JP6825330B2

JP6825330B2 - オートファジー誘導剤

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Publication number: JP6825330B2
Application number: JP2016229146A
Authority: JP
Inventors: 池本　一人; 一人池本
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2021-02-03
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: US20180147200A1; US10406151B2; JP2018083790A

Description

本発明はピロロキノリンキノンを含むオートファジー誘導剤に関する。

オートファジーとは細胞の中でモノを分解する仕組みの一つである。細胞質にあるものを消化オルガネラであるオートファゴソーム（リソソーム）に運んで分解するシステムの総称である。オートファジーは飢餓になった際に細胞が自分自身を消化して再利用する仕組みの一つである。生体にとって、細胞の増殖と細胞死の均衡を保ち恒常性を維持することは重要である。オートファジーはこの恒常性に関連している。

オートファジーは、特にアミノ酸の再利用に働く細胞機能として理解されている。培養細胞では、培養液中のアミノ酸が欠如した培養液で培養した場合に、細胞にオートファジーが誘導されることが知られている（非特許文献1）。オートファジーは飢餓状態に耐えて、細胞が生き残るのに重要で、酵母などではオートファジーを阻害して飢餓状態にすると細胞がすぐに死亡する。この場合、オートファジーは細胞の延命に作用する機構であるともいえる。

オートファジーが関連するからだの不調は多く報告されている。(非特許文献2)。また、疾患原因が外来である感染に関しても重要な働きを有している。例えば、細胞質内に感染した細菌やウイルスの排除に関連することが報告されている（非特許文献3-4参照）。

オートファジーを誘導することができれば、炎症抑制、病原体による感染防御等ができるものと期待される。オートファジーは自然免疫を強化する特徴であると考えられている。オートファジー誘導作用を有する飲食品や医薬品についてはわずかに知られている。

オートファジーを生じさせる物質はラパマイシンが知られている。ラパマイシンは微生物由来の抗生物質で免疫抑制効果がある。しかしながら、ラパマイシンは安定ではなく摂取するために特殊な加工を実施する必要がある（非特許文献5）。また、薬剤が処方薬であり、一般的に用意することができる素材ではない。

食品として梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物を含有するオートファジー誘導用飲食品およびオートファジー誘導剤が報告されている(特許文献1)。これは抽出物であるため、成分の変動を避けることができない。また、抽出物には多数の成分が含まれているが、どの成分がオートファジー誘導に関与しているのかを検証する必要性も残されている。

ピロロキノリンキノンはPQQと呼ばれ、実際にはピロロキノリンキノンジナトリウム塩が食品として使用されている。この物質は脳機能向上、抗酸化活性がある物質として知られている(特許文献2)。ピロロキノリンキノンは式1で表される物質である。
この物質についてオートファジーとの関連性については知られていない。

オートファジーが誘導できる食品、組成物、方法が求められているが、食品に利用可能な成分のうち、単独でオートファジーを誘導するものは知られていない。

特開2007-143452号公報国際公開公報WO2011/007633

Jun Araya, Hiromichi Hara, Kazuyoshi Kuwano, Internal Medicine Vol. 52 (2013) No. 20 p. 2295-2303 Ruocco, Susan Costantini and Maria Costantini, Mar. Drugs 2016, 14, 138; doi:10.3390/md14070138 Jackson WT, et al., PLoS Biol. 2005 May, 3(5), e156. Epub 2005 Apr 26. Nayeli Shantal Castrejon-Jimenez, Kahiry Leyva-Paredes, Juan Carlos Hernandez-Gonzalez, Julieta Luna-Herrera, Blanca Estela Garcia-Perez, BioScience Trends, Vol. 9 (2015) No. 3 p. 149-159 David E. Harrison, Randy Strong, Zelton Dave Sharp, James F. Nelson, Clinton M. Astle, Kevin Flurkey, Nancy L. Nadon, J. Erby Wilkinson, Krystyna Frenkel, Christy S. Carter, Marco Pahor, Martin A. Javors, Elizabeth Fernandez & Richard A. Miller, Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice, Nature 460, 392-395 (16 July 2009) | doi:10.1038/nature08221.

本発明は、オートファジー誘導剤及びその用途を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく、種々の化合物について検討を行ったところ、ピロロキノリンキノンがオートファジーを誘導することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［1］以下の一般式で表される化合物
（上記一般中、Rは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数1〜10の炭化水素基を表す）
のうちのいずれか1つ以上及び／又はその塩を含むオートファジー誘導剤。
［2］前記塩がナトリウム塩である、［1］に記載のオートファジー誘導剤。
［3］一般式(4)で表される化合物であって、少なくとも1つのRがメチルである化合物を含む、［1］又は［2］に記載のオートファジー誘導剤。
［4］以下の一般式で表される化合物
（上記一般中、Rは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数1〜10の炭化水素基を表す）
のうちのいずれか1つ以上及び／又はその塩を有効成分として含む、オートファジーを誘導するための飲食品組成物。

本発明によれば、ピロロキノリンキノンの高いオートファジー誘導作用を利用した飲食品及び医薬品を提供することができる。

〔ピロロキノリンキノン及びその誘導体〕
本発明に係るオートファジー誘導剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体を有効成分として含む。以下、オートファジー誘導において用いられ得るピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体について詳細に説明する。ピロロキノリンキノン及びその誘導体としては、特に限定されないが、例えば、下記一般式(2)、(3)又は(4)で表される化合物又はその塩が挙げられる。なお、本願明細書ではピロロキノリンキノン及びその誘導体を総称して単に「ピロロキノリンキノン」とも言う。

（上記一般式(2)、(3)、(4)中、Rは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数1〜10の直鎖又は分枝鎖を有する炭化水素基を示し、Rは、炭素原子数1〜10の炭化水素基を示す。）
Rで示される炭素原子数1〜10の直鎖又は分枝鎖を有する炭化水素基としては、特に限定されないが、例えば、アルキル、アリルが挙げられる。この中でも、合成が容易であるという理由から、炭素原子数1〜3、特に炭素原子数1〜2の直鎖状アルキルが好ましい。合成の容易さの観点に加え、水溶性を維持できることから、Rはメチルであることがより好ましい。なお、Rで示される炭素原子数1〜10の炭化水素基は、炭素原子のほか、酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。

〔一般式(2)で表される化合物又はその塩〕
上記一般式(2)中、Rが全て水素原子である化合物は、酸化型ピロロキノリンキノンという。該酸化型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。

上記一般式(2)中、1つ以上のRが水素原子であることが好ましい。1つ以上のRが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になるためにトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。

上記一般式(2)で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、酸化型ピロロキノリンキノン；酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジカリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリカリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。このなかでも、入手しやすさの観点から、酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンナトリウム塩が好ましい。

〔一般式(3)又は(4)で表される化合物又はその塩〕
上記一般式(3)又は(4)中、Rが全て水素原子である化合物は、酸価型ピロロキノリンキノンが還元されてできた還元型ピロロキノリンキノンという。還元型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。

一般式(3)又は(4)中、1つ以上のRが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になる。そのため、塩の形態の方がトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。

上記一般式(3)又は(4)で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、還元型ピロロキノリンキノン；還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジカリウム、還元型ピロロキノリンキノントリカリウムのような還元型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。このなかでも、製造しやすさの観点から、還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムが好ましい。

上記一般式(4)中、少なくとも1つ以上のRがメチルであることが好ましい。メチル化されるRは特に限定されないが、キノン部のアルコキシ基を構成するRのいずれか一方がメチルであるヘミアセタール体、あるいはキノン部のアルコキシ基を構成するRの両方がメチルであるアセタール体が好ましい。

ピロロキノリンキノンの安全性は高く、ラットへの経口摂取試験や、細胞や動物における遺伝毒性の検討、ヒトでの試験などで食品素材としての安全性が確認されている。しかしながら、驚くべきことに、一般式(4)で表されるような、キノン部がアセタール化されたものは特に安全性が高いことが確認された。

〔ピロロキノリンキノン及びその誘導体の製造方法〕
ピロロキノリンキノンの製造方法としては、特に限定されないが、例えば、有機化学的に合成する方法又は発酵法が挙げられる。このなかで発酵法とは、例えば、メタノール資化性を有し、かつピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを使用して培養することによりピロロキノリンキノンを製造する方法である。

ピロロキノリンキノンの誘導体、具体的にはピロロキノリンキノンのエステル体等又はピロロキノリンキノンの塩は、このようにして得られたピロロキノリンキノンを出発物質として、常法に従って合成することができる。ピロロキノリンキノン及びその誘導体は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、又は溶媒抽出法等の通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、NMRスペクトル、IRスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。

本発明のオートファジー誘導剤は種々の用途に適用することが想定される。オートファジーによる機能性食品としてオルガネラ分解、抗腫瘍作用、細胞内浄化、抗原提示機能を有する食品として使用できる。例えば、本発明のオートファジー誘導剤は、種々の一般飲食品のみならず、栄養強化が必要な個体、特に、オートファジーに起因する自然免疫活性化、抗炎症作用活性化を必要とする個体が摂取可能なように、機能性が表示されている飲食品、例えば特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、機能性表皮飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、その他の健康飲食品、あるいは医薬品、医薬用部外品、化粧品に含めることができる。

オートファジー誘導剤はそのままの状態で組成物に含まれることもあれば、加工したものを組成物に添加してもよい。組成物には他の生理活性成分や賦形剤等の添加剤を加えることもできる。

オートファジー誘導剤が配合される組成物の形態も特に限定されず、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、ゼリー状等にすることができる。特定の形態について更に加工してもよく、例えば、圧縮打錠することで得られた錠剤状の組成物の表面を被覆したりすることもできる。また、粉体を顆粒状に造粒することや、粉体や造粒した顆粒を詰めてカプセル化することもできる。

本発明の組成物は錠剤、粉末の食品として使用できる。また、他の食品に栄養強化の目的で添加できる。別の態様として、本発明の組成物は飲食品そのものに添加される調味料として使用することもできる。

飲食品の形態は、特に制限されず、ドリンク剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ペースト剤、練り製品、発酵食品、菓子等が挙げられる。このような飲食品には、保存料、着色料、甘味料、酸化防止剤、増粘安定剤、乳化剤、調味料、防腐剤等の食品添加物、天然物等を適宜配合することができる。特に好ましい飲食物はオートファジー誘導をする清涼飲料水、お茶、コーヒー、エナジー飲料、カプセル、タブレットが挙げられる。

また、ピロロキノリンキノン又はその塩を有効成分とする医薬品とするには、適宜、薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、嬌味嬌臭剤等を使用して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口的に投与する製剤とするのが好ましい。

本発明の有効投与量は、通常5mg〜150mg／日（成人）とするのが好ましい。ピロロキノリンキノンの添加量は1回の食事量として1.66から50mgが好ましい。より具体的にはペットボトル飲料500mlの場合、そこに含まれる量は1.66から50mgが好ましい。より好ましくは3から40mgである。また、カプセル剤、錠剤に含まれる量も1回に1錠で服用の場合、好ましくは3から40mgである。しかしながら、これらの値はいずれも例示であり、ピロロキノリンキノンの投与量や配合量は、所望とするオートファジー誘導効果を損なわない範囲で当業者が適宜決定することができる。

以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。

（実施例1）ピロロキノリンキノンジナトリウム（disodium 4,5-dioxo-4,5-dihydro-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid）
下記の構造式を有する三菱瓦斯化学株式会社製ピロロキノリンキノンジナトリウム（製品名BioPQQ（登録商標））を実施例1の化合物として使用した。

（実施例2）ピロロキノリンキノントリメチルエステル（trimethyl 4,5-dioxo-4,5-dihydro-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylate）（PQQTME）の製造
ピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液に大過剰の塩酸を加え、析出した固体を濾過することで赤色固体を得た。この固体32gをDMF300gに30℃程度に加温して溶解した。得られた溶液に炭酸カリウム30gを加え、硫酸ジメチル350gを混合すると、30分後に反応熱で50℃に上昇した。室温に下がったら追加で炭酸カリウム30gを溶液に添加した。溶液を3日室温で攪拌した後水1Lに加え、2N 塩酸30gと一緒に混合した。反応液を濾過し、残渣をイソプロパノールで洗浄することで表題の化合物を得た。

（実施例3）還元型ピロロキノリンキノン（4,5-dihydroxy-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid）の製造
ピロロキノリンキノンジナトリウム3.0gを水1.2Lに溶かした。アスコルビン酸30gと水120gと2N塩酸2.5gを混合し、温度を12℃にすることで得られた溶液とピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液とを2時間かけて攪拌しながら混合した。2時間撹拌して得られた混合溶液のpHは2.96であった。撹拌終了後、20℃で18時間更に攪拌した。これに2N塩酸2.5gを混合し、1時間攪拌した。ブフナーロートで溶液を濾過し、残渣を2N塩酸5ml、50%エタノール水8mlで洗った。減圧乾燥を室温20時間行い、黄色の含水結晶3.35gとしての表題の化合物を得た。

（実施例4）モノメチル化ピロロキノリンキノン（7-(methoxycarbonyl)-4,5-dioxo-4,5-dihydro-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,9-dicarboxylic acid）の製造
表題の化合物は、酢酸エチル抽出を省略した点を除き、特開平5-70458号公報に記載の方法を用いて以下のとおり合成した。

ピロロキノリンキノントリメチルエステル 4gに対しアセトニトリル400gを添加し、更にK₂CO₃ 5.5gを水400gに溶解した溶液を加えた。得られた溶液を2日間室温で混合した。この溶液に濃塩酸12.5g加え、エバポレーターでアセトニトリルを除去した。析出物をろ過し、得られた残渣を減圧乾燥することでモノメチル化ピロロキノリンキノン4.07gを得た。

（実施例5）ピロロキノリンキノントリメチルエステルのアセタール体(trimethyl 4,4-dimethoxy-5-oxo-4,5-dihydro-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylate)の製造
J. Am. Chem. Soc., 1993, 115 (22), pp 9960-9967に記載の方法にもとづき、式(5)の化合物を調製した。

オートファジー評価および細胞死に関する濃度測定
細胞は5%CO₂、37℃で培養した。培地はインビトロジェンギブコ製D-MEMに10％分牛胎児血清を加えたものを使用した。

実施例1〜5の各サンプルを121℃で滅菌処理した水と混合し、濃度が2g/Lになるように水溶液を調製した。HeLa細胞をプレートに対し、5000cell/wellで撒き、一晩後、2g/Lの評価物質水溶液を添加して、希釈系列を調製した。1日培養後、Cyto-ID（登録商標）オートファジー検出キット（コスモ・バイオ株式会社製）を使用して、蛍光顕微鏡観察でオートファジーの起こる範囲を測定した。顕微鏡観察で蛍光が出るのを確かめ、キットに付属のラパマイシンと同様の蛍光強度を標準として評価した。また、同様に50％細胞死濃度を細胞数測定キットである同仁化学製cell counting kit8を使用して傾きから求めた。結果を表1に示す。

表1の結果から、ピロロキノリンキノンはオートファジーを誘導することが明らかになった。また、オートファジー誘導効果が確認されたピロロキノリンキノン濃度は細胞死の濃度と離れており、ピロロキノリンキノンによるオートファジー誘導効果は健康の観点から有効性が高いといえる。比較例ではオートファジーが生じておらず、使用した溶液の影響は小さい。ピロロキノリンキノン類の中でも、ピロロキノリンキノントリメチルエステルのアセタール体が最も毒性が低くて効果があった。キノン部のアセタール化は毒性を下げる効果がある。アセタール化反応をキノンに行うことはオートファジー誘導に効果的である。

本発明に係るオートファジー誘導剤によれば、自然免疫を高め、抗炎症性飲食品又は抗炎症剤として有用な飲食品の提供が可能になる。

Claims

以下の一般式で表される化合物
（上記一般中、Rは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数1〜10の炭化水素基を表す）
のうちのいずれか1つ以上及び／又はその塩を含むオートファジー誘導剤。
前記塩がナトリウム塩である、請求項1に記載のオートファジー誘導剤。
一般式(4)で表される化合物であって、少なくとも1つのRがメチルである化合物を含む、請求項1又は2に記載のオートファジー誘導剤。
以下の一般式で表される化合物
（上記一般中、Rは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数1〜10の炭化水素基を表す）
のうちのいずれか1つ以上及び／又はその塩を有効成分として含む、オートファジーを誘導するための飲食品組成物。