるか否かを確認した。
　表１に、実施例２～７、比較例２の分析条件と、アスコルビン酸、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、及び還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
※酸化型PQQ：酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム
※還元型PQQ：還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム
　表１に示すように、溶離液のリン酸をギ酸に変更した比較例２では、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、及び還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムが分離できないことが分かった。
〔実施例８～１６：前処理工程を含む分析〕
　酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム（１００ｍｇ／Ｌ）を含む水溶液と、表2に記載の前処理液とを混合して、所定の条件で放置し（前処理工程）、各分析サンプルを調製した。得られた各分析サンプルを用いて、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析を行った。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series（アジレント・テクノロジー社製）
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲2-7.5）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：３５体積％メタノール／０．3４質量％リン酸　（ｐＨ2.1）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　分析時間　：20min
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：40min
　分析結果により得られた２５９ｎｍのクロマトグラムに基づいて、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークと還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークの総面積に対する、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピーク面積を算出し、算出した面積比率を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
※酸化型PQQ：酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム
※還元型PQQ：還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム
〔実施例１７～２７：還元型PQQの安定性〕
　酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム（１００ｍｇ／Ｌ又は５００ｍｇ／Ｌ）を含む水溶液と、表２に記載の前処理液とを混合して、５０℃で１時間放置し（前処理工程）、各分析サンプルを調製した。得られた各分析サンプルを用いて、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析を行った。24時間後以上、還元型ＰＱＱの析出を確認したあと、分析した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series（アジレント・テクノロジー社製）
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲2-7.5）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：３５体積％メタノール／０．３４質量％リン酸　（ｐＨ２．１）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：30min
　分析結果により得られた２５９ｎｍのクロマトグラムに基づいて、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークと還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークの総面積に対する、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピーク面積を算出し、算出した面積比率を還元型ＰＱＱの比率として表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
※還元型PQQヒ゜ーク面積：酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークと還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピークの総面積に対する、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムのピーク面積
※－：分析試験を実施しなかった。
　以上のとおり、実施例２５～２７によれば、還元型ピロロキノリンキノンは析出しやすく、アスコルビン酸単独では長時間保存すると分析サンプルから析出してしまう危険性があった。これに対して、実施例１７～２４に示される通り、シクロデキストリンまたは有機溶媒を使用することにより、還元型ピロロキノリンキノンを溶液中で安定化できることが分かった。
〔定量性実験１〕
　ピロロキノリンキノンジナトリウムを２０ｍｇ／Ｌ含む水溶液、ピロロキノリンキノンジナトリウムを４０ｍｇ／Ｌ含む水溶液、及びピロロキノリンキノンジナトリウムを８０ｍｇ／Ｌ含む水溶液を準備した。これら水溶液に、それぞれ、前処理液として１０質量％アスコルビン酸水溶液を混合し、常温（２３℃）で１時間放置することで、３つの分析サンプルを調製した。その後、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析を行った。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series（アジレント・テクノロジー社製）
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲1-10）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：３５体積％メタノール／４体積％アセトニトリル／０．３４質量％リン酸　（ｐＨ２．１）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：30min
　３つの分析サンプルそれぞれについて得られたクロマトグラムに基づいて、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間４．０に現れるピーク面積を算出した。この際、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間４．０に現れるピーク面積は、検出器ＵＶの２５９ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムと、３２０ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムの両方で算出した。
　２５９ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムに基づくピーク面積を縦軸とし、分析サンプルの調製において用いたピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度を横軸として、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を図4に示す。また、同様に、３２０ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムにおいても、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を図4に示す。
　直線Aは２５９ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムに基づく、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を示す直線であり、直線Bは３２０nmの波長の吸収により得られたクロマトグラムに基づく、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を示す直線である。
〔定量性実験２〕
　さらに、異なる分析条件においても定量性が確認できるか否かを確認した。まず、ピロロキノリンキノンジナトリウムを２０ｍｇ／Ｌ含む水溶液、ピロロキノリンキノンジナトリウムを４０ｍｇ／Ｌ含む水溶液、ピロロキノリンキノンジナトリウムを６０ｍｇ／Ｌ含む水溶液、及びピロロキノリンキノンジナトリウムを８０ｍｇ／Ｌ含む水溶液を準備した。これら水溶液に、それぞれ、前処理液としてアスコルビン酸２質量％及びγ－シクロデキストリン２質量％を含む水溶液を混合し、５０℃で１時間放置することで、４つの分析サンプルを調製した。その後、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析を行った。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲2-7.5）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：３５体積％メタノール／０．３４質量％リン酸　（ｐＨ２．１）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：30min
　４つの分析サンプルそれぞれについて得られたクロマトグラムに基づいて、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間９．７に現れるピーク面積を算出した。この際、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムの溶出時間９．７に現れるピーク面積は、３２０ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムで算出した。
　３２０ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムに基づくピーク面積を縦軸とし、分析サンプルの調製において用いたピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度を横軸として、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を図５に示す。
　直線は３２０ｎｍの波長の吸収により得られたクロマトグラムに基づく、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度との関係を示す直線である。
　図４～５に示されるように、ピーク面積と分析サンプル中のピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度は直線性を有しており、これらはピーク面積からピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度を求めるための良い検量線となりうることが分かった。なお、この検量線は、最小二乗法によるＲ２は０．９９９以上であり、濃度２０から８０ｍｇ／Ｌで高い相関性を維持することが確認できた。
〔実施例２８〕
　表４に示す組成を有する飲料５００ｍLを調製した。得られた飲料１ｇに対して、前処理液としてアスコルビン酸２質量％及びγ－シクロデキストリン２質量％を含む水溶液１ｇを混合し、５０℃で１時間放置することで、分析サンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　その後、得られた分析サンプルに対して、下記ＨＰＬＣ分析条件で分析を行った。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：Agilent 1100series
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲2-7.5）
　　　　　　　粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
　溶離液１　：３５体積％メタノール／０．３４質量％リン酸　（ｐＨ２．１）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：20μL
　検出器ＵＶ：259nm,320nm
　分析時間　：30min
　その結果、得られたクロマトグラムを図６に示す。本分析において、分析サンプルに含まれるピロロキノリンキノンの濃度は２１．８ｍｇ／Ｌと算出された。また、定量性試験２において求めた検量線を用いて、ピーク面積から分析サンプルに含まれるピロロキノリンキノンの濃度を算出したところ２１．６ｍｇ／Ｌと推定された。分析サンプルに実際に含まれるピロロキノリンキノンの濃度に対する、検量線により算出したピロロキノリンキノンの濃度の割合（回収率）は、９９％であった。この分析結果により、定量性に優れた結果が得られることが分かった。
〔比較例７〕
　比較例１の条件で上記の飲料を分析した。回収率は103％と算出された。また、酸化型ＰＱＱと還元型ＰＱＱの分離が完全に行われておらず、分析方法として適切でなかった。その結果を図７に示す。
〔実施例２９〕
（溶離液）
　実施例２９で使用した溶離液は、水とメタノールを体積比７０：３０で混合し、その混合液に対して、塩酸（36％塩酸＝濃塩酸）を０．４質量％となるように添加したものである。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　分析装置　：LC-20AD
　逆相カラム：ODSカラム（ｐＨ範囲1-10）
　　　　　　　粒子径5um、 内径4.6 mm×長さ150mm
　溶離液　　：３０体積％メタノール／０．１４質量％塩酸（０．４質量％濃塩酸添加）　（ｐＨ1.6）
　流速　　　：1.5mL/min
　カラム温度：40℃
　注入量　　：10μL
　検出器ＵＶ：320nm
　分析時間　：30min
（分析）
　ピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液（４０ｍｇ／Ｌ）と、前処理としてアスコルビン酸２質量％及びγ－シクロデキストリン２質量％を含む水溶液を１：１で混合して分析サンプルを調製した。分析サンプルの調製から６０分以内に、上記したＨＰＬＣ分析条件で分析操作を行った。
　図８に前処理前のPQQ水溶液（４０ｍｇ／Ｌ）のクロマトグラムを示す。PQQのピークを６．４分に検出した。また、図９に前記の前処理したPQQ水溶液の結果を示す。前処理液のアスコルビン酸は１．２分にピークを示し、還元型PQQ（２０ｍｇ／Ｌ）のピークを１８．９分に検出した。
　またHPLC分析装置で分離しながら、送液を止めることなく逆相カラムから流出する溶離液のスペクトルを測定した。図８における溶出時間６．４分の時のUV-VISの吸収スペクトルを図１０に示し、図９における溶出時間１８．９分の時のUV-VISの吸収スペクトルを図１１に示す。これにより、溶離液として塩酸を使用した場合にも酸化型と還元型PQQを分離できたことが示された。

Claims (6)

  1. 　試料から還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を含む高速液体クロマトグラフィー用サンプルを調製するサンプル調製工程と、
    　固定相として逆相カラムを用い、移動相として、０．０５０～１．５質量％のリン酸及び／又は塩酸と、２０～５０体積％のメタノール及び／又はアセトニトリルと、を含む溶離液を用いる高速液体クロマトグラフィー法により、前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノン又はその塩を前記固定相及び前記移動相との相互作用を利用して前記試料から分離する分離工程と、を有する、
    　高速液体クロマトグラフィー分析方法。
  2. 　前記溶離液のｐＨが、２．８以下である、
    　請求項１に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
  3. 　前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルが酸化型ピロロキノリンキノンをさらに含む場合において、
    　前記分離工程において、前記高速液体クロマトグラフィー用サンプルに含まれる前記還元型ピロロキノリンキノンと前記酸化型ピロロキノリンキノンとを分離する、
    　請求項１又は２に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
  4. 　サンプル調製工程の前に、前記試料に対して還元剤を添加する還元処理工程を、さらに有する、
    　請求項１又は２に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
  5. 　前記還元剤が、アスコルビン酸溶液である、
    　請求項４に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
  6. 　前記試料が飲料である、
    　請求項１～５のいずれか一項に記載の高速液体クロマトグラフィー分析方法。
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