CN113759041B - 超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及瘦肉精生化检测技术领域，尤其涉及一种超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法。该方法猪尿试样经乙酸乙酯提取，阳离子交换固相萃取柱净化，分析条件如下：采用CHIRALPAK IA‑3分离，以超临界二氧化碳‑0.5%（v/v）醋酸铵甲醇溶液为流动相，梯度洗脱；流速：2.0 mL/min；系统背压：13.8 MPa；进样量：10µL；柱温：40℃；检测波长：241 nm。该方法方法具有分离效果好、分析速度快、有机溶剂用量少等特点，可为进一步研究克伦特罗的药理和开发副作用更小的新药提供技术支持。

Description

超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法

技术领域

本发明涉及瘦肉精生化检测技术领域，尤其涉及一种超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法。

背景技术

克伦特罗(clenbuterol)，俗称“瘦肉精”，是一种选择性β₂受体激动剂，含有1个手性中心^[1]，存在一对对映体，分别为(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗(图1)。人工合成的克伦特罗以外消旋体的形式为主，当高剂量的克伦特罗被添加到饲料中时，克伦特罗进入牲畜体内后能够改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，加速牲畜体内脂肪的分解代谢，促进合成骨骼肌蛋白质，提高动物的瘦肉率^[2]。在动物组织中容易形成克伦特罗的残留，导致发生多次中毒事件，引发人们的高度重视。近年来，克伦特罗在中国已被禁止作为生长促进剂使用。曾绍东等^[3]采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定猪尿中克伦特罗的残留。然而大多数报道的文献在分析研究克伦特罗危害时，通常不精确评估克伦特罗的两个对映体的具体危害，将所有对映体视为同一物质来对待，而事实上不同结构对映体存在不同的毒性、药理活性和代谢差异^[4,5]，这种研究方法必然导致对其危害评估不准确。为了进一步研究克伦特罗对映体之间的生物活性差异，迫切需要建立一种克伦特罗对映体的高效分析方法。

目前，高效液相色谱法^[6,7]、毛细管电泳法^[8,9]、液相色谱串联质谱法^[10-13]等检测方法被广泛的用于分析测定克伦特罗对映体。但这些报道的方法通常存在分离度不佳、分析时间过长、色谱峰形较差、有机试剂用量大等问题。近年来超高效合相色谱法(UPC²)受到了广泛关注，该技术是将传统超临界流体色谱技术(SFC)与超高效液相色谱技术(UPLC)的优势相互补充，改进了传统超临界流体色谱仪的各项硬件^[14]，利用超临界CO₂与少量有机试剂(甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇等)为流动相，通过精确调节两种流动相之间的比例、系统动态背压和柱温来获得所需要的系统分辨率，从而精确调控目标化合物对映体的分离度和保留时间，在手性分离上具有显著的优势而被广泛应用^[15]。近年来的研究显示，相比传统色谱技术，UPC²技术更适合于分析传统液相色谱难以分离的手性对映体及类似物，已被广泛应用于酚酸类化合物^[16]、三唑类农药^[17]、酚类精油^[18]、色素^[19]等。目前，UPC²技术应用于克伦特罗对映体的拆分及含量测定未见有报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，该方法方法具有分离效果好、分析速度快、有机溶剂用量少等特点，可为进一步研究克伦特罗的药理和开发副作用更小的新药提供技术支持。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，克伦特罗对映体为(+)-克伦特罗对映体和(-)-克伦特罗对映体，该方法猪尿试样经乙酸乙酯提取，阳离子交换固相萃取柱净化，分析条件如下：采用CHIRALPAK IA-3分离，以超临界二氧化碳-0.5％(v/v)醋酸铵甲醇溶液为流动相，梯度洗脱；流速：2.0mL/min；系统背压：13.8MPa；进样量：10μL；柱温：40℃；检测波长：241nm。

作为优选，提取方法如下：准确吸取10mL猪尿于50mL塑料离心管中，加入20mL0.02mol/L醋酸铵溶液，涡旋混匀后，加入2.5mL 50％三氯乙酸溶液，涡匀，8500r/min离心5.0min，过滤，分别采用20mol/L和2mol/L氢氧化钠溶液调节滤液pH至10.0±0.05，加入20mL乙酸乙酯，涡匀，4700r/min离心3.0min，取上层清液于100mL浓缩瓶中；重复提取一次，合并有机相，浓缩至干，用3mL 2％甲酸水溶液溶解，待净化。

作为优选，取待净化溶液于活化好的PCX阳离子固相萃取柱中，上样后，依次用3mL2％甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干后，用6mL 5％(v/v)氨水甲醇溶液洗脱，在40℃水浴中氮气吹干上述洗脱液，待试管冷却后准确加入0.2mL正庚烷复溶，涡匀，过0.22μm有机系滤膜后，再装入有内衬管的进样小瓶中，待测。

作为优选，该方法外消旋体标准溶液的制备方法如下：克伦特罗储备液1.0g/L：准确称取0.01g克伦特罗外消旋体标准品，精确至0.1mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液；克伦特罗外消旋体标准品CAS号：129138-58-5，纯度≥98.0％，BePure公司。

作为优选，该方法对映体标准溶液的制备方法如下：

1)两种克伦特罗对映体储备液1.0g/L：分别准确称取0.01g(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗标准品，精确至0.1mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液；

2)两种克伦特罗对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准溶液，用正庚烷逐级稀释至50、100、200、1000、5000、10000μg/L的混合工作溶液。

作为优选，该方法流动相：A为CO2，B为0.5％(v/v)醋酸铵甲醇溶液梯度洗脱程序：0～2.0min(7％B)，2.0～2.1min(7％～20％B)，2.1～6.0min(20％B)，6.0～6.1min(20％～7％B)，6.1～8.0min(7％B)。

作为优选，该方法两种克伦特罗对映体在50～10000μg/L范围内线性相关系数大于0.9998，方法定量限(S/N＝10)均为1.0μg/L。

作为优选，该方法猪尿中克伦特罗对映体在1.0～20.0μg/L范围内的添加回收率为76.4％～94.5％，相对标准偏差(RSD)为3.6％～6.6％。

作为优选，该方法采用正庚烷作为定容试剂，2种克伦特罗对映体在6.0min内实现了有效拆分。

本发明由于采用了上述的技术方案，试样经乙酸乙酯提取，阳离子交换固相萃取柱净化，采用CHIRALPAK IA-3(4.6mm×100mm，3μm)分离，以超临界二氧化碳-(0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液为流动相，以流速2.0mL/min梯度洗脱，检测波长为241nm时，两种克伦特罗对映体分离效果最好。两种克伦特罗对映体在50～10000μg/L范围内线性相关系数大于0.9998，方法定量限(S/N＝10)均为1.0μg/L。猪尿中克伦特罗对映体在1.0～20.0μg/L范围内的添加回收率为76.4％～94.5％，相对标准偏差(RSD)为3.6％～6.6％。应用所建立的方法对克伦特罗外消旋体标准品和猪尿实际样品进行了拆分及测定，结果显示，克伦特罗外消旋体含有(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗两种对映体，含量分别为5.6mg/L和5.5mg/L，该计算结果与文献报道克伦特罗外消旋体中两种克伦特罗对映体的比例基本相符。20份猪尿实际样品中均未检出(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗。本方法具有分析速度快、分离效果好、重现性好、有机溶剂消耗少等特点，可用于猪尿样品中克伦特罗对映体含量的测定，为手性药物开发、使用及相关法规的制定提供科学支撑。

附图说明

图1克伦特罗不同对映体的结构式，其中：a为(+)-克伦特罗，b为(-)-克伦特罗。

图2不同系统背压对(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗对映体分离效果的影响((0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液，40℃)；其中：a.10.3MPa；b.13.8MPa；c.17.2MPa；d.20.7Mpa。

图3不同定溶剂对(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗分离效果的影响((0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液，13.8Mpa，40℃)；其中：a.甲醇；b.乙醇；c.乙腈；d.异丙醇；e.正庚烷。

图4不同梯度条件变化图；其中：a.梯度分离条件1；b.梯度分离条件2；c.梯度分离条件3；d.梯度分离条件4。

图5不同梯度条件对(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗分离效果的影响((0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液，13.8Mpa，40℃)；其中：a.梯度分离条件1；b.梯度分离条件2；c.梯度分离条件3；d.梯度分离条件4。

图6固相萃取柱对(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗净化效果和回收率的影响((0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液，13.8Mpa，40℃)；其中：a.HLB；b.MCX；c.PCX；d.WCX。

图7克伦特罗外消旋体的拆分((0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液，13.8Mpa，40℃)；其中：a.克伦特罗外消旋体标准品；b.(+)-克伦特罗；c.(-)-克伦特罗。

具体实施方式

1实验部分

1.1仪器、材料与试剂

超高效合相色谱仪(美国Waters公司)；台式离心机(美国Thermo公司)；AE260电子天平(瑞士Mettler公司)；R215旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；超纯水净化系统(英国Elga公司)；MS2涡旋混匀器(上海医大仪器厂)；氮吹仪(日本东京理化公司)；S220酸度计(瑞士Mettler公司)

乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、异丙醇、正庚烷(色谱纯，西班牙Scharlau公司)；醋酸铵、氨水(优级纯)，氢氧化钠(优级纯)；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。

聚合物固相萃取小柱(Oasis HLB 3mL，60mg)、混合型强阳离子交换固相萃取柱(Oasis MCX 3mL，60mg)、混合型阳离子交换固相萃取柱(Agela PCX 3mL，60mg)、混合型弱阳离子交换固相萃取柱(Oasis WCX 3mL，60mg)：使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL10mmol/L盐酸对柱子进行活化。

手性分离色谱柱：多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱CHIRALPAK IA-3(4.6mm×100mm，3μm，硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))(大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)。

克伦特罗外消旋体(CAS号：129138-58-5，纯度≥98.0％，BePure公司)。两种克伦特罗对映体：(+)-克伦特罗、(-)-克伦特罗(纯度均大于98.0％，上海勤路生物技术有限公司)。

1.2标准储备液及工作液的配置

1.2.1外消旋体标准溶液

克伦特罗储备液(1.0g/L)：准确称取0.01g(精确至0.1mg)上述克伦特罗外消旋体标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液。

1.2.2对映体标准溶液

两种克伦特罗对映体储备液(1.0g/L)：分别准确称取0.01g(精确至0.1mg)(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配成1.0g/L的标准储备液。

两种克伦特罗对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准溶液，用正庚烷逐级稀释至50、100、200、1000、5000、10000μg/L的混合工作溶液。

1.3样品前处理

1.3.1样品提取

准确吸取10mL猪尿于50mL塑料离心管中，加入20mL 0.02mol/L醋酸铵溶液，涡旋混匀后，加入2.5mL 50％三氯乙酸溶液，涡匀，8500r/min离心5.0min，过滤，分别采用20mol/L和2mol/L氢氧化钠溶液调节滤液pH至10.0±0.05，加入20mL乙酸乙酯，涡匀，4700r/min离心3.0min，取上层清液于100mL浓缩瓶中。重复提取一次，合并有机相，浓缩至干，用3mL 2％甲酸水溶液溶解，待净化。

1.3.2净化

取待净化溶液于活化好的PCX阳离子固相萃取柱中，上样后，依次用3mL 2％甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干后，用6mL氨水甲醇溶液(1:19，体积比)洗脱，在40℃水浴中氮气吹干上述洗脱液，待试管冷却后准确加入0.2mL正庚烷复溶，涡匀，过0.22μm有机系滤膜后，再装入有内衬管的进样小瓶中，待测。

1.4分析条件

色谱柱：CHIRALPAK IA-3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A为CO₂，B为含10mol/L醋酸铵的甲醇溶液(0.5:99.5，体积比)(下同)；梯度洗脱程序：0～2.0min(7％B)，2.0～2.1min(7％～20％B)，2.1～6.0min(20％B)，6.0～6.1min(20％～7％B)，6.1～8.0min(7％B)；系统背压：13.8MPa；流速：2.0mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃；检测波长：241nm。

2结果与讨论

2.1系统背压的选择

UPC²采用超临界状态的CO₂作为流动相，通过系统背压和温度的调整可有效改变的CO₂的密度，从而改变其对物质的溶解能力、洗脱能力和选择性。由于二氧化碳的温度超过31℃且压力超过7.38MPa以上，CO₂才会进入超临界二氧化碳状态。因此本实验以(0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液作为助溶剂，在柱温40℃条件下考察系统背压在10.3MPa～20.7MPa范围内对克伦特罗对映体分离的影响(见图2)。结果显示，随着系统背压的升高，分析物的保留时间提前。4种条件下，2种克伦特罗对映体在系统背压13.8MPa时色谱峰形和分离度均达到最佳。综合考虑保留时间、峰形及系统压力，本研究选择背压为13.8MPa。

2.2定容试剂的选择

使用五种定容试剂：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷对10mg/L的克伦特罗对映体进行拆分，结果如图3所示，当用甲醇和乙醇作为定容试剂时，目标物峰形和分离度较差；当用乙腈、异丙醇和正庚烷作为定容试剂时，2种克伦特罗对映体的色谱峰均在6.0min内实现了完全分离，但相比异丙醇和乙腈两种定容试剂，正庚烷作为定容试剂时，目标物的色谱峰分离度更好，峰形更尖锐。因此，最后确定正庚烷为本实验定容试剂。

2.3不同梯度

为了获取最佳的梯度分离条件，本文考察了不同梯度分离条件1、2、3和4对(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗分离效果的影响。流动相：A为CO2，B为(0.5:99.5，体积比)醋酸铵甲醇溶液。梯度分离条件1：0～2.0min(7％B)，2.0～2.1min(7％～20％B)，2.1～4.0min(20％B)，4.0～4.1min(20％～7％B)，4.1～6.0min(7％B)；梯度分离条件2：0～2.0min(7％B)，2.0～2.1min(7％～20％B)，2.1～5.0min(20％B)，5.0～5.1min(20％～7％B)，5.1～8.0min(7％B)；梯度分离条件3：0～2.0min(7％B)，2.0～2.1min(7％～20％B)，2.1～6.0min(20％B)，6.0～6.1min(20％～7％B)，6.1～8.0min(7％B)；梯度分离条件4：0～2.0min(5％B)，2.0～2.1min(7％～25％B)，2.1～6.0min(25％B)，6.0～6.1min(25％～7％B)，6.1～8.0min(7％B)(见图4)。

由图5可见，采用梯度4的分离条件，两种克伦特罗对映体未完全分离；图5a、图5b和图5c分别采用梯度分离条件1、2和3，实现了(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗的完全分离，但2种克伦特罗对映体在梯度条件3时色谱峰形和基线均达到最佳，故本实验采用梯度条件3。

2.4净化条件的优化

实验对比了HLB、MCX、PCX和WCX等固相萃取柱对猪尿中克伦特罗对映体净化效果和回收率的影响(见图6)。结果表明，采用HLB和WCX柱净化时，克伦特罗对映体在“1.3.2”淋洗条件下几乎全部流失，造成洗脱液中剩余目标物含量较少，回收率很低。采用MCX和PCX柱净化时，2种克伦特罗对映体的回收率均可达86.0％以上，且PCX柱净化时，杂质峰对(-)-克伦特罗的干扰更小。因此，实验最终选择PCX柱作为固相萃取柱。

2.5线性范围和定量限

将(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗的系列混合标准溶液按上述色谱条件进行测定。以标准品的峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。结果表明，两种克伦特罗对映体在50～10000μg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.9998(见表1)。通过在不含有克伦特罗的猪尿空白样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以信噪比(S/N)＝10计算定量限(LOQ)，得到(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗的LOQ均为1.0μg/L。

表1各个化合物的线性范围、线性方程、相关系数、定量限

2.6回收率和精密度

采用分别在不含有克伦特罗的猪尿空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定和方法的精密度测定，(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗的添加水平分别为1.0，5.0，20.0μg/L，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。两种克伦特罗对映体的回收率范围为76.4％～94.5％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为3.6％～6.6％。该回收率和精密度符合SN/T 0001-2016^[20]的要求，能够满足猪尿样品的分析要求，可用于日常分析的检测。

表2猪尿空白样品中2种克伦特罗对映体的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)

2.7方法的应用

2.7.1实际样品的测试

为了考察本方法的有效性和实用性，应用所建立的方法对20份从养猪场抽取的猪尿样品中(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗的含量进行测定。结果显示，20份猪尿样品中均未检出(+)-克伦特罗和(-)-克伦特罗。

2.7.2外消旋体标准品的拆分

采用本文建立的方法对所采购的克伦特罗外消旋体标准品进行拆分及测定，如图7a所示，2种克伦特罗对映体在6.0min内实现了有效拆分，按照色谱峰的保留时间顺序，依次为：(+)-克伦特罗、(-)-克伦特罗。根据上述所绘制的标准曲线，采用外标定量法计算克伦特罗外消旋体标准品中2种克伦特罗对映体的含量，其中(+)-克伦特罗的含量为5.6mg/L,(-)-克伦特罗的含量为5.5mg/L。该计算结果与文献^[11]报道工业品克伦特罗外消旋体中(+)-克伦特罗与(-)-克伦特罗的比例为1.02:1.00基本相符。

3结论

本文优化了猪尿样品中克伦特罗对映体的净化方法、仪器色谱分离条件等主要参数，建立了超高效合相色谱法拆分克伦特罗的两种对映体及测定其对映体在猪尿中含量的方法。同时还利用所建立的优化方法对克伦特罗外消旋体标准品和实际猪尿样品进行了分析测定。研究结果表明，本方法具有分离效果好、分析速度快、绿色环保、灵敏度高等特点，能够满足猪尿样品中克伦特罗对映体含量测定的需要。

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Claims (6)

1.超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，克伦特罗对映体为（+）-克伦特罗对映体和（-）-克伦特罗对映体，其特征在于，该方法将猪尿试样经乙酸乙酯提取，阳离子交换固相萃取柱净化；

1）提取方法如下：准确吸取10 mL猪尿于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 0.02 mol/L醋酸铵溶液，涡旋混匀后，加入2.5 mL 50%三氯乙酸溶液，涡匀，8500 r/min离心5.0 min，过滤，分别采用20 mol/L和2 mol/L氢氧化钠溶液调节滤液pH至10.0±0.05，加入20 mL乙酸乙酯，涡匀，4700 r/min离心3.0 min，取上层清液于100 mL浓缩瓶中；重复提取一次，合并有机相，浓缩至干，用3 mL 2%甲酸水溶液溶解，待净化；

2）取待净化溶液于活化好的PCX阳离子固相萃取柱中，上样后，依次用3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干后，用6 mL 5%v/v氨水甲醇溶液洗脱，在40 ℃水浴中氮气吹干上述洗脱液，待试管冷却后准确加入0.2 mL正庚烷复溶，涡匀，过0.22 μm有机系滤膜后，再装入有内衬管的进样小瓶中，待测；

3）分析条件如下：采用CHIRALPAK IA-3分离，以超临界二氧化碳-0.5%v/v醋酸铵甲醇溶液为流动相，梯度洗脱；流速：2.0 mL/min；系统背压：13.8 MPa；进样量：10 µL；柱温：40℃；检测波长：241 nm；流动相：A为CO₂，B为0.5%v/v醋酸铵甲醇溶液梯度洗脱程序：0~2.0min 7%B，2.0~2.1 min 7%～20%B，2.1～6.0 min 20%B，6.0～6.1 min 20%～7%B，6.1～8.0min 7%B。

2.根据权利要求1所述的超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，其特征在于，该方法外消旋体标准溶液的制备方法如下：克伦特罗储备液1.0 g/L：准确称取0.01 g克伦特罗外消旋体标准品，精确至0.1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液；克伦特罗外消旋体标准品CAS号：129138-58-5，纯度≥98.0%，BePure公司。

3.根据权利要求2所述的超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，其特征在于，该方法对映体标准溶液的制备方法如下：

1）两种克伦特罗对映体储备液1.0 g/L：分别准确称取0.01 g（+）-克伦特罗和（-）-克伦特罗标准品，精确至0.1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液；

2）两种克伦特罗对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准溶液，用正庚烷逐级稀释至50、100、200、1000、5000、10000 µg/L的混合工作溶液。

4.根据权利要求1所述的超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，其特征在于，该方法两种克伦特罗对映体在50 ~ 10000 µg/L范围内线性相关系数大于0.9998，方法定量限S/N=10均为1.0 µg/L。

5.根据权利要求1所述的超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，其特征在于，该方法猪尿中克伦特罗对映体在1.0 ~ 20.0 µg/L范围内的添加回收率为76.4% ~ 94.5%，相对标准偏差RSD为3.6% ~ 6.6%。

6.根据权利要求1所述的超高效合相色谱拆分及检测猪尿中的克伦特罗对映体残留的方法，其特征在于，该方法采用正庚烷作为定容试剂，2种克伦特罗对映体在6.0 min内实现了有效拆分。

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