CN104198603A - 巯基类亲核取代衍生化试剂的分析用途及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，涉及巯基类衍生化试剂在芥子气及其相关化合物检测中的用途。本发明还涉及一种检测芥子气和/或其相关化合物的方法。具体地，所述检测方法包括下述步骤：使用巯基类衍生化试剂，或者，向经过或未经过预处理的待测样品中加入巯基类衍生化试剂。本发明适于高度反应活泼性芥子气及相关化合物原型的测定，克服了复杂样品中芥子气、氮芥因其迅速水解或烷基化转化所导致的无法测定原型或含量测定不准确的弊端，操作简单、重现性和稳定性好，可应用于环境样品和生物样品中具有反应活性的芥子气及相关化合物的液相色谱-质谱联用检测以及相关的毒理药理学研究。

Description

巯基类亲核取代衍生化试剂的分析用途及方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及巯基类衍生化试剂在芥子气及其相关化合物检测中的用途。本发明还涉及一种检测芥子气和/或其相关化合物的方法。

背景技术

芥子气(sulfur mustard,SM)，化学名为2,2’-二氯二乙基硫醚，是一种难防难治的化学战剂，曾在战争中被多次使用，造成了大量人员伤亡。目前SM仍是世界现存化学武器的主要填充剂，也是日本在华遗弃化武的主要成份。因此实现芥子气及其相关化合物的快速准确检测，无论是从应对公共突发事件，还是从芥子气中毒临床确诊、救治、预后评估以及中毒机制研究等方面来看，都有重要的研究意义。

但是，芥子气属于高度活泼的烷基化试剂，在复杂环境样品或生物样品中，其绝大多数原型分子易降解、水解或迅速进行加合等生物转化，导致芥子气原型通常不易准确测定，其在复杂样品中的真实含量一直是该分析领域相关的一大难题。

目前芥子气及其相关化合物的检测方法主要采用气相色谱(GC)及气相色谱质谱联用方法(GC-MS)，但存在分析方法稳定性差、样品前处理复杂及不适于生物样本分析等不足。虽然液相色谱(LC)及液相色谱质谱联用方法(LC-MS)则具有样品前处理简单、灵敏度高等优点，但是由于芥子气及其氧化产物芥子砜等可与液相管路材料、色谱柱填料以及流动相等发生烷基化或水解反应，故一般认为，液相色谱不能直接用来分析芥子气原型及相关化合物。

因此，需要开发新的检测芥子气及其相关化合物的方法。

发明内容

本发明人通过深入研究和创造性的劳动，发现利用巯基类化合物对芥子气或其相关化合物(例如芥子亚砜和芥子砜等)进行衍生化之后，能够将芥子气及其相关化合物转化为色谱行为和质谱响应较好的一类含硫化合物。本发明人进一步建立了一种基于液相色谱-质谱联用的芥子气、芥子亚砜和芥子砜间接定量检测的方法，该检测方法具有良好的稳定性、精密度和灵敏度。在此基础上，本发明人将建立的方法成功应用于环境样品与生物样品中具有高反应活性的芥子气相关化合物的液相色谱-质谱高灵敏检测。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种检测芥子气和/或其相关化合物的方法，包括下述步骤：

(1)使用巯基类衍生化试剂，或者向经过或未经过预处理的待测样品中加入巯基类衍生化试剂；具体地，巯基类衍生化试剂在样品中的浓度为1ppm－1000ppm、10ppm－500ppm、20ppm－400ppm、30ppm－300ppm、40ppm－200ppm、50ppm－150ppm；例如50ppm、60ppm、70ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、130ppm、140ppm或150ppm；优选为100ppm。

根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤(1)中加入巯基类衍生化试剂之后，进行水浴。

根据本发明任一项所述的方法，其还包括下述步骤：

(2)检测是否产生衍生化产物，或者测定产生的衍生化产物的量或者浓度(含量)。

根据本发明任一项所述的方法，其中，待测样品为环境样品或生物样品；具体地，所述环境样品为水或土壤样品；所述生物样品为人或动物所取得全血、血浆、血清、脑脊液或生物组织。

根据本发明任一项所述的方法，其中，所述芥子气相关化合物为选自如下的任意一种或者多种：

氮芥-1、氮芥-2、氮芥-3、芥子亚砜、芥子砜和2-氯乙基乙基硫醚和2-氯乙基甲基硫醚。

本发明中，所述的衍生化试剂硫代乙酸类(单巯基类)和3,5-二巯甲基-芳香化合物(双巯基类)，示意结构分别如下：

上式中：

对于单巯基类：取代基M选自H⁺、K⁺、Na⁺、NH4⁺、Mg²⁺、Ca²⁺；n为1或2。

对于双巯基类：R选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂COOH等取代基。

根据本发明任一项所述的方法，其中，所述巯基类衍生化试剂为硫代乙酸单巯基类衍生化试剂；

具体地，所述硫代乙酸单巯基类衍生化试剂为选自硫代乙酸、硫代乙酸钾、硫代乙酸钠、硫代乙酸铵、硫代乙酸镁和或硫代乙酸钙中的一种或多种；优选为硫代乙酸钾；

具体地，采用硫代乙酸单巯基类化合物作为衍生化试剂时，衍生化反应按如下操作进行：将待测样品加入到硫代乙酸单巯基类化合物水溶液中，水浴反应10min－60min、20min－50min、20min－40min或25min－35min；例如25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min或35min；优选30min。水浴温度为25℃－100℃、30℃－80℃、40℃－60℃、45℃－55℃；例如45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；优选50℃；

具体地，采用硫代乙酸钾(PTA)作为衍生化试剂时，反应液为水与有机溶剂的混合液，溶液的pH处于中性、弱碱性范围(pH为7－9或7－8)，优选pH为7。

在优选条件下，PTA对芥子气的衍生化效率(>95％)要远远好于芥子亚砜、芥子砜和2-氯乙基乙基硫醚(<10％)。

PTA进行衍生化反应，反应路线如下所示：

根据本发明任一项所述的方法，其中，所述巯基类衍生化试剂为3,5-二巯甲基芳香化合物；

具体地，所述3,5-二巯甲基芳香化合物为选自3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸、3,5-二巯甲基-苯酚、1,3,5-三巯甲基-苯、3,5-二巯甲基-苯乙酸中的一种或多种；优选为3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸(DSH)；

具体地，采用3,5-二巯甲基芳香化合物做为衍生化试剂时，衍生化反应按如下操作进行：将待测样品加入到3,5-二巯甲基芳香化合物类水溶液中，用稀NaOH溶液调节反应液pH值为8－12，优选为9－11或9.5－10.5；水浴反应5min－40min、10min－30min、15min－25min；例如15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min或25min；优选的水浴时间为20min。水浴温度为25℃－100℃、40℃－95℃、50℃－90℃、60℃－90℃、70℃－90℃、75℃－85℃，例如75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃；优选为80℃。

在优选条件下，3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸对芥子气、芥子亚砜、芥子砜和2-氯乙基乙基硫醚均具有较好的衍生化(>80％)。

DSH进行衍生化反应，反应路线如下所示：

根据本发明任一项所述的方法，所述生物样品经过如下预处理：

取适量待测生物样品，加入适量有机溶剂沉淀蛋白，所述的有机溶剂选自乙腈、甲醇和乙酸乙酯中的任意一种或者多种；优选乙腈。

根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤(2)中所述衍生化产物的量或者浓度(含量)通过如下方法测定：

液相色谱法、液相色谱-质谱联用检测方法或毛细管电泳法。选用这些方法测定生物样品中芥子气相关化合物的含量，用标准曲线校正方程换算芥子气相关化合物的浓度。

在本发明的一个实施方案中，液相色谱-质谱联用的检测条件如下：

色谱条件色谱柱为反相色谱柱，流动相A为水相，流动相B为有机相，采用梯度洗脱程序:0－100％B；流速为0.1－1.2ml/min，进样量范围为0.1－20μl，柱温范围为20℃－60℃；

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源；雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)流量范围为40－60psi，喷雾电压范围为2.0－5.5kV，离子源温度范围为300℃－550℃，质量扫描模式为正离子多反应监测(MRM)；

优选地，

色谱条件色谱柱：SHISEIDO CAPCELL CORE C18柱(100×2.1mm i.d,2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序：0－1min，20％B；1－5min，20％－95％B；流速0.3ml/min；进样量5μl；柱温40℃。

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源；雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)均为50psi；喷雾电压5.5kV；离子源温度550℃；质量扫描模式为正离子多反应监测(MRM)。

在本发明中，色谱条件和质谱条件的选择需要通过大量的实验和探索得到优化的分析条件以及仪器参数。

不拘于理论的限制，在色谱条件的优化方面，本发明人考察了不同规格的色谱柱(包括反相色谱柱和亲水性色谱柱等)，流动相的种类(乙腈，甲醇等)及添加剂(不同浓度的甲酸，甲酸铵与醋酸铵等)，梯度洗脱条件的考察(不同的流动相比例)等多种条件，最终得到优化的色谱分析条件。

不拘于理论的限制，在质谱条件的优化方面，针对衍生化产物的物理化学性质，本发明人对其在ESI离子源下离子化的主要条件进行了考察，包括喷雾电压(4.0,5.0和5.5kV)，离子源温度(450,500,550℃)，雾化器和辅助加热干燥气的流量(40,50和55psi)等多种条件，最终得到优化的质谱分析条件。

在优化的液相分离分析条件下，可实现不同衍生产物之间的基线分离和直接高灵敏检测。

本发明的再一方面涉及前面所述的巯基类衍生化试剂在制备或者作为检测芥子气和/或其相关化合物的药物或者试剂中的用途。

本发明中，所述的芥子气是指二氯二乙基硫醚(硫芥)，所述的芥子气相关化合物包括但不限于：二氯二乙基乙胺(氮芥-1)，二氯二乙基甲胺(氮芥-2)，三氯三乙基胺(氮芥-3)、硫芥的亚砜和砜，以及2-氯乙基乙基硫醚、2-氯乙基甲基硫醚等。

发明的有益效果

本发明将芥子气及相关化合物转化为色谱保留行为和质谱响应较好的新的含硫化合物，进而提供了一种全新的检测芥子气及其相关化合物的液相色谱-质谱联用方法；本发明还涉及亲核取代衍生化试剂的制备方法和衍生化方法。本发明还涉及建立的液相分离分析方法的应用，具有灵敏度高、重复性和稳定性好等优点，可同时实现环境和生物样品中具有反应活性的芥子气及相关化合物，包括芥子气(SM)、芥子亚砜(SMO)、芥子砜(SMO₂)及2-氯乙基乙基硫醚(CEES)等的高效液相色谱-质谱联用检测。

本发明利用巯基化合物易发生亲核反应特性，将不能用液相分离分析直接进行检测的芥子气相关化合物通过衍生化反应，将其转化为色谱保留行为和检测响应良好的含硫衍生物，从而实现其简便、准确、可靠的高灵敏检测。在采用液相色谱-质谱检测法时，该方法对芥子气及相关化合物的检测比常规气质联用(GC-MS)的检测灵敏度高2－3个数量级，且样品制备与检测分析可在1小时内完成，能有效分离检测复杂基质样品(包括生物样品与环境样品)中芥子气及相关化合物的含量。

附图说明

图1：制备衍生化产物S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇的核磁共振氢谱(¹H-NMR)谱图。

图2：衍生化试剂3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸的制备路线图及核磁共振氢谱(¹H-NMR)谱图。

图3：S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇的液相色谱图。其中：

图3A，空白溶剂的液相色谱图。

图3B，S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇精制品的液相色谱图。

图4：芥子气及其相关化合物与DSH衍生化产物的液相色谱图和质谱图。其中：

图4A，芥子气与DSH衍生化产物的质谱图。

图4B，芥子亚砜与DSH衍生化产物的质谱图。

图4C，芥子砜与DSH衍生化产物的质谱图。

图4D，2-氯乙基乙基硫醚与DSH衍生化产物的质谱图。

图4E，四种芥子气及其相关化合物的DSH衍生化产物的色谱图。

图5：全血样品中芥子气检测色谱图。

图6：脂肪组织样品中芥子气检测色谱图。

图7：河水样品中芥子气检测色谱图。

图8：土壤样品中芥子气检测色谱图。

图9：血清样品中芥子气相关化合物的检测色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下面的实验操作需要注意：芥子气相关化合物均有一定毒性，所有操作必须在通风橱内进行。操作完毕后的溶液需要以醇碱溶液进行洗消处理。

制备例1：S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇的制备和表征

将5％体积比芥子气乙腈溶液分次或一次加入到0.1g/mL PTA水溶液中，用聚四氟乙烯(PTFE)瓶盖封口，100℃反应1小时；将反应混合物用2mL二氯甲烷进行萃取，萃取液进行硅胶柱层析，洗脱溶剂为正己烷：二氯甲烷＝1:3，收集馏分进行减压蒸馏，即得芥子气与PTA的衍生化产物S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇。

图1为S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇的¹H NMR谱图。表征结果表明，制备的S,S’-二乙酰基三硫代二甘醇精制品纯度可满足实验要求。

制备例2：3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸的制备和表征

3,5-二巯甲基-芳香类化合物的制备方法如下所示：

根据上面的合成路线制备并纯化双巯基衍生化试剂3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸(DSH)。

图2为DSH的¹H NMR谱图。表征结果表明，制备的DSH纯度可满足实验要求。

实施例1：PTA衍生化方法的仪器参数优化

分别配制浓度为0.1mg/mL和1mg/mL的PTA水溶液和d4-芥子气乙腈内标溶液，将含有芥子气的样品与PTA溶液和内标溶液混合后，涡旋混匀，置水浴锅中50℃反应30min，将反应液在14000rpm下离心10分钟，取上清50μL置进样瓶内插管中，用三重四极杆线性离子阱串联质谱仪测定其中芥子气和d4-芥子气的色谱图(液质联用仪5500QTRAP型，配有TurboV电喷雾离子源(ESI)和ACQUITY^TM超高效液相色谱仪(UPLC))。

液相色谱-质谱联用的检测条件如下：

色谱条件色谱柱：SHISEIDO CAPCELL CORE C18柱(100×2.1mm i.d,2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序：0－1min，20％B；1－5min，20％－95％B；流速0.3ml/min；进样量5μl；柱温40℃。

质谱条件电喷雾(ESI)离子源；雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)均为50psi；喷雾电压5.5kV；离子源温度550℃；质量扫描模式为正离子多反应监测(MRM)。母子离子对238→103和238→163，以及同位素内标的母子离子对242→107和242→167。

图3(A-B)为芥子气和d4-芥子气衍生化产物的MRM色谱图，在优化的仪器参数条件下保证了本分析物在最低定量限浓度范围无干扰。

以下如无特殊说明，液质联用的仪器参数设置与本实施例条件相同。

实施例2：DSH衍生化方法的仪器参数优化

配制浓度为100μg/ml的DSH溶液，用稀NaOH溶液将该溶液pH至10.5左右，将SM、SMO、SMO₂和CEES用乙腈稀释至1000 ppm，取合适量的上述芥子气相关化合物乙腈母液加入到2mL碱性DSH溶液中，使各组分终浓度均为1ng/ml，涡旋混匀后，在水浴锅中水浴20min(水浴温度为80℃)后，取50μL反应液置进样瓶内插管中，在上述液质联用条件下进行检测。

四种芥子气相关化合物的母离子对分别为：SM+DSH(270.8→210.8、270.8→153.0)；SMO+DSH(345.0→286.9、345.0→208.8、345.0→210.8)；SMO₂+DSH(361.1→303.0,361.1→185.0、361.1→151.0)；CEES+DSH(419.0→360.8、419.0→294.7)。

图4(A－E)为四种芥子气相关化合物的色谱图和质谱图。结果表明，SM、SMO、SMO₂和CEES的衍生化产物在优化仪器条件下，不仅能实现基线分离，且具有较好的质谱相应。

实施例3：全血样品中芥子气的检测

取10只大鼠混合全血样本50μL，加入190μL乙腈溶液涡旋半分钟；14000rpm离心10分钟，取上清加入50μLPTA溶液、5μL芥子气标准溶液100ng/mL和5μL内标溶液后，涡旋1分钟，置水浴锅中50℃反应半小时；反应液高速离心后置进样瓶内插管中。在上述液质联用条件下进行检测，分析得到的色谱图如图5所示，母子离子对238→103和238→163，以及同位素内标的母子离子对242→107和242→167，并按照随行标曲定量，计算得到芥子气含量均值为9.1ng/mL。

实施例4：生物组织样品中芥子气的检测

取10只大鼠肾周脂肪组织混合匀浆样本0.2g，14000rpm离心10分钟，吸取上清90μL，加入200μL乙腈溶液涡旋1分钟；14000rpm离心10分钟，取上清加入100μLPTA溶液混匀；再加入5μL芥子气标准溶液100ng/mL和5μL内标溶液后涡旋1分钟，置水浴锅中50℃反应30min；反应液高速离心后置进样瓶内插管中。

分析得到色谱图如图6，并按照随行标曲定量，计算得到芥子气含量均值为3.4ng/g。

实施例5：水样品中芥子气的检测

模拟芥子气污染的河水样本：取三处野外采集河水混合样本40μL，加入50μL硫代乙酸钾溶液、5μL芥子气标准溶液100ng/mL和5μL内标溶液后，涡旋1分钟，置水浴锅中50℃反应半小时；反应液14000rpm离心10分钟，取上清50μL置进样瓶内插管中。

分析得到色谱图如图7，并按照随行标曲定量，计算得到芥子气含量均值为10.2ng/mL。

实施例6：土壤样品中芥子气的检测

模拟芥子气污染的土壤样本：取三处野外采集土壤混合样本0.2g，加入90μL硫代乙酸钾溶液、5μL芥子气标准溶液100ng/mL和5μL内标溶液后，涡旋1分钟，置水浴锅中50℃反应半小时；反应液14000rpm离心10分钟，取上清50μL置进样瓶内插管中。

分析得到色谱图如图8，并按照随行标曲定量，计算得到芥子气含量均值为2.8ng/g。

实施例7：血清样品中芥子气及其相关化合物的检测

取10只大鼠混合血清样品50μL，添加100ng/ml的四种芥子气相关化合物SM、SMO、SMO₂和CEES，用200μL的乙腈沉淀蛋白后，14000rpm离心10分钟，吸取上清200μL加入50μL碱性DSH溶液(浓度为100μg/ml)中涡旋混匀后，反应液经高速离心后，移取50μL反应液置进样瓶内插管中在上述液质联用条件下进行检测。

分析得到的色谱图如图9所示。结果表明，大鼠血清样品中可检测到四种芥子气相关化合物SM、SMO、SMO₂和CEES，且经过与DSH衍生化反应后，在优化的仪器条件下四种芥子气相关化合物衍生化产物也可以实现基线分离和高灵敏检测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种检测芥子气和/或其相关化合物的方法，包括下述步骤：

(1)使用巯基类衍生化试剂，或者向经过或未经过预处理的待测样品中加入巯基类衍生化试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下的1)至5)项中的任意一项或者多项：

1)巯基类衍生化试剂在样品中的浓度为1ppm－1000ppm、10ppm－500ppm、20ppm－400ppm、30ppm－300ppm、40ppm－200ppm、50ppm－150ppm；例如50ppm、60ppm、70ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、130ppm、140ppm或150ppm；优选为100ppm；

2)步骤(1)中加入巯基类衍生化试剂之后，进行水浴；

3)其还包括下述步骤：

(2)检测是否产生衍生化产物，或者测定产生的衍生化产物的量或者浓度；具体地，步骤所述衍生化产物的量或者浓度通过液相色谱法、液相色谱-质谱联用检测方法或毛细管电泳法测定；

4)待测样品为环境样品或生物样品；具体地，所述环境样品为水或土壤样品；所述生物样品为人或动物所取得全血、血浆、血清、脑脊液或生物组织；

具体地，所述生物样品经过如下预处理：

取适量待测生物样品，加入适量有机溶剂沉淀蛋白，所述的有机溶剂选自乙腈、甲醇和乙酸乙酯中的任意一种或者多种；优选乙腈；

5)所述芥子气相关化合物为选自如下的任意一种或者多种：

氮芥-1、氮芥-2、氮芥-3、芥子亚砜、芥子砜和2-氯乙基乙基硫醚和2-氯乙基甲基硫醚。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述巯基类衍生化试剂为硫代乙酸单巯基类衍生化试剂；

具体地，所述硫代乙酸单巯基类衍生化试剂为选自硫代乙酸、硫代乙酸钾、硫代乙酸钠、硫代乙酸铵、硫代乙酸镁和或硫代乙酸钙中的一种或多种；优选为硫代乙酸钾。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，将待测样品加入到硫代乙酸单巯基类化合物水溶液中，进行水浴反应。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于如下的1)至3)项中的任意一项或者多项：

1)水浴的时间为10min－60min、20min－50min、20min－40min或25min－35min；例如25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min或35min；优选30min；

2)水浴温度为25℃－100℃、30℃－80℃、40℃－60℃、45℃－55℃；例如45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；优选50℃；

3)采用硫代乙酸钾作为衍生化试剂时，反应液为水与有机溶剂的混合液，溶液pH为7－9或7－8，优选pH为7。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述巯基类衍生化试剂为3,5-二巯甲基芳香化合物；

具体地，所述3,5-二巯甲基芳香化合物为选自3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸、3,5-二巯甲基-苯酚、1,3,5-三巯甲基-苯、3,5-二巯甲基-苯乙酸中的一种或多种；优选为3,5-二巯甲基-苯氧基乙酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，将待测样品加入到3,5-二巯甲基芳香化合物类水溶液中，用稀NaOH溶液调节反应液pH值为8－12，优选为9－11或9.5－10.5；进行水浴反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于如下的1)至2)项中的任意一项或者多项：

1)水浴时间为5min－40min、10min－30min、15min－25min；例如15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min或25min；优选的水浴时间为20min；

2)水浴温度为25℃－100℃、40℃－95℃、50℃－90℃、60℃－90℃、70℃－90℃、75℃－85℃，例如75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃；优选为80℃。

9.根据权利要求2所述的方法，其中，第3)项中所述的液相色谱-质谱联用的检测条件如下：

色谱条件色谱柱为反相色谱柱，流动相A为水相，流动相B为有机相，采用梯度洗脱程序：0－100％B；流速为0.1－1.2ml/min，进样量范围为0.1－20μl，柱温范围为20℃－60℃；

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源；雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)流量范围为40－60psi，喷雾电压范围为2.0－5.5kV，离子源温度范围为300℃－550℃，质量扫描模式为正离子多反应监测(MRM)；

优选地，

色谱条件色谱柱：SHISEIDO CAPCELL CORE C18柱(100×2.1mm i.d,2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序：0－1min，20％B；1－5min，20％－95％B；流速0.3ml/min；进样量5μl；柱温40℃；

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源；雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)均为50psi；喷雾电压5.5kV；离子源温度550℃；质量扫描模式为正离子多反应监测(MRM)。

10.权利要求3或6中所述的巯基类衍生化试剂在制备或者作为检测芥子气和/或其相关化合物的药物或者试剂中的用途。