CN110824090B - 一种蔬菜中乙磷铝残留量的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蔬菜中乙磷铝的快速检测方法，属于农药检测技术领域。检测方法包括如下步骤：将蔬菜样品粉碎，充分混匀，准确称取蔬菜样品置于离心管中，加入乙腈‑水，使用均质器进行均质，均质后置于离心机进行离心；离心后，将上清倒入离心管中，并于残渣中加入乙腈‑水，并进行超声辅助萃取，萃取后置于离心机进行离心，离心后，将上清倒入离心管中，并用乙腈‑水进行定容；之后，将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈预淋活化，再用乙腈‑水活化，取上述5mL提取液转移至Carb柱中，再用乙腈‑水洗脱，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，过滤后将处理好的蔬菜样品使用高效液相色谱‑质谱仪进行定性和定量分析去计算蔬菜中乙磷铝的含量。

Description

一种蔬菜中乙磷铝残留量的快速检测方法

技术领域

本发明涉及农药检测技术领域，尤其涉及一种蔬菜中乙磷铝的快速检测方法。

背景技术

乙磷铝(phosethy-Al)又叫疫霉净和霜霉灵，是一种有机磷杀菌剂。工业品为白色粉末，化性稳定，对人、畜毒性低，对蜜蜂与氩类无害。乙磷铝的内吸传导作用强，有保护和治疗作用，对已经发病的植株，通过喷雾或灌根吸收，有治疗效果。乙磷铝对霜霉菌和疫霉菌的效果特别好，主要厢来防治多种作物上的霜霉病和疫病，如黄瓜、油菜、白菜、葡萄霜霉病，马铃薯晚疫病，茄子绵疫病等。

目前，在我国，蔬菜中的乙磷铝残留十分严重且乙磷铝检测目前没有国家推荐标准，文献论文所提供资料检测方法也各不相同，且检测效果不理想，检测时间长，回收率低，因此目前急需一种检测效果好，检测准确度高的乙磷铝快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测效果好，检测速度快的蔬菜中乙磷铝的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:

一种蔬菜中乙磷铝残留量的快速检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：标准溶液的配置

(1)乙磷铝标准储备液(100μg/mL)：准确称取适量乙磷铝标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，避光4℃保存。

(2)乙磷铝标准中间液(10μg/mL)：准确吸取乙磷铝标准储备液(100μg/mL)1mL于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

(3)乙磷铝基质标准工作液：将乙磷铝标准中间液(10μg/mL)用空白基质提取液配制成浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的标准溶液备用，用于绘制校准曲线。

步骤2：样品的前处理

(1)将蔬菜样品粉碎，充分混匀，准确称取蔬菜样品置于离心管1中，加入乙腈-水(1+1，V)，使用均质器进行均质，均质后置于离心机进行离心；

(2)离心后，将上清倒入离心管2中，并于残渣中加入乙腈-水(1+1，V)，并进行超声辅助萃取，萃取后置于离心机进行离心，离心后，将上清倒入离心管2中，并用乙腈-水(1+1，V)进行定容。

(3)将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)活化，取上述5mL提取液转移至Carb柱中，再用乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，待测。

(3)样品检测

将处理好的蔬菜样品使用高效液相色谱-质谱仪进行定性和定量分析去计算蔬菜中乙磷铝的含量。

A.取5.0μL待测样品溶液进样，用高效液相色谱-串联质谱仪分析检测，得到待测样品溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；

B.将步骤1中制备的乙磷铝标准工作液，用高效液相色谱-串联质谱仪分析测定，获得标准溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；

C.以乙磷铝的保留时间、定性离子对(m/z)109/79和定量离子对(m/z)109/81进行分析，以定性离子对和定量离子对的色谱峰制作得到乙磷铝标准曲线。

D.根据待测样品溶液中乙磷铝的定性离子对和定量离子对的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中农药残留的浓度Ci，并按以下公式计算得到蔬菜中乙磷铝的含量Xi，含量计算公式为：

公式中：

Xi---试样中乙磷铝残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

Ci---从标准曲线上得到的被测组分的溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V---样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；

m---样品溶液所代表的试样的质量，单位为克(g)；

f---稀释因子。

所述高效液相色谱仪的液相色谱条件为：色谱柱：Waters BEH hilic(1.7um，2.1×100mm)；进样体积5uL；流动相：0.2％甲酸乙腈+0.2％甲酸水溶液；流速：0.4mL/min；

所述高效液相色谱仪的MS/MS质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：ESI-；干燥气：干燥气：温度330℃，流量9L/min；鞘气：温度350℃，流量12L/min；雾化气压力：36psi；毛细管电压：4500V，扫描方式：多反应监测(MRM)。

优选地，所述步骤2(1)中，所述蔬菜样品包括：菠菜，芋籽，甘蓝，黄秋葵，小葱。

优选地，所述步骤2(1)中，所述蔬菜样品重量/乙腈-水(1+1，V)用量为10g/20mL；所述均质器的转速为8000r/min，均质的时间为1min；所述离心机的转速为3500r/min，所述离心机的离心时间为5min。

优选地，所述步骤2(2)中，所述残渣中加入的所述乙腈-水(1+1，V)的添加量为10ml；所述超声辅助萃取的时间为10min；所述离心机的转速为3500r/min，所述离心机的离心时间为5min；所述定容的体积为50ml。

优选地，所述步骤2(3)中，所述预淋活化的乙腈用量为3mL；所述活化的乙腈-水(1+1，V)用量为5mL；所述洗脱的乙腈-水(1+1，V)用量为5mL。

优选地，其特征在于，所述检测方法的乙磷铝检出限为0.050mg/kg。

本发明的有益效果在于：

1.1.本发明检测方法中乙磷铝的色谱峰响应良好，3.6分钟就能够出峰，仪器响应较高，从而有效的节省了进样的时间，提高了乙磷铝的检测效率。

2.本发明检测方法为专门针对乙磷铝的检测方法，检测方法中乙磷铝的检测的准确率明显提高，本发明乙磷铝的检出限为0.050mg/kg，样品的加标回收率在91.12％-105.81％之间，相对标准偏差在0.33％～5.32％之间。

3.本发明检测方法通过前处理对样品进行了稀释，减小样品对于仪器的污染。

4.本发明检测方法操作简单，稳定性好，在菠菜，芋仔，黄秋葵，甘蓝和小葱中均具有优异的检测结果,且不同蔬菜中的加标回收率稳定。

5.本发明采用空白基质配制标准工作液，解决因样品基质抑制效应大而导致样品上机数据过低影响回收率的问题。

6.本发明采用石墨化碳黑固相萃取小柱(Carb)对样品进行净化，解决现有技术中常用净化柱：C18固相萃取小柱、氨基固相萃取小柱(NH2)、强阳离子交换柱(SCX)等对乙磷铝存在严重的拦截、吸附的问题。

附图说明

图1是乙磷铝校准曲线图

图2是乙磷铝标准品总离子流图

图3是乙磷铝定量离子色谱图

图4是乙磷铝定性离子相对丰度色谱图

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

本发明所使用的试剂和材料为：乙腈(色谱纯)；甲酸(优级纯)；2％甲酸乙腈：量取20mL乙酸至1L容量瓶中，用乙腈定容至刻度；2％甲酸水：量取2mL甲酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度；乙磷铝标准品(纯度≥99％)；Carb柱500mg/3mL。

本发明所述使用的仪器为：Agilent1290/6460高效液相色谱-质谱/质谱联用仪(UPLC-MS/MS),带ESI源；waters BEH hilic色谱柱；食品加工机；分析天平：感量0.01g、0,1mg；均质器：6000-36000r/min；固相萃取装置；超声波清洗仪；离心机。

实施例1

准备八个具塞离心管，编号为1-8号，其中1号为全程空白，2号为基底空白，3-8号为加标。

将空白基质菠菜样品粉碎，充分混匀，准确称取10.0g置于2-8号离心管，3-4号离心管分别加入500ng乙磷铝标准溶液，5-6号离心管分别加入1000ng乙磷铝标准溶液，7-8号离心管分别加入2000ng乙磷铝标准溶液，加入20mL乙腈-水(1+1，V)，8000r/min均质1min，3500r/min离心5min，上清液倒入另一刻度离心管中，往残渣中加入10mL乙腈-水(1+1，V),超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min，合并萃取液，用乙腈-水(1+1，V)定容至50mL。

将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈3mL预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)3mL活化，取5mL上述提取液转移至Carb柱中，再用5mL乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，计算各样品中乙磷铝含量。

实施例2

准备八个具塞离心管，编号为1-8号，其中1号为全程空白，2号为基底空白，3-8号为加标。

将空白基质芋头样品粉碎，充分混匀，准确称取10.0g置于2-8号离心管，3-4号离心管分别加入500ng乙磷铝标准溶液，5-6号离心管分别加入1000ng乙磷铝标准溶液，7-8号离心管分别加入2000ng乙磷铝标准溶液，加入20mL乙腈-水(1+1，V)，8000r/min均质1min，3500r/min离心5min，上清液倒入烧杯，往残渣中加入10mL乙腈-水(1+1，V),超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min，合并萃取液于烧杯，用乙腈-水(1+1，V)定容至40mL。

将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈3mL预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)3mL活化，取5mL上述提取液转移至Carb柱中，再用5mL乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，计算各样品中乙磷铝含量。

实施例3

准备八个具塞离心管，编号为1-8号，其中1号为全程空白，2号为基底空白，3-8号为加标。

将空白基质黄秋葵样品粉碎，充分混匀，准确称取10.0g置于2-8号离心管，3-4号离心管分别加入500ng乙磷铝标准溶液，5-6号离心管分别加入1000ng乙磷铝标准溶液，7-8号离心管分别加入2000ng乙磷铝标准溶液，加入20mL乙腈-水(1+1，V)，8000r/min均质1min，3500r/min离心5min，上清液倒入另一刻度离心管中，往残渣中加入10mL乙腈-水(1+1，V),超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min，合并萃取液，用乙腈-水(1+1，V)定容至50mL。

将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈3mL预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)3mL活化，取5mL上述提取液转移至Carb柱中，再用5mL乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，计算各样品中乙磷铝含量。

实施例4

准备八个具塞离心管，编号为1-8号，其中1号为全程空白，2号为基底空白，3-8号为加标。

将空白基质甘蓝样品粉碎，充分混匀，准确称取10.0g置于2-8号离心管，3-4号离心管分别加入500ng乙磷铝标准溶液，5-6号离心管分别加入1000ng乙磷铝标准溶液，7-8号离心管分别加入2000ng乙磷铝标准溶液，加入20mL乙腈-水(1+1，V)，8000r/min均质1min，3500r/min离心5min，上清液倒入另一刻度离心管中，往残渣中加入10mL乙腈-水(1+1，V),超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min，合并萃取液，用乙腈-水(1+1，V)定容至50mL。

将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈3mL预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)3ml活化，取5ml上述提取液转移至Carb柱中，再用5ml乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，计算各样品中乙磷铝含量。

实施例5

准备八个具塞离心管，编号为1-8号，其中1号为全程空白，2号为基底空白，3-8号为加标。

将空白基质小葱样品粉碎，充分混匀，准确称取10.0g置于2-8号离心管，3-4号离心管分别加入500ng乙磷铝标准溶液，5-6号离心管分别加入1000ng乙磷铝标准溶液，7-8号离心管分别加入2000ng乙磷铝标准溶液，加入20mL乙腈-水(1+1，V)，8000r/min均质1min，3500r/min离心5min，上清液倒入另一刻度离心管中，往残渣中加入10mL乙腈-水(1+1，V),超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min，合并萃取液，用乙腈-水(1+1，V)定容至50mL。

将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈3mL预淋活化，再用乙腈-水(1+1，V)3ml活化，取5mL上述提取液转移至Carb柱中，再用5mL乙腈-水(1+1，V)洗脱，柱子不要抽干，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，计算各样品中乙磷铝含量。

实验结果

1.乙磷铝加标回收率

分别以加标500ng、1000ng、2000ng进行加标实验，乙磷铝回收率统计如下：

表1乙磷铝加标回收率和相对标准偏差(RSD)

2.高效液相色谱-质谱仪乙磷铝检测结果

乙磷铝标准曲线图如图1所示，乙磷铝标准品总离子图如图2所示，乙磷铝定量离子色谱图如图3所示，乙磷铝定性离子相对丰度色谱图如图4所示。

3.乙磷铝出峰时间

表2乙磷铝出峰时间以及碰撞能量等参数

4.在菠菜，芋仔，黄秋葵，甘蓝和小葱中比较分别使用空白基质标准液和溶剂标准工作液时的回收率。

空白基质标准工作液和溶剂标准工作液的回收率比较结果如下：

表3基质标回收率范围和溶剂标回收率范围

5.常用净化柱的样品回收率比较结果

检测不同净化柱的回收率范围和相对标准偏差RSD

表4不同净化柱的回收率范围和相对标准偏差RSD

Claims (1)

1.一种蔬菜中乙磷铝残留量的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

步骤1：标准溶液的配置

(1)100μg/mL乙磷铝标准储备液：准确称取适量乙磷铝标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，避光4℃保存；

(2)10μg/mL乙磷铝标准中间液：准确吸取100μg/mL乙磷铝标准储备液1mL于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度；

(3)乙磷铝基质标准工作液：将10μg/mL乙磷铝标准中间液用空白基质提取液配制成浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的标准溶液备用，用于绘制校准曲线；

步骤2：样品的前处理

(1)将蔬菜样品粉碎，充分混匀，准确称取蔬菜样品置于离心管1中，加入体积比1：1的乙腈-水，使用均质器进行均质，均质后置于离心机进行离心；

(2)离心后，将上清倒入离心管2中，并于残渣中加入体积比1：1的乙腈-水，并进行超声辅助萃取，萃取后置于离心机进行离心，离心后，将上清倒入离心管2中，并用体积比1：1的乙腈-水进行定容；

(3)将Carb柱置于固相萃取装置，用乙腈预淋活化，再用体积比1：1的乙腈-水活化，取上述5mL提取液转移至Carb柱中，再用体积比1：1的乙腈-水洗脱，混匀后取1mL过PTFE针头式滤膜，待测；

(3)样品检测

将处理好的蔬菜样品使用高效液相色谱-质谱仪进行定性和定量分析去计算蔬菜中乙磷铝的含量；

A.取5.0μL待测样品溶液进样，用高效液相色谱-串联质谱仪分析检测，得到待测样品溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；

B.将步骤1中制备的乙磷铝标准工作液，用高效液相色谱-串联质谱仪分析测定，获得标准溶液的总离子流图、定量离子色谱图和定性离子对相对丰度色谱图；

C.以乙磷铝的保留时间、定性离子对m/z 109/79和定量离子对m/z 109/81进行分析，以定性离子对和定量离子对的色谱峰制作得到乙磷铝标准曲线；

D.根据待测样品溶液中乙磷铝的定性离子对和定量离子对的色谱峰，结合标准曲线，计算得到待测样液中农药残留的浓度Ci，并按以下公式计算得到蔬菜中乙磷铝的含量Xi，含量计算公式为：

公式中：

Xi---试样中乙磷铝残留量，单位为毫克每千克；

Ci---从标准曲线上得到的被测组分的溶液浓度，单位为纳克每毫升；

V---样品溶液定容体积，单位为毫升；

m---样品溶液所代表的试样的质量，单位为克；

f---稀释因子；

所述高效液相色谱-串联质谱仪的液相色谱条件为：色谱柱：1.7μm，2.1×100mm的Waters BEH hilic；进样体积5μL；流动相：0.2％甲酸乙腈+0.2％甲酸水溶液；流速：0.4mL/min；

所述高效液相色谱-串联质谱仪的MS/MS质谱条件为：离子化方式：ESI-；干燥气：干燥气：温度330℃，流量9L/min；鞘气：温度350℃，流量12L/min；雾化气压力：36psi；毛细管电压：4500V，扫描方式：多反应监测；

所述步骤2(1)中，所述蔬菜样品包括：菠菜，芋仔，甘蓝，黄秋葵，小葱；

所述步骤2(1)中，所述蔬菜样品重量/体积比1：1的乙腈-水用量为10g/20mL；所述均质器的转速为8000r/min，均质的时间为1min；所述离心机的转速为3500r/min，所述离心机的离心时间为5min；

所述步骤2(2)中，所述残渣中加入的所述体积比1：1的乙腈-水的添加量为10ml；所述超声辅助萃取的时间为10min；所述离心机的转速为3500r/min，所述离心机的离心时间为5min；所述定容的体积为50ml；

所述步骤2(3)中，所述预淋活化的乙腈用量为3mL；所述活化的体积比1：1的乙腈-水用量为5mL；所述洗脱的体积比1：1的乙腈-水用量为5mL。

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