CN117471005A

CN117471005A - 一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法

Info

Publication number: CN117471005A
Application number: CN202311396558.1A
Authority: CN
Inventors: 公丕学; 戴琨; 薛霞; 赵寅; 蔡睿琪; 别梅; 丁一; 刘艳明; 王骏; 胡梅; 徐大玮
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2023-10-26
Filing date: 2023-10-26
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2043-10-26
Also published as: CN117471005B

Abstract

本发明属于分析测试领域，具体涉及一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法。该方法通过以下方法实现：（1）标准溶液配制；（2）样品前处理；（3）将待检测样品采用高效液相色谱进行定性定量分析。本发明提供的方法灵敏度高、重复性好、结果准确，适用于乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的分析与检测；本发明的建立能够为以后国家标准的制定提供技术参考，同时对吡咯喹啉醌二钠盐扩大市场应用和加速其研究发展具有重要意义。

Description

一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法

技术领域

本发明属于分析测试领域，具体涉及一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法。

背景技术

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种氧化还原酶的辅酶，是一种天然存在的辅基，目前普遍认为是由革兰氏阴性菌合成，在自然界通过土壤由植物吸收，再由植物传递给动物，同时也存在于发酵食品当中。吡咯喹啉醌二钠盐(Pyrroloquinolinequinone disodium salt)是PQQ的最常用形式，其化学式为C14H4N2Na2O8，它具有独特的高度共轭邻苯醌结构及三个羧基，能够催化多种氧化还原反应，与其他辅酶相比，它具有许多不同的生理特性：超强的抗氧化能力、肝脏保护作用、神经保护作用、改善繁殖性能、类生长因子作用、抗炎功能、增强机体免疫调控等等，因此，PQQ在疾病的治疗、食品、保健品、农业、饲料等方面具有广泛的应用前景。

目前，随着对吡咯喹啉醌研究的不断深入，其应用价值不断被发掘，较好的功效性能使得其在保健品领域应用不断在扩大，医药、食品、化妆品等领域应用前景也十分光明。在国内食品工业方面，主要应用于饮料领域，乳饮料品种、口感、营养丰富，消费场景多元化，是一类受众较广的饮料，能够满足消费者对品类、健康、品质等多元化的需求，消费量及消费人群比例在快速上升。目前，关于食品中吡咯喹啉醌二钠盐检测方面的报道较少，且目前存在的检测方法，主要适用于简单基质。质谱法适合用于痕量分析，在进行吡咯喹啉醌二钠盐分析检测时存在基质效应，样品中常为常量添加，质谱定量准确性差。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法，本发明采用混合阴离子固相萃取柱对乳饮料进行净化浓缩，开发了荧光检测定量方法，抗基质干扰能力强，吡咯喹啉醌二钠盐响应值增强，检测灵敏度提高，扩大方法的适用性，能够对乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐进行准确定量。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法，包括以下步骤：

（1）标准溶液配制：将吡咯喹啉醌二钠盐标准品用乙腈-水溶液溶解，得到标准储备溶液；准确移取标准储备溶液，用醋酸铵溶液稀释为标准工作溶液，置于4℃冷藏避光保存；

（2）样品前处理：称取样品，加入水，调节pH值后混匀，然后加入乙腈，混匀后进行超声提取，然后用水定容，再次混匀后，离心，将上清液取出净化，得待检测样品；

（3）将待检测样品采用高效液相色谱进行定性定量分析。

进一步的，步骤（1）中，所述标准储备溶液的浓度为1 mg/mL；所述乙腈和水的体积比为1:3。

进一步的，步骤（1）中，所述醋酸铵溶液的浓度为20 mmol/L；所述标准工作溶液的浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL。

进一步的，步骤（2）中，所述样品前处理的具体步骤为：称取样品2 g，加入10 mL水，用柠檬酸溶液调节pH值为5.0±0.2，混匀1 min，然后加入7 mL乙腈，混匀后超声提取20min，然后用水定容至25 mL，混匀后，以8000 r/min的转速离心5 min，将上清液取出净化，得待检测样品。

优选的，上述柠檬酸溶液的浓度为200 g/L。

进一步的，所述净化的具体步骤为：取Oasis WAX固相萃取柱，依次用5 mL甲醇、5mL纯水活化，再取5 mL上清液过固相萃取柱，控制流速不超过1 mL/min，待液体流尽后，用5mL 2%甲酸溶液、5 mL甲醇淋洗，将固相萃取柱抽干，再用3 mL 8%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，经40℃水浴氮吹至近干，用1 mL 20 mmol/L醋酸铵溶液复溶，超声10 min后，涡漩混匀，经0.22 μm微孔水相滤膜过滤后，得待检测样品。

本发明提供的检测方法中，高效液相色谱的条件为：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18，规格为4.6×150 mm，4 μm；色谱柱温度：35℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：二极管阵列检测器：250 nm；荧光检测器：激发和发射波长分别为368 nm和470 nm；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为pH值为3.5的20 mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱。

优选的，上述梯度洗脱的程序为：

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本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的检测方法，对样品提取溶剂、净化及浓缩等前处理过程进行了创造性的探索，考察了不同的色谱柱及流动相条件的分离效果，结果表明，吡咯喹啉醌二钠盐在0.10~50 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9992，在荧光检测器检测条件下，吡咯喹啉醌二钠盐的检出限为0.3 mg/kg，定量限为1 mg/kg，加标回收率在80.1~92.2%之间，相对标准偏差（RSD）为1.36~3.22%；

（2）本发明提供的方法灵敏度高、重复性好、结果准确，适用于乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的分析与检测；

（3）本发明的建立能够为以后国家标准的制定提供技术参考，同时对吡咯喹啉醌二钠盐扩大市场应用和加速其研究发展具有重要意义。

附图说明

图1为吡咯喹啉醌二钠标准溶液色谱图（10μg/mL）激发和发射波长分别为368 nm和470 nm；

图2为吡咯喹啉醌二钠激发波长和发射波长的扫描光谱图；

图3为温度对标物稳定性影响；

图4为光照条件对标物稳定性影响；

图5为上样液pH值对回收率的影响；

图6为洗脱试剂对回收率的影响；

图7为洗脱试剂体积对回收率的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

1.1仪器与试剂

Waters E2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UMV-2多管漩涡混合器（山东青云实验耗材有限公司）；KQ-800DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；3-18K型冷冻离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；N-EVAP温控氮吹仪（美国Organomation公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯，德国默克公司；甲酸、氨水、磷酸二氢钾、柠檬酸、磷酸、亚铁氰化钾、乙酸锌均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲酸铵、醋酸铵均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；吡咯并喹啉醌二钠盐（Pyrroloquinoline quinonedisodium salt，PQQ salt）：CAS号：122628-50-6，纯度≥99%，购自ZZSTANDARD公司；实验用乳饮料购自当地超市。

固相萃取柱Oasis HLB（200 mg/6 mL）、Oasis WAX（60 mg/3mL）、Oasis MAX （60mg/3mL）、Oasis MCX （60 mg/3mL）购自美国Waters公司；色谱柱Atlantis T₃（4.6×250mm，5 μm）、XBridge C₁₈（4.6×150 mm，3.5 μm）购自美国Waters公司；色谱柱Inertsil ODS-3 （4.6×150 mm，5 μm）购自日本岛津公司；色谱柱Poroshell 120 EC-C₁₈（4.6×150 mm，4μm）购自美国安捷伦公司。

1.2 标准溶液配制

标准溶液配制：将标准品准确称取10 mg（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用乙腈-水（1:3，V/V）溶液溶解，并定容至刻度，得到浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。将配制好的标准溶液置于-18℃冷冻避光保存。

标准工作溶液的配制：准确移取一定量的标准储备溶液，用20 mmol/L的醋酸铵溶液配成质量浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL的标准工作溶液，置于4℃冷藏避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1提取：称取样品2 g（精确至0.01 g）于离心管中，加入10 mL水，用200 g/L的柠檬酸溶液调节pH值为5.0±0.2，于涡旋混匀器上混匀1 min，加入7 mL乙腈，混匀后放置于超声波清洗器中超声进行提取20 min，然后用水定容至25 mL，涡旋混匀后，以8000 r/min的转速离心5 min，将上清液取出待净化。

1.3.2净化：取Oasis WAX固相萃取柱，依次用5 mL甲醇、5 mL纯水活化，再取5 mL待净化液过固相萃取柱，控制流速不超过1 mL/min，待液体流尽后，用5 mL 2%甲酸溶液、5mL甲醇淋洗，将固相萃取柱抽干，再用3 mL 8%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，经40℃水浴氮吹至近干。用1 mL 20 mmol/L醋酸铵溶液复溶，超声10 min后，涡漩混匀，经0.22 μm微孔水相滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行分析。

1. 4 仪器条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C₁₈（4.6×150 mm，4 μm）；色谱柱温度：35℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：二极管阵列检测器：250 nm；荧光检测器：激发和发射波长分别为368 nm和470 nm；流动相：甲醇（A）和pH值为3.5的20 mmol/L甲酸铵溶液（B），流动相梯度洗脱条件见表1。

表1

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2结果与讨论

2.1色谱条件

2.1.1色谱柱的选择

吡咯喹啉醌二钠盐用高效液相色谱仪进行检测时，该物质在反相色谱柱上的保留较弱，因此选择合适的色谱柱及流动相条件尤其重要。本发明考察了Atlantis T₃、Inertsil ODS C₁₈、XBridge C₁₈、Poroshell 120 EC-C₁₈四种色谱柱的分离效果，结果表明，在相同的色谱条件下，四种色谱柱都有保留，但在Atlantis T₃、Inertsil ODS C₁₈、XBridgeC₁₈色谱柱上峰形较宽，有拖尾，而用Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱分析目标物，峰形好，出峰时间合适，分离度好，因此，本发明选择Poroshell 120 EC-C₁₈作为分析色谱柱，在优化条件下，标准溶液色谱图（10 μg/mL）见图1。

2.1.2流动相的选择

在使用高效液相色谱仪进行分析的过程中，虽然乙腈洗脱能力比甲醇强，但会导致目标物保留时间缩短，不利于与杂质分离，因此，本发明选用甲醇作为有机相。

在用缓冲盐溶液作为流动相调节pH值时，由于磷酸盐在较低pH值条件下的缓冲范围为1.1~3.1，甲酸铵的pH缓冲范围是2.7~4.7，所以通过调节20 mmol/L磷酸二氢钾溶液pH值为2.0、2.5、3.0，调节20 mmol/L甲酸铵溶液pH值为3.5、4.0、4.5 ，来考察吡咯喹啉醌二钠盐的保留行为变化。结果发现，pH值为4.0、4.5时，在色谱柱上保留较弱，较早出峰，不利于与样品中杂质的分离，而pH值小于3.0时，色谱峰出现分叉，考虑是pH值影响了目标物的存在形式，从而影响了峰形，pH值为3.5时，峰形及出峰时间较合适，因此，选择pH值为3.5的20 mmol/L甲酸铵溶液作为流动相，并调节梯度条件，使目标物色谱图峰形对称，相同保留时间内无杂质干扰。

2.1.3检测波长的选择

吡咯喹啉醌二钠盐具有紫外吸收，在250 nm波长下有最大吸收，通过对PQQ-Na₂标准工作液进行激发波长和发射波长的扫描，发现具有荧光性，结果如图2所示，确定其最佳的激发和发射波长分别为368 nm和470 nm，在最佳激发和发射波长条件下，标准物质响应值比紫外检测器最大吸收下响应值更强，灵敏度提高约5倍。

2.2前处理条件

2.2.1标准物质稳定性

为考察温度对标准物质稳定性的影响，选择4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行分别考察，用20 mmol/L醋酸铵溶液配成10 μg/mL的PQQ-Na₂工作溶液，在选择温度中分别放置4小时后，上机检测，比较标准物质在不同温度条件下的稳定性，用标准物质响应峰面积与原始标准物质溶液峰面积比表示，如图3所示，结果表明，温度对标物稳定性的影响不大，但将标准溶液放置4℃条件下，稳定性最好。

本发明考察保存条件对标准溶液稳定性的影响，将10 μg/mL的标准工作溶液，分别置于阳光照射、防紫外线黄光灯照射、避光条件下，4小时后比较其浓度变化，用标物的响应峰面积与原始溶液的峰面积占比表示，如图4所示，结果表明阳光照射会降低标准物质的稳定性，约降低15%，而防紫外线灯照射下跟避光条件下差别不大，避光条件有利于保持标物稳定性。

2.2.2净化方式的选择

比较亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀剂沉淀法、乙腈沉淀法、固相萃取柱净化法三种净化方式，吡咯喹啉醌二钠盐在不同的pH值条件下会有不同的存在形式，具有不同的极性。HLB亲水亲脂聚合物固相萃取柱属于常用的硅胶基质反相SPE小柱，通过疏水性作用萃取非极性化合物，其选择性很广，该反相吸附剂非常适用于酸性、碱性和中性分析物，MAX、WAX、SAX是离子交换型固相萃取柱，选用这四款固相萃取柱，用于考察净化样品效果，结果如表2所示，加入沉淀剂、乙腈进行沉淀蛋白后，目标物回收率较低。用固相萃取柱净化时，HLB、WAX对目标物有所保留，且能洗脱下来。沉淀法目标物回收率低，可能是因为吡咯喹啉醌二钠盐形成共沉淀或附着在所形成的沉淀上；HLB固相萃取柱回收率低，可能是受目标物存在形式的影响，导致在净化过程中有所损失；通过WAX固相萃取柱进行净化，回收率较高，能够满足实验要求，且净化效果明显，干扰较少。

表2

2.2.3上样液pH值

本发明考察了不同上样液的pH值对吡咯喹啉醌二钠回收率的影响，配制200 g/L质量浓度的柠檬酸溶液，并用其调节上样液pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，然后将上样液通过固相萃取柱，洗脱溶液经氮吹复溶后上机检测，结果如图5所示，上样液pH值在5.0左右时回收率最高，应该是由于上样液中目标物此时离子化率较高，与固相萃取柱填料的作用效率最高。

2.2.4洗脱试剂

Oasis WAX固相萃取柱填料为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-CH₂-哌嗪环，由于吡咯喹啉醌二钠的结构中有羧基，且喹啉环上比较容易失去氢离子带上负电荷，上样后与Oasis WAX固相萃取柱的填料结合，在用酸溶液淋洗后，用氨水甲醇溶液进行洗脱。方法对其中氨水的浓度进行了优化，分别用5 mL 含1%、2%、5%、8%、10%氨水的氨水甲醇溶液进行洗脱，吡咯喹啉醌二钠的加标回收率如图6所示，结果表明，在用8%的氨水甲醇溶液进行洗脱时，回收率达到最高。

2.2.5洗脱体积

使用Oasis WAX固相萃取柱进行样品的净化，选择1 mL、3 mL、5 mL、7 mL 、9 mL8% 氨水甲醇进行洗脱，考察了洗脱液的洗脱体积对吡咯喹啉醌二钠加标回收率的影响，结果见图7所示，随着洗脱体积增大，回收率逐渐提高，当达到3 mL后，洗脱体积再继续增大，回收率开始降低，可能是因为8%氨水-甲醇溶液是由25%的浓氨水溶液配制而成，Oasis WAX固相萃取柱填料与目标物既有离子相互作用，还有非极性作用，洗脱溶剂体积较大时，水的比例增大，极性增强，造成洗脱能力的下降，因此选择洗脱体积为3 mL。

2.3方法学评价

2.3.1线性范围和检出限

将质量浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL的标准工作溶液注入高效液相色谱仪，用DAD、FLD两种检测器分别进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，线性方程、线性相关系数及检出限、定量限见表3，两种检测器在各自线性范围内线性良好，R²均大于0.999。在空白基质中加入标物，采用本方法进行检测，以信噪比S/N=3计算得到目标物的检出限，以信噪比S/N=10计算得到目标物的定量限。结果表明，两种检测器均可对目标物进行定量定性分析，荧光检测器的灵敏度更高，检出限更低，提高了方法的适用性、准确性、灵敏度。

表3

2.3.2回收率和精密度

选用不同的乳饮料试样进行加标回收率和精密度试验，分别添加三个不同质量浓度水平的标准溶液，对每个浓度水平分别平行测定6次，样品回收率与精密度计算结果如表4所示。在检测时，吡咯喹啉醌二钠盐的平均回收率在80.1~92.2%之间，精密度RSD为1.36~3.22%。结果表明，该方法能够满足实际样品的检测需要。

表4

效果实施例

应用本发明提供的方法对市售30批次乳饮料进行测定，未检测到吡咯喹啉醌二钠盐，说明吡咯喹啉醌二钠盐作为新公布食品原料，在食品领域还未得到广泛的应用。

Claims

1.一种乳饮料中吡咯喹啉醌二钠盐的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将待检测样品采用高效液相色谱进行定性定量分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述标准储备溶液的浓度为1 mg/mL；所述乙腈和水的体积比为1:3。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述醋酸铵溶液的浓度为20 mmol/L；所述标准工作溶液的浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述样品前处理的具体步骤为：称取样品2 g，加入10 mL水，用柠檬酸溶液调节pH值为5.0±0.2，混匀1 min，然后加入7 mL乙腈，混匀后超声提取20 min，然后用水定容至25 mL，混匀后，以8000 r/min的转速离心5 min，将上清液取出净化，得待检测样品。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述柠檬酸溶液的浓度为200 g/L。

6.根据权利要求1、4或5所述的检测方法，其特征在于，所述净化的具体步骤为：取Oasis WAX固相萃取柱，依次用5 mL甲醇、5 mL纯水活化，再取5 mL上清液过固相萃取柱，控制流速不超过1 mL/min，待液体流尽后，用5 mL 2%甲酸溶液、5 mL甲醇淋洗，将固相萃取柱抽干，再用3 mL 8%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，经40℃水浴氮吹至近干，用1 mL 20mmol/L醋酸铵溶液复溶，超声10 min后，涡漩混匀，经0.22 μm微孔水相滤膜过滤后，得待检测样品。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18，规格为4.6×150 mm，4 μm；色谱柱温度：35℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：二极管阵列检测器：250 nm；荧光检测器：激发和发射波长分别为368 nm和470 nm；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为pH值为3.5的20 mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

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