CN107383032B - 用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤：(1)检测缴获海洛因样品中盐酸海洛因的纯度，选择盐酸海洛因质量分数大于或等于60wt％的缴获海洛因样品作为纯化制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的原料；(2)利用高效液相色谱制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质。本发明制备纯化方法得到的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐经核磁共振、液相色谱‑串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

Description

用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐 标准物质的纯化制备方法

技术领域

本发明涉及法庭科学毒品标准品的制备。更具体地，涉及一种用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法。

背景技术

目前，日趋严重的毒品问题已成为全球性的灾难。毒品的泛滥直接危害人民的身心健康，并给经济发展和社会进步带来巨大威胁。因此，建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，提高毒品成份量测量技术，保证测量结果的可靠性和可比性，建立测量数据的共享与互认，为法庭提供准确可靠的证据，已成为世界各国毒品鉴定机构普遍关注的问题。

毒品成份量测量技术及溯源性保障是一个有机的整体，是核心测量能力在法庭科学毒品成份量测量领域的重要体现。标准物质是贯穿于这个整体的骨架，是量值的载体，是毒品成份量溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上的准确性和可比性的重要基础，是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。

欧美等国家技术先进的毒品检测实验室大多采用Sigma等公司生产的国际上公认的标准物质，但在我国只能依赖进口的标准物质，量少价高，有许多还不能向中国提供。目前国内毒品分析中使用的“对照品”不仅种类极为有限，而且普遍缺乏完善的结构鉴定、纯度测定、均匀性和稳定性等相应的技术指标。这些都给涉毒案件检测带来一定的不确定性，直接影响到定量结果的准确性。而且，国内毒品标准物质的匮乏，已经成为制约我国实现法庭科学毒品检测化学测量方法标准化、测量结果的溯源和互认的主要障碍。因此，能够制备出用于法庭科学毒品检测的毒品标准物质已经成为我国毒品研究领域亟需解决的问题。

海洛因的理化性质，海洛因又称：二乙酰吗啡，英文通用名称：Heroin，Diacetylmorphine，Diamorphine，Acetomorphine；英文名称： 5α,6α-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan-3,6-diol diacetate；分子式：C₂₁H₂₃NO₅·HCl·H₂O，分子量：423.89，CAS登记号： 1502-95-0；结构式为：

理化性质：海洛因为白色粉末，微溶于水，易溶于有机溶剂，盐酸海洛因易溶于水，其溶液无色透明。海洛因进入人体后，首先被水解为单乙酰吗啡，然后再进一步水解成吗啡而起作用。盐酸盐229-233℃。

吗啡的理化性质，英文通用名称：Morphine；化学名称：17-甲基-3-羟基 -4,5α-环氧-7,8-二脱氢吗啡喃；英文名称：

(5α,6α)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan-3,6-diol 7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan-3,6-diol；分子式：C₁₇H₁₉NO₃，分子量：285.34。CA登记号：57-27-2(free base),6009-81-0(monohydrate) 结构式为：

理化性质:白色有丝光针状晶体或结晶粉末。无臭。味苦。有毒，遇光易变质。易溶于水，溶于热乙醇、甘油，不溶于氯仿或乙醚。熔点254℃(碱)。相对密度1.32。旋光度-132°(甲醇)。1g溶于水5000ml、乙醇210ml、沸腾甲醇10ml，不溶于氯仿或乙醚。完全溶于稀碱溶液。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法，包括如下步骤： (1)检测缴获海洛因样品中盐酸海洛因的纯度，选择盐酸海洛因质量分数大于或等于60wt％的缴获海洛因样品作为纯化制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的原料；(2)利用高效液相色谱制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质。

本发明的有益效果如下：

本发明制备纯化方法得到的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐晶体中，按照高效液相色谱峰面积归一化法计算吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐纯度大于或等于99.1％。

本发明制备纯化方法得到的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐经核磁共振、液相色谱-串联质谱联用、红外光谱分析确认，其纯度经液相色谱、气相色谱确认定值，并对色谱无响应杂质进行测定；根据标准物质研制要求，其稳定性、均匀性、定值、总不确定度的估计均符合相关规定，达到预期指标。

本发明的制备纯化方法可为我国司法鉴定部门提供量值准确、可溯源的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质，填补我国法庭科学领域毒品标准物质空白，以改进分析测量质量，提高定量结果的准确度，最大程度地保证测量结果的有效性。有助于建立法庭科学毒品检测量值溯源体系，有利于实现国内法庭科学毒品检测化学测量方法标准化，实现测量结果的可靠、有效和互认。

克服了现有技术制备纯化方法得到的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐样品存在的纯度低、稳定性差、均匀性差、制备过程复杂等缺陷，提供了一种利用高效液相色谱分离法获得高纯度、高稳定性、回收率高、便于规模化生产的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质制备方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1-1海洛因样品中吗啡的紫外光谱图；图1-2海洛因样品中可待因的紫外光谱图；图1-3海洛因样品中O³-单乙酰吗啡的紫外光谱图；图1-4海洛因样品中O⁶-单乙酰吗啡的紫外光谱图；图1-5海洛因样品中乙酰可待因的紫外光谱图；图1-6海洛因的紫外光谱图；

图2海洛因样品反相HPLC色谱图(V_甲醇：V_{0.05％三氟乙酸/水}＝23:77)：1＝吗啡； 2＝可待因；3＝O³-单乙酰吗啡；4＝O⁶-单乙酰吗啡；5＝乙酰可待因；6＝海洛因；

图3海洛因样品正相HPLC色谱图(V_正己烷：V_四氢呋喃：V_{0.75％二乙胺/甲醇}＝75:20:5) 1＝乙酰可待因；2＝海洛因；3＝单乙酰吗啡；

图4海洛因样品正相HPLC色谱图(V_正己烷：V_异丙醇：V_{0.75％二乙胺/甲醇}＝75:20:5) 1＝乙酰可待因；2＝海洛因；3＝O⁶-单乙酰吗啡；

图5海洛因样品反相制备HPLC色谱图(V_甲醇：V_{0.05％三氟乙酸/水}＝20:80) 1＝吗啡；2＝可待因；3＝O³-单乙酰吗啡；4＝O⁶-单乙酰吗啡；5＝乙酰可待因与海洛因混合组分；

图6海洛因样品正相制备HPLC色谱图(V_正己烷：V_四氢呋喃：V_甲醇＝60:32:8) 1＝乙酰可待因；2＝海洛因；

图7海洛因样品正相制备HPLC色谱图(V_正己烷：V_异丙醇：V_甲醇＝65:28:7) 1＝乙酰可待因；2＝海洛因；

图8海洛因的反相HPLC色谱图(V_甲醇：V_{0.05％TFA/水}＝23:77)；

图9海洛因盐酸盐的¹H NMR谱图；图10海洛因盐酸盐的¹³C NMR谱图；

图11海洛因馏分的红外光谱图；图12海洛因的质谱图；

图13吗啡的紫外光谱图；

图14-1海洛因水解液HPLC色谱图及局部放大图(V_甲醇：V_{甲酸-三乙胺-水}(1.5: 0.5:63)＝15:85，甲酸-三乙胺-水混合体系中V_甲酸：V_三乙胺：V_水＝1.5:0.5:63，检测波长：285nm)：1＝吗啡；2＝可待因；

图14-2图14-1局部放大图；

图15-1海洛因水解液HPLC色谱图及局部放大图(V_甲醇：V_{0.05％TFA/水}＝15:85，检测波长：210nm)：1＝吗啡；2＝可待因；

图15-2图15-1局部放大图；

图16-1海洛因水解液HPLC色谱图及局部放大图(V_甲醇：V_{0.05％TFA/水}＝5:95，检测波长：210nm)；

图16-2图16-1局部放大图；图17吗啡馏分分离制备HPLC色谱图(V_甲醇： V_{0.05％TFA/水}＝20:80)；图18-1吗啡与TFA反应产物的总离子流图；图18-2吗啡与TFA反应产物的质谱图；图18-3吗啡与TFA反应产物的结构图；图18-4海洛因的结构图；图19吗啡制备液相色谱图(甲醇：0.5％乙酸/水＝12:88)；

图20吗啡、海洛因纯度标准物质及溶液标准物质制备工艺流程；

图21盐酸吗啡的1H NMR谱图；图22盐酸吗啡的13C NMR谱图；图23吗啡的红外谱图；图24吗啡质谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例是利用案件鉴定后剩余的海洛因样本，对利用制备液相色谱法分离纯化制备海洛因的实验条件进行了优化筛选。

一、仪器、试剂及材料

1.1主要仪器

分析型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-20AD高压输液泵；SIL-10A 自动进样器；SPD-20A二极管阵列检测器；CTO-20A柱温箱。

制备型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-8A高压输液泵；SIL-10AP 自动进样器；SPD-M20A二极管阵列检测器；FRC-10A自动馏分收集器；CBM-20A 系统控制器。

BUCHI旋转蒸发器(日本BUCHI公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；飞鸽牌TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；XS105 Dual Range电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2主要试剂及材料

甲醇、正己烷、四氢呋喃、异丙醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，二乙胺(色谱纯，美国ACROS Organics公司)，三氟乙酸(色谱纯，中国百灵威公司)，超纯水(经Millipore超纯水制备系统净化，法国Millipore 公司)。

海洛因1mg/mL标准溶液(中国百灵威公司)、O³-单乙酰吗啡氨基磺酸盐对照品、O⁶-单乙酰吗啡盐酸盐对照品、吗啡盐酸盐对照品、乙酰可待因盐酸盐对照品、可待因磷酸盐对照品均由公安部物证鉴定中心提供。

海洛因样品(灰白色粉末)由案件缴获并应用于本研究中。

二、海洛因样品中海洛因纯度的检测及利用海洛因样品纯化制备海洛因标准物质

2.1样品溶液的制备

分析型：1.0mg海洛因样品溶于1mL乙腈中，配成1.0mg/mL海洛因样品溶液用于定性及定量分析，使用前样品溶液经过0.45μm微孔滤膜过滤。

制备型：500mg海洛因样品先溶于1mL甲醇中，然后加入4mL异丙醇，配成100mg/mL海洛因样品溶液用于制备型高效液相色谱分离制备海洛因标准品。样品溶液均超声溶解5min，并经过0.45μm微孔滤膜过滤。

2.2液相色谱条件

2.2.1反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法:

色谱柱为Shim-pack HRC-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)；流动相为甲醇：0.05％三氟乙酸/水＝23:77(体积比，0.05％三氟乙酸/水是指三氟乙酸体积分数为0.05％的三氟乙酸水溶液，下同)，等度洗脱；紫外检测波长 210nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。

2.2.2正相高效液相色谱(NP-HPLC)分析方法:

色谱柱为Inertsil SIL-100A正相柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)；流动相为正己烷：四氢呋喃：0.75％二乙胺/甲醇＝75:20:5(体积比，0.75％二乙胺/甲醇是指二乙胺体积分数为0.75％的二乙胺甲醇溶液，下同)或者正己烷：异丙醇：0.75％二乙胺/甲醇＝75:20:5(体积比)，等度洗脱；紫外检测波长210 nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。

2.2.3反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备方法:

色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱(250mm×20mm I.D.，15μm)；流动相为甲醇：0.05％三氟乙酸/水＝20:80(体积比)，等度洗脱；紫外检测波长210nm；流速20mL/min；上样量200μL；柱温为室温。

2.2.4正相高效液相色谱(NP-HPLC)制备方法:

色谱柱为SIL-100A正相柱(250mm×10mm I.D.，5μm)；流动相为正己烷：四氢呋喃：甲醇＝60:32:8(体积比)或者正己烷：异丙醇：甲醇＝65:28:7 (体积比)，等度洗脱；紫外检测波长210nm；流速分别为8mL/min和10mL/min；上样量300μL；柱温为室温。

2.3高效液相色谱分析条件的优化

2.3.1色谱柱的选择

采用两种色谱柱对海洛因样品进行了分析：反相色谱柱采用的是 Shim-pack VP-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)，正相色谱柱采用的是Inertsil SIL-100A柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)。

2.3.2检测波长的选择

海洛因样品中的主要组分有海洛因、乙酰可待因、O³-单乙酰吗啡、O⁶-单乙酰吗啡、可待因和吗啡等。经过HPLC-DAD分析，在190-500nm范围内，各种物质在210nm左右均有较强的紫外吸收，如图1-1至图1-6所示，所以选择检测波长为210nm。

2.3.3流动相体系的选择

分别考察了甲醇-水、甲醇-甲酸/水、甲醇-乙酸/水以及甲醇-三氟乙酸 (TFA)/水体系。其中前三种体系均不能够使海洛因样品中的各组分达到有效的分离，而甲醇-TFA/水体系对海洛因样品中的各组分的分离效果较好。最终，甲醇：0.05％TFA/水＝23:77(体积比)的流动相体系被用来分析海洛因样品中的各组分，色谱图如图2所示。

关于正相色谱流动相体系的选择，正己烷：二氯甲烷：0.75％二乙胺/甲醇＝75:20:5(体积比，0.75％二乙胺/甲醇是指二乙胺体积分数为0.75％的二乙胺甲醇溶液，下同)体系虽可用来分析海洛因样品中的各组分，但是考虑到二氯甲烷的截止波长为245nm，而海洛因样品的最佳检测波长为210nm，所以以四氢呋喃和异丙醇两种截止波长均为210nm的溶剂来替换二氯甲烷作为流动相。正己烷：四氢呋喃：0.75％二乙胺/甲醇＝75:20:5(体积比)体系色谱图如图3所示，正己烷：异丙醇：0.75％二乙胺/甲醇＝75:20:5(体积比)体系色谱图如图4所示。

2.4标准曲线和线性关系

用色谱乙腈稀释海洛因标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、 100、200、500、1000μg/mL的海洛因对照品溶液，按2.2.1中的反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录海洛因色谱峰面积，以对照品的进样浓度(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程。

表1海洛因的浓度与峰面积

以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝18.50+31.74X，R²＝0.9999……………………

表明海洛因在10～1000μg/mL的范围内线性关系良好。

2.5样品中海洛因含量的测定

按2.2.1中的反相色谱方法分析测定浓度为1.0mg/mL的海洛因样品溶液，重复测定3次，记录海洛因峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算样品中的海洛因含量。

表2样品中海洛因含量的测定结果

由表2可知，通过峰面积外标法由标准曲线方程计算得到1.0mg/mL的海洛因样品溶液中盐酸海洛因的含量为0.8675mg/mL，进而求得海洛因样品中盐酸海洛因的纯度为86.75wt％。

2.6高效液相色谱制备条件的优化

采用反相或正相制备型高效液相色谱方法分离海洛因样品中的海洛因组分，经过考察最终选定了2.2.4中的方法。虽然在分析型高效液相色谱中，海洛因能够与样品中的其他组分达到良好分离，如图2所示；可是在制备型高效液相色谱中，海洛因并不能与海洛因样品中的乙酰可待因达到有效分离，如图 5所示。并且，收集得到的含有海洛因组分的流动相经过旋蒸后，检测到含有大量的单乙酰吗啡和吗啡，说明大部分的海洛因已发生水解。综上所述，证明海洛因不适合用反相制备型高效液相色谱的方法进行分离制备。

实验表明：在正相分析型高效液相色谱条件下，海洛因能够与样品中的其他组分实现分离，这提供了用正相高效液相色谱方法分离制备海洛因的可能性，而色谱柱则是正相硅胶制备柱。选择正己烷-四氢呋喃-甲醇以及正己烷- 异丙醇-甲醇两种体系(二乙胺从流动相体系中去掉，以防止海洛因的水解) 来考察对海洛因样品中海洛因组分的分离效果，这两种流动相体系中溶剂的截止波长均符合要求，且沸点均较低，收集得到的海洛因馏分中的溶剂能够在较低的温度下通过减压旋转蒸发除去，从而得到需要的组分。

首先，考察了正己烷-四氢呋喃-甲醇体系(图6)，虽然在制备液相上海洛因与样品中的其他组分达到了较好的分离,但是通过GC-MS分析收集到的海洛因馏分，大量的其他组分也同时被检测出来，并且不能通过旋转蒸发除去。经过调查，发现这些杂质组分来自作为流动相的四氢呋喃，确切的说是来自四氢呋喃中的抗氧化剂以及四氢呋喃的氧化产物(四氢呋喃在空气中容易被氧化，所以有些溶剂中加入了抗氧化剂以防止四氢呋喃的氧化反应)，这一结论也通过对四氢呋喃溶剂的GC-MS分析得到证实。于是，又采用了不含抗氧化剂的四氢呋喃溶剂作流动相进行实验，通过GC-MS分析收集到的海洛因馏分，抗氧化剂已经检测不到，不过仍然有少量的四氢呋喃氧化产物存在，但是可以通过旋转蒸发的途径除掉。于是推测通过减压旋蒸应该就可以得到纯的海洛因固体了，然而在旋蒸的过程中却发生了有趣的现象。起初，旋蒸进行的很快，白色的海洛因晶体也随之析出，随着旋蒸的继续进行，析出的海洛因晶体又重新溶解在剩余的溶剂中，最终当溶剂全部蒸干后，得到的是一种黄色粘稠状的产物，而通过GC-MS分析这种物质同样是海洛因。经过进一步的研究，这是由于在海洛因样品中海洛因是以海洛因盐酸盐(heroin·HCl)的形式存在的，在旋蒸初期海洛因以晶体的形式也就是盐酸盐的形式析出，然而随着旋蒸的进行，有越来越多的四氢呋喃氧化产物生成，而生成的氧化产物在加热的条件下又与海洛因盐酸盐作用，从而改变了海洛因的性状，最终得到的海洛因不是以盐酸盐形式存在的晶体，而是失去HCl的海洛因碱。综上所述，该体系虽然能够从海洛因样品中分离得到海洛因，可是并不能够得到海洛因盐酸盐晶体。

然后，又考察了正己烷-异丙醇-甲醇体系，从分析型的高效液相色谱图中可以看出海洛因虽然可以与单乙酰吗啡分开，但是并不能达到完全分离，同时考虑到制备液相的分离度会有所下降，所以分离得到的海洛因组分中会有部分的单乙酰吗啡是在所难免的。不过由于单乙酰吗啡在此海洛因样品中的含量较低，分离得到的含有少量单乙酰吗啡的海洛因组分可以通过加试剂析出结晶的方法进一步分离纯化，从而得到纯度较高的海洛因。起初采用了与正己烷-四氢呋喃-甲醇体系完全相同的色谱条件，即流动相组成为正己烷：异丙醇：甲醇＝60:32:8(体积比)且流速为8mL/min，然而在该色谱条件下海洛因与乙酰可待因不能达到很好的分离。于是，改变了色谱条件，将异丙醇与甲醇的比例降低且流速增大，从而使海洛因与乙酰可待因之间的分离度变大，最终经过优化后的色谱条件为正己烷：异丙醇：甲醇＝65:28:7(体积比)且流速为10 mL/min。从图7中可以看出，海洛因与乙酰可待因达到了很好的分离。最终，将收集得到的海洛因组分减压旋蒸，从180mg海洛因样品(含盐酸海洛因 156.15mg)中分离得到了含有少量单乙酰吗啡的灰白色海洛因固体粉末140.7mg，经过高效液相色谱峰面积归一化法计算海洛因纯度为99.13％。

2.7海洛因组分的进一步纯化

为了得到高纯度的白色海洛因晶体，同时进一步除去微量的杂质(如单乙酰吗啡)，经制备液相分离得到的海洛因采用加试剂析出结晶方法进一步纯化。异丙醇-甲醇(异丙醇和甲醇的体积比为50:1，v/v)和正己烷分别用作反溶剂和盐析剂。经过该方法的进一步纯化，最终得到了白色海洛因晶体，且其纯度由99.13％提高到99.52％，其分析型高效液相色谱图如图8所示。

虽然已经建立了海洛因的正相液相色谱制备方法，但由于在制备过程中，要消耗大量的有机溶剂，不止对实验者本人健康造成威胁，也是对实验室环境条件的污染，同时，色谱纯有机溶剂的价格较高，也导致了制备成本的增加，因此对海洛因的合成工艺进行了探讨和优化。

鉴于吗啡乙酰化生成海洛因的反应，一般是加入过量的醋酸酐，在加热回流的反应条件下进行，因此实验分别对醋酸酐加用量及衍生化时间、加热温度进行了考察，实验中发现，当加入体积比1：1的醋酸酐时，反应不完全，而加入过多的醋酸酐反应又会向反方向进行，先反应完全生成海洛因，但很快海洛因发生水解形成单乙酰吗啡，说明海洛因的合成过程是可逆的。并且在实验中还发现，即使加入适量的醋酸酐，若反应时间过长，海洛因也会发生水解，并且随时间的延长，水解程度加大。因此，实验最终确定加入1.5倍体积的醋酸酐，100℃加热1.5h，以活性炭脱色，制备海洛因盐酸盐。

干燥后获得的海洛因标准物质通常要经过脱水取出从空气中吸附的水分及残留溶剂，实验证明，海洛因盐酸盐经过烘箱105℃加热后会导致海洛因水解使纯度降低，因此采用真空干燥箱室温下干燥。

2.8海洛因标准物质的结构确证

2.8.1核磁共振分析

为了确定制备液相分离所得到的化合物的结构，进行了核磁共振分析。谱图见图9-图10。

溶剂：CD₃OD

位置	化学位移<sup>13</sup>C	化学位移<sup>1</sup>H	氢谱裂分
				1	151.434
2	134.462
				3	124.938	6.87	d
4	121.652	6.75	d
				5	130.610
6	131.184
				7	34.205	2.36；2.11	dd；dd
8	62.778	4.21	m
				9	40.229	3.15	s
10	43.017
				11	89.512	5.22	s
12	69.153	5.22	s
				13	132.255	5.76	d
14	127.168	5.52	d
				15	23.060	3.32；2.96	d；d
16	49.112	3.35；3.05	m；m
				17	42.119	3.03	s
18	170.563
				19	20.839	2.25	s
20	172.417
				21	20.962	2.10	s

2.8.2红外光谱分析

如图11所示为制备液相分离得到的海洛因的红外光谱图，从图11中可以看到海洛因在3439、2954、2630、1762、1737、1446、1370、1245、1217、1178、 1157、1037cm-1波数下有吸收峰，通过与美国Bio-Rad/Sadtler实验室红外谱库的红外光谱数据对比可知，分离得到的产物为海洛因盐酸盐而非海洛因游离体。

2.8.3液相色谱-串联质谱联用法

在Agilent LC-MS/MS 6410仪上测定了海洛因的质谱。在ESI正离子模式下，破碎电压135V，碰撞能20eV，样品的质谱图如图12所示。

从质谱图中可以得到下列信息：

(1)准分子离子峰[M+H]+的m/z370.20，与海洛因的相对分子质量 369.4g/mol相差1，因而检测样品的分子量与海洛因的相符。

(2)准分子离子峰[M+H]+的m/z370.20与相邻峰m/z328.20相差42，丢失的碎片可能是CH₃CO。

2.9海洛因定值结果表达

经HPLC以及GC方法定值分析，盐酸海洛因标准物质纯度为99.29％，扩展不确定度为0.14％(k＝2)。均匀性良好，稳定性至少1年以上。

实施例2

本实施例主要是将案件鉴定后剩余的海洛因样本进行水解，使用制备型高效液相色谱，以甲醇-0.05％三氟乙酸水溶液流动相体系或甲醇-0.5％乙酸水溶液流动相体系，从海洛因水解液中分离得到吗啡，经进一步处理，得到盐酸吗啡和吗啡，对利用制备液相色谱法分离纯化制备吗啡的实验条件进行了优化筛选。

一、仪器、试剂及材料

1.1主要仪器

分析型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-20AD高压输液泵；SIL-10A 自动进样器；SPD-20A二极管阵列检测器；CTO-20A柱温箱。

制备型高效液相色谱仪(Agilent)，包括：G1361A高压输液泵；G2260A 自动进样器；G1315D二极管阵列检测器；G1364B自动馏分收集器。

制备型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括：LC-8A高压输液泵；SIL-10AP 自动进样器；SPD-M20A二极管阵列检测器；FRC-10A自动馏分收集器；CBM-20A 系统控制器。

BUCHI旋转蒸发器(日本BUCHI公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；飞鸽牌TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)； XS105Dual Range电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2主要试剂及材料

甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)，三氟乙酸(色谱纯，中国百灵威公司)，超纯水(经Millipore超纯水制备系统净化，法国Millipore 公司)。吗啡1mg/mL标准溶液(中国百灵威公司)。海洛因样品(灰白色粉末)，由案件缴获并应用于本研究中。

二、检测海洛因水解液中的吗啡含量并纯化制备吗啡碱和吗啡盐酸盐

2.1样品溶液的制备

称取海洛因样本，加水溶解，加入6mol/L盐酸溶液，调节pH至小于2， 90℃下加热2小时水解，放置过夜，经HPLC分析海洛因和乙酰可待因全部水解完全后，配成饱和溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，用于HPLC分析及制备。

2.2液相色谱条件

2.2.1反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法:

色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)；流动相为甲醇：0.05％三氟乙酸/水＝15:85(体积比)，等度洗脱；紫外检测波长 210nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。

2.2.2反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备方法:

色谱条件一：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱(250mm×20mm I.D.， 5μm)；流动相由A相和B相组成，A相为0.05％三氟乙酸/水，B相为甲醇，梯度洗脱条件以B相为例进行说明：0-5min 20％，5-15min 20％-60％，15-20 min 60％，20-30min 20％；紫外检测波长210nm；流速9mL/min；上样量1000 μL；柱温为室温。自动馏分收集器收集吗啡组分。

色谱条件二：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱(250mm×20mm I.D.， 15μm)；流动相为甲醇：0.5％乙酸/水＝12:88(体积比)，等度洗脱；紫外检测波长210nm；流速10mL/min；上样量900μL；柱温为室温。

2.3高效液相色谱分析条件的优化

2.3.1色谱柱的选择

本实验采用的反相色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(250mm×4.6mm I.D.， 5μm)。

2.3.2检测波长的选择

经过HPLC-DAD分析，在190-500nm范围内，吗啡及其水液中的杂质成分在210nm左右均有较强的紫外吸收，所以选择检测波长为210nm。

2.3.3流动相体系的选择

吗啡为生物碱类化合物，而一般生物碱的测定多采用离子对试剂。这是因为生物碱均具有不同程度的碱性，在酸性流动相中以离子形式存在，会与反相色谱柱中未与C₁₈烷基键合的残留的硅醇基结合，引起谱带展宽，造成峰的拖尾；而在碱性流动相中，生物碱会以分子形式存在，但碱性条件会对色谱柱造成伤害。采用离子对试剂，在酸性条件下，离子形式的生物碱会与离子对试剂结合生成不带电荷的离子对，从而免受硅醇基的影响，达到理想的分离。可是，离子对试剂同样也比较容易对色谱柱造成损害，减少色谱柱的使用寿命，在采用其他流动相体系能够达到分离效果的前提下应该尽量避免使用，本实施例研究了其他的流动相体系对吗啡及其杂质的分离效果(缓冲盐体系因为对色谱柱也能造成一定程度的损害，也被排除在考虑范围外)。

当采用甲醇-水、甲醇-甲酸/水、甲醇-乙酸/水流动相体系时，均不能使海洛因水解液中的吗啡及其相邻组分达到有效的分离，且吗啡的出峰时间明显靠前，不能达到分离的目的。于是采用了甲醇：甲酸-三乙胺-水(甲酸-三乙胺-水三者体积比1.5:0.5:63)＝15:85(体积比)体系，从而达到了较好的分离(如图14-1和图14-2所示)，原因可能是三乙胺的加入掩蔽了反相固定相表面的硅醇基，从而改善了峰形，同时增大了流动相的pH，抑制了吗啡和可待因生物碱的解离，增加了与反相固定相的疏水作用，使容量因子k′增大，保留时间延长，从而分离度增大。另外，还考察了甲醇-三氟乙酸(TFA)/水体系，同样获得了较好的分离效果(如图15-1和图15-2所示)，原因可能是TFA 具有一定的离子对效应。对比以上两个体系，因为甲酸的加入使得在吗啡和可待因在最大吸收波长210nm时基线噪音变大，故选择了285nm的检测波长，从而使样品的响应值降低，从而降低了检测的灵敏度，而TFA的加入则不存在此问题，在210nm检测波长下基线平稳，所以最终选择了甲醇-三氟乙酸(TFA) /水体系来对样品进行分析。

虽然已经建立了吗啡样品的高效液相色谱分析条件，流动相采用甲醇 --0.05％三氟乙酸水体系(体积比15:85)，获得了满意的分离效果。但为了进一步提高吗啡标准物质制备产物的纯度，需要对测试和定值方法做进一步的改进，实验发现，当逐渐降低流动相中甲醇的比例时，吗啡的出峰时间延长，但同时在一些原料样品的水解液中能够分离出更多含量极低的杂质成分，经过进一步的实验，最终确定流动相组成为甲醇-0.05％三氟乙酸水体系(体积比为5： 95)，海洛因水解液的液相色谱分析见图16-1和图16-2。

2.4标准曲线和线性关系

用色谱甲醇稀释吗啡标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、 100、200、500、1000μg/mL的吗啡对照品溶液，按2.2.1的反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录吗啡色谱峰面积，以对照品的进样浓度(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程。

表6吗啡的浓度与峰面积

以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝2×10⁷+22035，R²＝0.9997……………………

表明吗啡在0.5--1000μg/mL的范围内线性关系良好。

2.5样品中吗啡含量的测定

取海洛因水解液10μL，加水稀释至5mL，按2.2.1的反相色谱方法分析测定该稀释液，重复测定3次，记录吗啡色谱峰峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算该稀释液中的吗啡含量。

表7海洛因水解液中吗啡含量的测定结果

由表7可知，通过峰面积外标法由标准曲线方程计算得到海洛因水解液中吗啡的含量为27.1mg/mL。

2.6高效液相色谱制备条件的优化

采用与分析液相相同的色谱条件来分离海洛因水解液中的吗啡组分，虽然在制备液相中吗啡能够与样品中的相邻组分达到良好分离，可是分离时间较长，并且吗啡色谱峰拖尾现象严重，所以提高了甲醇的比例，最终吗啡与其他组分达到了较好的分离效果，制备液相谱图如图17所示。

虽然建立了吗啡的反相制备液相分离方法以及海洛因的正相制备液相分离方法，由于采用正相制备分离海洛因样本需要消耗大量的有机溶剂(正己烷、异丙醇、甲醇等)，不但制备成本高，并且污染环境，对工作人员的健康造成危害，而且由于流动相中甲醇的存在，馏分处理不及时海洛因会发生水解产生少量的单乙酰吗啡，使制备产物的纯度降低。因此，在实施例中对海洛因的制备方案进行了调整，由海洛因样本水解后获得吗啡原料液，原料液经过制备液相色谱分离，收集馏分，馏分经过二次纯化后得到吗啡盐酸盐标准物质，再进一步乙酰化合成制备海洛因标准物质。

但在实验中发现，由于在吗啡制备过程中所采用的是甲醇-三氟乙酸水体系，尽管馏分经过二次纯化处理已经去除了流动相中的三氟乙酸成分，但在吗啡乙酰化合成海洛因的过程中却发现，残留的三氟乙酸能够与吗啡发生反应生成吗啡的三氟乙酰化合物，该化合物的总离子流图、质谱图及结构图见图18-1 至图18-3。

从质谱分析结果可以看到，吗啡与醋酸酐反应过程中，残留的三氟乙酸在该反应条件下能够与吗啡分子上的一个羟基发生作用，使生成了一个新的杂质。为了去除该杂质，对制备液相的流动相体系重新进行了调整，采用甲醇 -0.5％乙酸水体系进行分离，通过对流动相中甲醇比例的考察，最终选择甲醇 -0.5％乙酸水溶液(体积比12：88，0.5％乙酸水溶液是指乙酸体积分数为0.5％的乙酸水溶液)，作为流动性分离制备吗啡标准物质，经过液相色谱检测，馏分的归一化含量能够达到99.9％以上。制备液相色谱图如图19所示。

2.7批处理程序

经过试验考察，在实验所采用的制备液相色谱条件下，45min内全部组分均能从制备柱中连续流出，因此可以运行批处理文件进行连续制备。实验中又发现，如果采用流动相进泵后混合，因溶剂瓶体积的限制(最大4升)，一次运行批处理最多可进样9针，如果采用流动相进泵前混合，则一次运行批处理最多可进样21针，能够大大提升制备效率，因此实验最后选择进泵前将流动相按比例混合后，采用批处理方式进行制备并收集馏分。

2.8吗啡组分的进一步纯化

多次收集制备液相分离得到的吗啡组分，经减压旋蒸后除去甲醇并继续旋蒸至剩余少量水液的近饱和状态，加碱液调节pH＝8.7±0.2，离心后取出上层水液，得到白色沉淀，自然干燥后得吗啡生物碱。向白色沉淀中加入少量水，并逐滴加入0.1mol/L盐酸溶液，至白色沉淀全部溶解，冻干后得到盐酸吗啡晶体，HPLC峰面积归一化法计算吗啡纯度达到99.8％。

冷冻干燥后获得的吗啡标准物质通常要经过脱水取出从空气中吸附的水分及残留溶剂，实验证明，吗啡盐酸盐经过烘箱105℃加热后会导致纯度降低，因此可采用真空干燥箱室温下干燥。

利用案件鉴定剩余的海洛因样本制备海洛因盐酸盐、吗啡碱、吗啡盐酸盐标准物质，再以吗啡标准物质通过乙酰化反应制备海洛因标准物质，制备工艺流程如图20所示。

2.9吗啡标准物质的结构确证

2.9.1核磁共振分析

为了确定制备液相分离所得到的化合物的结构，进行了核磁共振分析,谱图见图21-22。

溶剂：D₂O

位置	化学位移<sup>13</sup>C	化学位移<sup>1</sup>H	氢谱裂分
				1	145.611
2	138.052
				3	117.768	6.76	d
4	120.435	6.68	d
				5	123.475
6	129.372
				7	20.992	3.21；2.97	dd；dd
8	60.747	4.20	dd
				9	38.542	2.96	m
10	41.575
				11	90.324	5.05	d
12	65.744	4.36	m
				13	125.606	5.39	d
14	133.237	5.75	d
				15	32.614	2.31；2.15	dt；dd
16	47.331	3.37；3.08	dd；dt
				17	41.023	2.98	s

2.9.2红外光谱分析

在AVATAR 330FT-IR红外光谱仪(Thermo Nicolet公司)上测定了吗啡的红外光谱(图23)，结果与标准谱图完全一致。

2.9.3液相色谱-串联质谱联用分析

在Agilent LC-MS/MS 6410仪上测定了吗啡的质谱。在ESI正离子模式下，破碎电压80V，碰撞能8eV，样品的质谱图如图24所示。

从质谱图中可以得到下列信息：

(1)准分子离子峰[M+H]+的m/z286.3，与吗啡的相对分子质量 285.34g/mol相差1，因而检测样品的分子量与吗啡的相符。

2.10吗啡标准物质定值结果

经HPLC以及GC方法定值分析，吗啡标准物质的纯度为99.71％，扩展不确定度为0.04％(k＝2)。均匀性良好，稳定性至少1年以上。

Claims (1)

1.用于法庭科学毒品检测的吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的纯化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)检测缴获海洛因样品中盐酸海洛因的纯度，选择盐酸海洛因质量分数大于或等于60wt％的缴获海洛因样品作为纯化制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质的原料；

(2)利用高效液相色谱制备吗啡碱、吗啡盐酸盐、海洛因盐酸盐标准物质；

在步骤(1)中，包括如下步骤：

(1.1)样品溶液的制备：

吗啡碱、吗啡盐酸盐样品溶液的制备：称取海洛因样本，加水溶解，加入6mol/L盐酸溶液，调节pH至小于2，90℃下加热2小时水解，放置过夜，经HPLC分析海洛因和乙酰可待因全部水解完全后，配成饱和溶液，0.45μm微孔滤膜过滤；

(1.2)确定液相色谱条件：

吗啡的反相高效液相色谱RP-HPLC分析方法:色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱，250mm×4.6mm I.D.，5μm；流动相为V_甲醇：V_{0.05％三氟乙酸/水}＝15:85，等度洗脱；紫外检测波长210nm；流速1.0mL/min；柱温35℃；

(1.3)计算标准曲线的回归方程及确定线性范围：

吗啡：用色谱甲醇稀释吗啡标准储备液，精密配制成浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000μg/mL的吗啡对照品溶液，按反相色谱条件测定，每个浓度重复3次，以平均值计算，记录吗啡色谱峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图，并计算标准曲线的回归方程；

以峰面积对浓度作图，标准曲线的回归方程为：

Y＝2×10⁷+22035，R²＝0.9997

吗啡在0.5-1000μg/mL的范围内线性关系良好；

(1.4)检测缴获海洛因样品中海洛因水解液中吗啡含量；

(1.4.2)取海洛因水解液10μL，加水稀释至5mL，按反相色谱方法分析测定该稀释液，重复测定3次，记录吗啡色谱峰峰面积，计算其平均值，按峰面积外标法计算该稀释液中的吗啡含量；

在步骤(2)中，包括如下步骤：

吗啡的反相高效液相色谱RP-HPLC制备方法：

色谱条件二：色谱柱为Shim-pack VP-ODS制备柱，250mm×20mm I.D.，15μm；流动相为V_甲醇：V_{0.5％乙酸/水}＝12:88，等度洗脱；紫外检测波长210nm；流速10mL/min；上样量900μL；柱温为室温；

吗啡：收集制备液相分离得到的吗啡组分，经减压旋蒸后除去甲醇并继续旋蒸至剩余少量水液的近饱和状态，加碱液调节pH＝8.7±0.2，离心后取出上层水液，得到白色沉淀，自然干燥后得吗啡生物碱；

吗啡盐酸盐：收集制备液相分离得到的吗啡组分，经减压旋蒸后除去甲醇并继续旋蒸至剩余少量水液的近饱和状态，加碱液调节pH＝8.7±0.2，离心后取出上层水液，得到白色沉淀，向白色沉淀中加入少量水，并逐滴加入0.1mol/L盐酸溶液，至白色沉淀全部溶解，冻干后得到盐酸吗啡晶体；

海洛因盐酸盐：收集吗啡盐酸盐，加入1.5倍体积的醋酸酐，100℃加热1.5h，以活性炭脱色，采用真空干燥箱室温下干燥，制备海洛因盐酸盐。

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