CN105334301A - 一种吡咯并喹啉醌pqq二钠盐杂质的分离纯化方法 - Google Patents

一种吡咯并喹啉醌pqq二钠盐杂质的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，属于化学药物杂质研究技术领域。PQQ是多种氧化还原酶的辅基，对酒精性脂肪肝的预防和治疗具有显著作用，有望成为新型的肝损伤防治药物，具有良好的临床应用前景。针对药品中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。本发明将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。

Description

一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法
技术领域
一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，属于化学药物杂质研究的技术领域。
背景技术
近年来，由于环境等因素的影响，化学性肝损伤越来越多。而化学性肝损伤极易发展为肝硬化。目前在国际上尚未有明确的治疗药物，因此，急需安全有效的化学性肝损伤防治药物。
PQQ（吡咯并喹啉醌，pyrroloquinolinequinone）是多种氧化还原酶的辅基，广泛存在于动植物体内，因具有强大的清除自由基功能而在体内发挥重要作用。它能有效预防和治疗四氯化碳引起的肝损伤，对酒精性脂肪肝的预防和治疗具有显著作用，有望成为新型的肝损伤防治药物，具有良好的临床应用前景。
PQQ可以通过生物生产方法进行制备，但生物法生产及分离纯化困难且成本奇高。本公司经过优化工艺路线和工艺条件，通过化学合成的方法直接制备得到水溶性更好的PQQ二钠盐。
药品在临床使用中会产生一些不良反应，这个不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大的关系。因此，对于化学药品各个国家药典均在附录中设有专门的杂质检查通则，中国药典（ChP）二部从（2005）开始附录中设有药物杂质研究指导原则，国家食品药品监督管理局也发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》。针对药品中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。
杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。由于PQQ分子结构的特殊性，在化学合成中易引入类似结构副产物，由于其化学结构的相似性，传统的分离方法如萃取、重结晶、蒸馏和TLC都很难将其分离。分析型的HPLC只能获得μg级的产物，为了获得高纯度的PQQ二钠盐，需提取其主要杂质并进行结构确证。我们首次采用制备高效液相色谱经过优化制备分离条件、优化分析条件、考察上样载量；后处理中，由于PQQ结构的复杂性，普通的有机溶剂体系很难将其与杂质分离，由于流动相采用了特殊的试剂，使后处理也非常困难。我们通过考察样品的稳定性，如耐高温，所加盐浓度、所调pH值、并尝试用冷藏洗出办法，最终将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。相关研究国内外未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，最终将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。
本发明的技术方案：一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，步骤为：
（1）PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求；
（2）优化制备分离条件
选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用0.04M磷酸二氢铵作缓冲体系；
色谱柱的选择：选择GPC18型号的色谱柱；
流动相配比的优化：
流动相A：Buffer的配制：称取12.974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4.6g磷酸二氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7.0；用0.45μm滤膜过滤；
流动相B：乙腈ACN；
流动相A/流动相B的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好；
pH值的影响：选择pH7.0；
（3）制备柱上的分离
上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0.45μm滤膜过滤；
选择柱子：GPC18：5μm，21.2×250mm；
流动相采用：Buffer︰ACN=80～70︰20～30，v/v；
柱温：室温；
流速：20mL/min；
进样体积：10mL；
压力：1756psi；
检测波长：225nm；
（4）收集的杂质纯度鉴定
a、收集液的处理
浓缩：将制备柱得到的收集液在60℃下旋转浓缩5倍，得浓缩液；
盐析：在浓缩液中加入1.5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达到0.8-1.0M，用HCl调至pH2.0；将上述溶液在4℃下静置48h；
过滤：用0.45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次；
干燥：将带沉淀的滤膜置于40℃下真空干燥24h；
将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装；
b、样品纯度鉴定
分析柱：GPC18：5μm，4.6×250mm；
流动相：Buffer︰ACN体积比70︰30；
柱温：室温；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
检测波长：225nm；
分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产物的纯度大于95%；
（5）杂质结构鉴定
所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为C14H3N2O8ClNa2，化学名称为3-氯-1H-吡咯[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸-二钠盐。
本发明的有益效果：本发明将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。
附图说明
图1分析柱高效液相色谱图（GPC18(5μm,4.6×250mm，Buffer/ACN在80/20，1mg/mLPQQ，进样体积：10μL，流速：1mL/min，检测波长：225nm)
图2制备高效液相色谱图，(GPC18(5μm,21.2×250mm)，0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液含10%四丁基氢氧化铵（pH7.0）︰ACN=75︰25（v/v）,10mg/mLPQQ，流速：20mL/min，进样体积：10mL，检测波长：225nm)
图3PQQ杂质纯度鉴定色谱图，[GPC18(5μm，4.6×250mm)，流动相：含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液︰ACN=70︰30（v/v），1mg/mLPQQ杂质，流速：1mL/min，进样体积：20μL，检测波长：225nm]
图4PQQ杂质红外光谱图
图5PQQ杂质质谱图
图6PQQ杂质核磁氢谱图
图7PQQ杂质核磁碳谱图。
具体实施方式
实施例1.样品溶解性的考察
由于制备型液相色谱要求进样量大，样品浓度过低引起进样体积太大，高浓度的溶质超载，在分离过程中可以避免大体积引起的峰的扩张。因此，必须找到合适的溶剂达到一定的溶解度才能在制备色谱柱上有效分离，并获得一定的制备量。
分别用去离子水、甲醇、乙腈（CAN）、含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）（Buffer），Buffer/ACN(7:3)、考察PQQ在不同溶剂中的溶解度。结果见下表：
在含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）作溶剂时，PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求。
实施例2.优化制备分离条件
化学合成中的制备色谱条件一般选择参考分析柱色谱条件，再扩大到同类型的制备柱分离。对未知样品的提取和纯化，通常采用分析柱探索分离条件，然后按规模放大分离。一般情况下，制备色谱的分离度应该大于1.25，根据制备规模选择制备色谱柱、放大进样量、流速等，最后在制备色谱中再进行适当调整。
制备色谱是在非线性范围内运行，属于非线性色谱，分析色谱是线性色谱。因此许多用于分析型液相色谱的概念或参数在制备色谱中不太适用，使用这分析色谱的一些方法很容易引入歧途。常见问题是在制备色谱中很少考虑分离度、柱效和杂质峰型的对称性，在分析柱上能够与杂质分离，但放大到制备柱上，峰会产生漂移，很难达到理想的效果。
2.1分析柱分离条件优化
文献报道PQQ的分析方法有采用乙腈/水进行梯度洗脱，主峰与杂质峰不能达到有效分离，这种体系根本无法用于杂质制备。最新分析方法采用离子对色谱乙腈-四丁基溴化铵-磷酸二氢钾体系能在分析柱上将PQQ与杂质有效分离，但考虑到最终我们要进行杂质组分回收，流动相首先应使制备组分有较大的溶解度，且容易从纯化后的组分中除去，最终制备的组分必须进行质谱核磁等分析，因此流动相应尽少带入其他离子。因此我们进行了改进，选择四丁基氢氧化铵（10%水溶液）（水溶性好于四丁基溴化铵，而且少引入溴离子）作为离子对试剂，相对应的我们选用磷酸二氢铵作缓冲体系（少引入钾离子）。在此条件下我们在分析柱上探索最佳分离条件。与文献方法相比，我们的目的是要制备得到杂质，因此更要关注杂质峰的峰型和对称性，这是一个重大的挑战。
2.1.1色谱柱的选择
我们选择不同基质键合的C18柱（SepaxHP、Amethyst-P、GPC18等）试验。与SepaxHP、Amethyst-P柱相比，经优化键合的GPC18填料硅羟基表面覆盖度更高而使色谱保留更强，分离度更佳，杂质峰的对称性更好。采用文献方法的Amethyst-P柱虽然在分析柱上可以与杂质分离，但放大到制备柱上很难制备得到纯度较高的杂质。因此我们最终选择GPC18这个型号的色谱柱。
在GPC18(5μm，4.6×250mm)进行分离条件优化：
2.1.2流动相配比的优化
流动相A（Buffer）的配制：称取12.974g四丁基氢氧化铵水溶液（10%），4.6g磷酸二氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7.0。0.45μm滤膜过滤。
流动相B：乙腈（ACN）。
Buffer/ACN在80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好。
2.1.3pH值的影响
离子对试剂对pH值比较敏感，因为pH值影响溶质的离子化程度，影响溶质的保留。在某一pH值范围内溶质分子和配对离子都处于离子状态，容易生成离子对，此时保留值最大。本发明选择pH7.0时，PQQ与杂质能有效分离，而且杂质峰型较好，与文献方法pH2.5~3.0相比，本试验的条件下柱效高，寿命长。色谱图见图1。
实施例3制备柱上的分离
由于本试验是要获得含量极低、价值高、难分离的杂质。因此采用小颗粒（5μm）大内径的柱子，通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。由于PQQ分子的特殊性，在逐步放大的过程中发生分离曲线的变化，我们最终选择柱子：GPC18（5μm，21.2×250mm），流动相稍作调整采用：含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）︰ACN=75︰25（v/v）；柱温：室温；流速：20mL/min；进样体积：10mL；压力:1756psi；检测波长：225nm。
3.1流速的选择
制备产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。由于我们采用的是小颗粒的柱子，过大的流速会造成柱压过高。最终我们选择流速:20mL/min，压力：1756psi，达到了理想的分离效果。
3.2上样量
上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液。0.45μm滤膜过滤。
制备高效液相色谱的产率和上样载量有关，但样品的容量和柱横截面有关，超过上样载量后会降低分辨率，影响制备产物的纯度。
10mg/mL的PQQ溶液，当进样体积大于10mL时，分辨率下降，所收集的组分含量降低，最终我们进样量选择10mL。色谱图见图2。
(GPC18(5μm，21.2×250mm)，含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）︰ACN=75︰25（v/v）,流速：20mL/min，进样体积：10mL)
实施例4.纯度鉴定
收集后的样品组分有机溶剂一般采用热的氮气流吹或者旋转蒸发方式除去，水分采用冷冻干燥除去。本试验由于PQQ结构的特殊性，普通的有机溶剂方法除流动相很难达到分离制备的目的，由于流动相采用了特殊的试剂给产品的回收造成了极大的困难。本试验采用探索了多种回收方法。最终处理方法如下：
4.1收集液的处理
浓缩：将制备柱得到的收集液在60℃下旋转浓缩5倍左右，得浓缩液；
盐析：在浓缩液中加入1.5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达到0.8-1.0M，用HCl调至pH2.0。将上述溶液在4℃下静置48h；
过滤：用0.45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出。再次用去离子水洗涤沉淀2次；
干燥：将带沉淀的滤膜置于40℃下真空干燥24h；
将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重。包装。
4.2样品纯度鉴定
分析柱：GPC18(5μm，4.6×250mm)；
流动相：含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液︰ACN=70︰30（v/v）；柱温：室温；流速：1mL/min；进样体积：20μL；检测波长：225nm。
分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备杂质为目标杂质。所制备产物的纯度大于95%（归一法）。
实施例5杂质结构鉴定
所收集的杂质组分采用质谱（MS）/高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称。
确证化学结构的方法
本品为PQQ中间体杂质，按PQQ最后一步的合成方法（在NaOH/NaCl/THF下反应脱酯成羧酸，再调pH3.0得到其二钠盐），其氢谱中除活泼质子外，只观察到1个不饱和质子，结合其化学位移值，其3-位烯H消失；碳谱中也只观察到1个不饱和叔C，而总的C数还是14个；质谱(ESI-)中，得到m/z363的准分子离子峰（不含Na离子），比PQQ多34，同时观察到明显的M+2峰，峰强度约为M峰的1/3，结合这二点，确定此产物为其3-位质子被氯原子(Cl)取代；高分辨质谱(ESI-)测得其合理的分子式为C14H5N2O8Cl（不含Na离子形式），再结合其工艺过程，应为其二钠盐形式，即本品的分子式为C14H3N2O8ClNa2，即为3-氯-1H-吡咯[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸-二钠盐；其结构式如下：
详细结果如下：
5.1质谱（MS）/高分辨质谱（HRMS）：仪器：Agilent1260-6230TOFLC-MS质谱仪，溶剂：甲醇，离子化方式：ESI(-)，120V，质谱数据见表1
表1.PQQ杂质样品的质谱测定结果
5.2红外吸收光谱（IR）
仪器：BrukerTENSOR27型红外光谱仪，方法：KBr压片法，PQQ杂质样品的红外吸收光谱测试数据见表2
表2PQQ杂质样品的红外吸收光谱测定结果
5.3核磁共振谱（NMR），仪器：BRUKERAV-600型核磁共振仪，溶剂：DMSO-d6，温度：303K，内标：TMS；
测试数据见表3、表4。
表3.PQQ杂质样品的氢谱测定结果
表4.PQQ杂质样品的碳谱测定结果

Claims (1)

1.一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，其特征在于步骤为：
（1）PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求；
（2）优化制备分离条件
选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用0.04M磷酸二氢铵作缓冲体系；
色谱柱的选择：选择GPC18型号的色谱柱；
流动相配比的优化：
流动相A：Buffer的配制：称取12.974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4.6g磷酸二氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7.0；用0.45μm滤膜过滤；
流动相B：乙腈ACN；
流动相A/流动相B的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好；
pH值的影响：选择pH7.0；
（3）制备柱上的分离
上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0.45μm滤膜过滤；
选择柱子：GPC18：5μm，21.2×250mm；
流动相采用：Buffer︰ACN=80～70︰20～30，v/v；
柱温：室温；
流速：20mL/min；
进样体积：10mL；
压力：1756psi；
检测波长：225nm；
（4）收集的杂质纯度鉴定
a、收集液的处理
浓缩：将制备柱得到的收集液在60℃下旋转浓缩5倍，得浓缩液；
盐析：在浓缩液中加入1.5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达到0.8-1.0M，用HCl调至pH2.0；将上述溶液在4℃下静置48h；
过滤：用0.45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次；
干燥：将带沉淀的滤膜置于40℃下真空干燥24h；
将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装；
b、样品纯度鉴定
分析柱：GPC18：5μm，4.6×250mm
流动相：Buffer︰ACN体积比70︰30；
柱温：室温；
流速:1mL/min；
进样体积：20μL；
检测波长：225nm；
分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产物的纯度大于95%；
（5）杂质结构鉴定
所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为C14H3N2O8ClNa2，化学名称为3-氯-1H-吡咯[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸-二钠盐。
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