CN113030315B - 一种吡咯烷酮残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种吡咯烷酮残留的检测方法，所述方法包括：配制待测样品和标准品；使用高效液相色谱法，以无机溶液作为流动相，使用外标法来计算所述待测样品中吡咯烷酮的残留量。本发明所述的吡咯烷酮残留的检测方法操作简单、样品制备便捷、响应灵敏、分离度好，能够用于快速检测γ‑氨基丁酸中微量的吡咯烷酮残留，并为鉴别生物合成与化学合成的γ‑氨基丁酸提供技术手段。

Description

一种吡咯烷酮残留的检测方法

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸的检测领域，且更为具体地涉及一种吡咯烷酮残留的检测方法。

背景技术

在γ-氨基丁酸(4-Aminobutyric acid，简称GABA)又名4-氨基丁酸，γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能。γ-氨基丁酸因其具有健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，调节免疫等功能被广泛应用于保健食品、医药等行业领域。

GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。发酵法通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产GABA制剂，利用乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物生物合成GABA，产品安全性大幅提高。这就使得生物合成的GABA制品能用作高档功能性保健食品的配料，应用于保健食品、医药等行业领域。目前化学合成法主要由吡咯烷酮开环制得。将生石灰用蒸馏水消化成石灰乳，抽入水解反应釜，加吡咯烷酮，升温至125-130℃，反应压力保持在0.29MPa，保温反应10-14h以上。反应结束后降温至30℃出料过滤，用蒸馏水洗涤。滤液加碳酸氢铵，直至无钙离子检出，再加活性炭在80℃保温脱色30min，60℃过滤，用蒸馏水洗，洗液与滤液合并，在60℃减压浓缩至析出结晶，加入乙醇，冷却、过滤、干燥，得成品。因原料转化率的限制，化学合成法生产的GABA中常常含有大量吡咯烷酮残留，吡咯烷酮对皮肤有刺激作用，慢性作用可致中枢神经系统机能障碍，引起呼吸器官、肾脏、血管系统的病变，用于化妆品和食品中存在安全隐患。

目前，国家标准GBT 26602-2011(工业用2-吡咯烷酮标准)中规定的吡咯烷酮测定方法采用毛细管柱气相色谱法，但是该标准只涉及纯品2-吡咯烷酮以及纯品2-吡咯烷酮中杂质的检测，并没有涉及固体样品中2-吡咯烷酮残留的检测。有关吡咯烷酮类化合物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法。液相色谱-质谱联用检测，需使用质谱，检测成本高。现有技术中有液相检测吡咯烷酮的方法，然而多需使用大量的有机溶剂作为流动相，检测成本高且对试验操作者及环境具有一定毒性，如文献1(α-吡咯烷酮乙酰胺的HPLC测定，太原理工大学学报)中公开了一种吡咯烷酮类化合物(吡咯烷酮乙酰胺)的检测方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合相，流动相采用甲醇：乙腈：水(体积比5：2：3)的混合溶液，文献2(HPLC法测定轻工业产品中4种酮类物质的研究，针织工业)中公开了一种轻工业产品中吡咯烷酮类物质的检测方法，该方法使用Poroshell120EC-C18色谱柱，流动相为一定比例的乙腈和水的混合溶液。且文献2公开的方法虽然对2-吡咯烷酮的检测精度较高，但实际试验当中使用该方法时，2-吡咯烷酮与GABA的分离度无法达到要求，色谱峰重叠严重。

因此需要一种简便、快捷、准确度高的检测方法测定GABA中吡咯烷酮的残留，并为鉴别市面上生物合成与化学合成的GABA原料提供技术手段。

发明内容

针对现有技术存在的GABA中吡咯烷酮的残留检测方法的不足，本发明提供一种吡咯烷酮残留的检测方法。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

配制待测样品和标准品；

使用高效液相色谱法，以无机溶液作为流动相，使用外标法来计算所述待测样品中吡咯烷酮的残留量。

2、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述待测样品中包含γ-氨基丁酸。

3、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述无机溶液为磷酸盐水溶液。

4、根据项3所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液。

5、根据项4所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述混合水溶液中磷酸根离子的浓度为0.15mol/L～0.2mol/L，pH为4～4.5。

6、根据项4所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述混合水溶液中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的摩尔比为1:1～3:1。

7、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.5ml/min。

8、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为Sepax HP-SCX。

9、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为35～50℃，优选为40～50℃，检测波长为200～215nm。

10、根据项1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为2～10μL，优选为5μL。

本发明所述的吡咯烷酮残留的检测方法操作简单、样品制备便捷、响应灵敏、分离度好；检测限可以达到0.8ppm，能够用于快速检测γ-氨基丁酸中微量的吡咯烷酮残留，并为鉴别生物合成与化学合成的γ-氨基丁酸提供技术手段。

附图说明

图1为实施例1中的对照品溶液的色谱图。

图2为实施例1中的待测溶液(化学合成法)的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

如上所述目前尚无简单、准确的测定吡咯烷酮残留的方法。尤其是γ-氨基丁酸中残留的吡咯烷酮的含量通常为2ppm～100ppm，使用现有的色谱法进行检测时，通常无法检测到如此低含量的吡咯烷酮，或者虽然可以检测，但是由于色谱峰峰形不规则或倒峰的出现使得吡咯烷酮的含量难以准确的检测。因此，为了解决上述问题本发明提供了一种吡咯烷酮残留的检测方法，所述方法包括：配制待测样品和标准品；使用高效液相色谱法，以无机溶液作为流动相，使用外标法来计算所述待测样品中吡咯烷酮的残留量。

色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

“检测限”又称为检出限，是指可以检测到的极限浓度，即能够检测到的最低浓度，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。在本发明中，如果说检测限为0.06mg/kg，即可以检测到低至0.06mg/kg的吡咯烷酮，即在体系中即使仅存在0.06mg/kg的吡咯烷酮也可以检测到。

“外标法”与内标法相对，是指添加一定量的标准品(对照品)于空白检材中制成对照样品，与未知检材平行地进行样品处理并检测，根据对照样品响应值与其中所添加标准品(对照品)浓度的函数关系推算未知检材中被测组分浓度的定量方法。

在一个具体的实施方式中，所述待测样品中包含γ-氨基丁酸，所述吡咯烷酮为2-吡咯烷酮。

2-吡咯烷酮为无色结晶，熔点24.6℃，沸点245℃，能溶于水、醇、醚、氯仿、苯、乙酸乙酯和二硫化碳等多数有机溶剂，难溶于石油醚。2-吡咯烷酮对皮肤有刺激作用，慢性作用可致中枢神经系统机能障碍，引起呼吸器官、肾脏、血管系统的病变。

在一个具体的实施方式中，所述无机溶液为磷酸盐水溶液。优选地，所述磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液。

在一个具体的实施方式中，所述混合水溶液中磷酸根离子的浓度为0.15mol/L～0.2mol/L，优选为0.2mol/L，用稀盐酸调节pH为4～4.5，优选为4.5。

在一个具体的实施方式中，所述混合水溶液中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的摩尔比为1:1～3:1，例如可以为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1。

在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.5ml/min。

在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法使用的色谱柱为Sepax HP-SCX。Sepax HP-SCX固定相以硅胶为基质，是强阳离子交换相与疏水相的混合模式，具有磺酸基和苯基官能团混合化学结构。这种混合结构使其不仅可用于分离阳离子/碱性和含氮化合物，也对多种弱阳离子、中性有机化合物等具有合适的保留作用。

在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为35～50℃，优选为40～50℃，检测波长为200～215nm，优选为210nm。其中，本发明将柱温提升为35～50℃，提高柱温可以使某些特征峰的出峰位置前移，在本发明中，使目标峰与干扰峰分离度提高，同时还可提高液相色谱检测效率。

在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法中进样量为2～10μL，优选为5μL。

专利CN109115917A提供了一种γ-氨基丁酸含量的测定方法，其中同时涉及了γ-氨基丁酸和吡咯烷酮的分离，其中吡咯烷酮的含量为0.25g/L，然而γ-氨基丁酸和吡咯烷酮的分离度较小，且两个色谱峰之间存在明显的倒峰，严重影响吡咯烷酮的准确度。尤其是当吡咯烷酮含量较低时，更无法满足精确测定吡咯烷酮含量的需要。

为了解决γ-氨基丁酸和吡咯烷酮的分离度较小，且两个色谱峰之间存在明显的倒峰，无法准确测定吡咯烷酮含量的的问题。本发明经过大量实验，通过改变具体的色谱条件，例如将流动相由磷酸二氢钠改变为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液，改变流动相的pH值为4～4.5，改变柱温为35～50℃等，解决了γ-氨基丁酸和吡咯烷酮两者之间的倒峰问题，并明显提高了两者的分离度，可以准确的测定γ-氨基丁酸中吡咯烷酮的含量，最低可以检测到0.8ppm。

实施例

尽管对本发明的实施方案和具体实施例进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.仪器试剂

安捷伦1260液相色谱仪、分析天平：梅特勒托利多AL104

超纯水、磷酸二氢钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、2-吡咯烷酮对照品(99％)

2.色谱条件

色谱柱:Sepax HP-SCX；

流动相：pH＝4.5的0.2mol/L磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液(摩尔比1:1)；

流速:0.5ml/min；

柱温：柱温为40℃；

检测波长为210nm；

进样量：5μL；

3.溶液配制

对照品溶液：精密称取2-吡咯烷酮对照品50mg至50mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，混匀，取1ml至100ml容量瓶中纯水定容至刻度，无机滤膜过滤，得到对照品溶液。

待测溶液：分别称取化学合成和生物合成的γ-氨基丁酸待测样品500mg至10mL容量瓶中，然后在容量瓶中用纯水定容，无机滤膜过滤，得到待测溶液。

回收率待测溶液：称取生物合成的γ-氨基丁酸待测样品100mg至10mL容量瓶中，然后在容量瓶中用对照品溶液定容，无机滤膜过滤，得到回收率待测溶液。

空白溶液：纯水作为空白溶液。

4.测定

分别取空白溶液、对照品溶液、待测溶液、回收率待测溶液5μL进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算待测样品溶液中2-吡咯烷酮的残留含量。

5.计算

按以下公式计算待测样品中的吡咯烷酮的含量(Ci)：

Cs——对照品溶液浓度(mg/L)

Z——对照品吡咯烷酮含量(％)

Ws——吡咯烷酮对照品质量(mg)

Ci——待测样品中2-吡咯烷酮的含量(mg/kg)

Ai——待测样品中吡咯烷酮的峰面积

Cs——对照品溶液浓度(mg/L)

As——对照品中吡咯烷酮的峰面积

Wi——待测样品的质量(g)

6.结果

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表1所示，检测限为0.8ppm。色谱图如图1～2所示，由图中可以看出目标峰与干扰峰的分离程度良好，且目标峰前没有明显的倒峰干扰。对照品平均回收率为99.5％，表明该色谱条件符合2-吡咯烷酮残留量检测要求。

表1实施例1的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

表2实施例1的待测样品(生物合成)的色谱分析结果

实施例2

将实施例1中的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液改为摩尔比2:1，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表3所示，检测限为1.1ppm。

表3实施例2的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

实施例3

将实施例1中的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液改为摩尔比3:1，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表4所示，检测限为1.1ppm。

表4实施例3的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

实施例4

将实施例1中的流动相pH改变为4.0，其他条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表5所示，检测限为1.1ppm。

表5实施例4的待测样品的色谱分析结果

实施例5

将实施例1中的流动相流速改为1.0ml/min，其他条件与实施例1相同，测定待测样品中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表6所示，检测限为0.9ppm。

表6实施例5的待测样品的色谱分析结果

实施例6

将实施例1中的色谱柱柱温改为35℃，其他条件与实施例1相同，测定待测样品中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表7所示，检测限为1.2ppm。

表7实施例6的待测样品的色谱分析结果

实施例7

将实施例1中的色谱柱柱温改为50℃，其他条件与实施例1相同，测定待测样品中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表8所示，检测限为1.0ppm。

表8实施例7的待测样品的色谱分析结果

实施例8

将实施例1中的磷酸根离子浓度改为0.15mol/L，其他条件与实施例1相同，测定待测样品中吡咯烷酮的含量。待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表9所示，检测限为0.8ppm。

表9实施例8的待测样品的色谱分析结果

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于流动相的pH为2.5，其他检测条件均与实施例1相同。

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表10所示，目标峰前出现明显倒峰，影响目标峰的精确积分测量，检测限为28.9ppm。

表10对比例1的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

对比例2

将实施例1中的色谱柱改为MITSUBISHI CHEMICAL凝胶色谱柱，其它条件与实施例1相同，测定γ-氨基丁酸中吡咯烷酮的含量。此条件下γ-氨基丁酸与吡咯烷酮的色谱峰未能完全分离，因此无法得出检验结果。

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表11所示。

表11对比例2的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于柱温为30℃，其他检测条件均与实施例1相同。

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表12所示，检测限为4.1ppm。

表12对比例3的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

对比例4

对比例4与实施例1的区别在于流动相为磷酸二氢钠水溶液而不是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，其他检测条件均与实施例1相同。

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表13所示，检测限为24.8ppm。

表13对比例4的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

对比例5

对比例5与实施例1的区别在于流动相为磷酸氢二钠水溶液而不是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，其他检测条件均与实施例1相同。

待测样品中2-吡咯烷酮残留量检测结果如表14所示。该条件下目标峰没有出现。

表14对比例5的待测样品(化学合成)的色谱分析结果

上述实施例和对比例所使用的具体色谱条件如表15所示。

表15各实施例和对比例的色谱条件

综上所述，本申请通过控制具体的色谱条件，如流动相采用合适pH值的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液，并控制两者的摩尔比为1:1～3:1，选择合适的色谱柱温度为35～50℃等，摸索出最适合于γ-氨基丁酸中微量吡咯烷酮残留的检测方法，可以准确的测定γ-氨基丁酸中吡咯烷酮的含量，且检测限低，以满足微量检测的需求。

Claims (6)

1.一种吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

配制待测溶液和2-吡咯烷酮对照品溶液；

使用高效液相色谱法，以磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合水溶液作为流动相，使用外标法来计算γ-氨基丁酸待测样品中吡咯烷酮的残留量；

待测溶液的配制方法为：称取γ-氨基丁酸待测样品用水定容，得到待测溶液；

所述混合水溶液中磷酸根离子的浓度为0.15mol/L~0.2mol/L，pH为4~4.5；

所述混合水溶液中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的摩尔比为1:1~3:1；

所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.3~1.0 ml/min；

所述高效液相色谱法使用的色谱柱为Sepax HP-SCX；

所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为35~50℃，检测波长为200~215nm。

2.根据权利要求1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.5 ml/min。

3.根据权利要求1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为40~50℃。

4.根据权利要求1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为2~10μL。

5.根据权利要求1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为5μL。

6.根据权利要求1所述的吡咯烷酮残留的检测方法，其特征在于，待测溶液的配制方法为：称取γ-氨基丁酸待测样品至容量瓶中，然后在容量瓶中用纯水定容，过滤，得到待测溶液。

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