JP6103326B2

JP6103326B2 - ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶

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Publication number: JP6103326B2
Application number: JP2015540997A
Authority: JP
Inventors: リーピンチュー，; リエリュー，; ジエンロンワン，; リンリンソン，; シュエフェンメイ，; チェンシングー，
Original assignee: ツーチュンハウティエンファームカンパニーリミテッド
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN102942567A; US9695164B2; US20150291583A1; JP2016504277A; EP2918585A4; WO2014071772A1; CN102942567B; EP2918585A1; EP2918585B1

Description

本発明は、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の新規な結晶およびその製造方法に関する。

ピロロキノリンキノン（Pyrroloquinoline Quinone、PQQ）は、最初に微生物から発見された小分子化合物で、細菌における多くの重要の酵素類の補欠分子族で、高等真核生物の体内にも存在し、人体の各組織・器官に幅広く分布している。PQQは、無味無臭の化合物で、その分子式は構造式Iで表される。

近年、PQQに対する研究によると、人体の健康に非常に有利な物質であることがわかった。PQQ欠損のマウスでは、生長が遅く、生殖能力が劣り、かつ関節の炎症が起こりやすいため、体内で必須のビタミンの一つかもしれない。抗酸化剤として、PQQは肝臓をCCl₄またはアルコールによる損傷から守ることができる。精製されたPQQは、ニワトリ胚の発生過程における糖質コルチコイドに誘導される白内障の形成を減少する。PQQは、神経細胞をNMDA毒性の影響から守ることで、脳低酸素虚血を防止し、動物モデルの重篤なショックを避ける。また、PQQは、心筋虚血、心筋梗塞を防止・治療し、有効にアテローム性動脈硬化を予防・治療する作用を有する。

現在、PQQは発酵法や化学合成の方法によって製造することができる。しかし、これらの方法で得られるPQQ二ナトリウム塩は、結晶形が不安定で、吸湿性が強く、常温で保存する温度範囲で、湿度の変化の幅が広く、固形が望ましくないため、PQQ二ナトリウム塩に対する応用および保存に不利な影響を与える。
日本の三菱ガス化学株式会社は、既にPQQ二ナトリウム塩の結晶1（即ち、本特許出願に記載の結晶E）に関して特許を出願した（特許文献1、出願号CN201080031945、出願日：2010年6月9日）。しかしながら、本発明者は研究したところ、当該結晶は、吸湿性が高く、加工および保存に不利であることを見出した。
そのため、薬学、保健学、食品学などの多くの面におけるPQQの応用を考慮すると、本分野では、高純度で高い安定性、優れた加工性および保存性を有するPQQ結晶およびその製造方法が切望されている。

本発明の主な目的の一つは、結晶化度、安定性、吸湿性および/または加工性などの面から、安定したPQQの二ナトリウム塩結晶およびその製造方法を提供する。本発明者は、PQQ二ナトリウム塩の結晶化条件を設計し、スクリーニングして医薬、食品、保健などへの応用に適切な結晶形を得た。

本発明の第一では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Aであって、Cu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、9.6±0.2°、11.6±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、25.6±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°の2θ角度で回折ピークを有する結晶を提供する。

一部の実施形態において、前記結晶AのCu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、9.2±0.2°、 9.6±0.2°、11.6±0.2°、13.5±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.2±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、23.8±0.2°、25.6±0.2°、26. 4±0.2°、27.3±0.2°、28.4±0.2°、30.7±0.2°、31.7±0.2°、32. 4±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°の2θ角度で回折ピークを有する。

ほかの一部の実施形態において、前記結晶AのCu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、基本的に図1に示される通りである。
一つの好適な例において、25℃で、前記二ナトリウム塩の結晶Aは、65〜80％RHにおける吸湿性が3％未満である。
もう一つの好適な例において、25℃で、前記二ナトリウム塩の結晶Aは、65％RHから80％RHに変わる時の吸湿性の変化が1％未満、好ましくは0.6％未満である。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Aは、30〜400℃の範囲内における熱重量分析曲線が基本的に図2に示される通りである。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Aは、二水和物である。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Aは、50〜280℃の範囲内における10℃/minの走査速度で得られる示差走査熱量測定チャートが基本的に図3に示される通りである。

本発明の第二では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Bであって、Cu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、8.1±0.2°、9.0±0.2°、10.1±0.2°、13.7±0.2°、16.4±0.2°、17.6±0.2°、18.2±0.2°、23.9±0.2°、25.8±0.2°、27.2±0.2°、31.0±0.2°、39.5±0.2°の2θ角度で回折ピークを有する結晶を提供する。

一部の実施形態において、前記結晶BのCu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、以下の2θ角度におけるピーク強度がいずれも600未満である。
一つの好適な例において、前記結晶BのCu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、以下の2θ角度におけるピーク強度（2θ/ピーク強度）が9.0°/517、10.1°/366、16.4°/107、23.9°/582、27.2°/511である（ピーク強度は、実験や試料の条件などによってある程度の差があるが、その差の範囲は本分野の一般技術者の予想できる範囲内にある。）。
25℃で、前記二ナトリウム塩の結晶Bは、65〜80％RHにおける吸湿性が12.0％以下である。
一つの好適な例において、25℃で、前記二ナトリウム塩の結晶Bは、65％RHから80％RHに変わる時の吸湿性の変化が1.5％未満、好ましくは1.0％以下である。
ほかの一部の実施形態において、前記結晶BのCu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、基本的に図5に示される通りである。
一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Bは、30〜400℃の範囲内における熱重量分析曲線が基本的に図6に示される通りである。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Bは、二水和物である。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶Bは、50〜280℃の範囲内における10℃/minの走査速度で得られる示差走査熱量測定チャートが基本的に図7に示される通りである。

本発明の第三では、本発明に係る二ナトリウム塩の結晶Aを製造する方法であって、
（A）懸濁結晶化法：20℃〜60℃の温度範囲内で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と平衡になるまで撹拌して懸濁液を得、ろ過して前記二ナトリウム塩の結晶Aを得る方法、
（B）緩慢揮発法：ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と撹拌し、溶解するまで均一に混合し、そして20℃〜60℃の条件で溶媒を揮発させ、前記二ナトリウム塩の結晶Aを得る方法、
（C）貧溶媒沈殿結晶化法：20〜60℃の温度範囲内で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を高溶解度の溶媒に溶解させ、得られた系に低溶解度の貧溶媒を入れて前記二ナトリウム塩の結晶Aを析出させ、ここで、25℃で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の前記高溶解度の溶媒における溶解度が≧0.35 g/100g溶媒で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の前記低溶解度の溶媒における溶解度が≧0.15 g/100g溶媒である方法、
からなる群から選ばれる方法を提供する。

一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、化学合成または発酵生産によって製造される。
もう一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、結晶を含み、あるいは含まない。
もう一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、不純物を含み、あるいは含まず、純度が98％〜100％、好ましくは99％〜100％である。
もう一つの好適な例において、方法（A）〜（C）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが100：1〜1：100である。方法（A）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが100：1〜1：50、好ましくは100：1〜1：1である。方法（B）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが50：1〜1：100、好ましくは10：1〜1：100である。
もう一つの好適な例において、方法（A）〜（C）は、室温〜55℃、好ましくは25〜50℃、より好ましくは室温、25℃または50℃で行われる。
もう一つの好適な例において、方法（A）および（B）では、撹拌時間が2時間以上、好ましくは2時間〜10日、より好ましくは2時間〜7日である。
もう一つの好適な例において、方法（B）では、揮発時間が2時間以上、好ましくは2時間〜14日、より好ましくは2時間〜10日で、前記揮発が真空条件で行われてもよい。
もう一つの好適な例において、高速液相クロマトグラフィーによって測定される、方法（A）〜（C）のいずれかに記載の方法で得られるPQQ二ナトリウム塩の純度が99.0％超、好ましくは99.5％超、より好ましくは99.8％超である。
一部の実施形態において、前記方法（A）、（B）および（C）で使用される溶媒は、それぞれ以下の群から選ばれ、その比率が体積比である。
方法（A）：アセトニトリル、メタノール、エタノール、水、エタン、ヘプタン、メタノール：水、エタノール：水、アセトン：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水、メタノール：ヘキサン、エタノール：ヘキサン、アセトニトリル：ヘキサン、テトラヒドロフラン：ヘキサン、メタノール：メチル-t-ブチルエーテル、エタノール：メチル-t-ブチルエーテル、メタノール：トルエン、エタノール：トルエン、アセトニトリル：トルエン、メタノール：メチルイソブチルケトン、トルエン：エタンで、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
方法（B）：メタノール：水、エタノール：水、イソプロパノール：水、アセトン：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水で、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が10：1〜1：10、好ましくは5：1〜1：5である。
方法（C）では、高溶解度の溶媒が水で、低溶解度の貧溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランから選ばれる。
一つの好適な例において、25℃で方法（A）を行う場合の溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、水、メタノール：水、エタノール：水、アセトン：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水、メタノール：ヘキサン、エタノール：ヘキサン、アセトニトリル：ヘキサン、テトラヒドロフラン：ヘキサン、メタノール：メチル-t-ブチルエーテル、エタノール：メチル-t-ブチルエーテル、メタノール：トルエン、エタノール：トルエン、アセトニトリル：トルエン、メタノール：メチルイソブチルケトンからなる群から選ばれ、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
もう一つの好適な例において、50℃で方法（A）を行う場合の溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、エタン、ヘプタン、メタノール：水、エタノール：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水、メタノール：ヘキサン、エタノール：ヘキサン、アセトニトリル：ヘキサン、トルエン：ヘキサン、メタノール：メチル-t-ブチルエーテル、エタノール：メチル-t-ブチルエーテル、メタノール：トルエン、エタノール：トルエン、アセトニトリル：トルエン、メタノール：メチルイソブチルケトンからなる群から選ばれ、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
もう一つの好適な例において、25℃で方法（B）を行う場合、使用される溶媒は、メタノール：水(1:2〜1:6)、エタノール：水(1:2〜1:6)、イソプロパノール：水(1:2)、アセトン：水(2:9〜1:4)、アセトニトリル：水(2:5〜1:4)、テトラヒドロフラン：水(2:5〜1:4)からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、50℃で方法（B）を行う場合の溶媒は、メタノール：水(1:6)、エタノール：水(1:2)、イソプロパノール：水(1:2)、アセトン：水(2:9)、アセトニトリル：水(2:5〜1:4)、テトラヒドロフラン：水(2:5)からなる群から選ばれる。

本発明の第四では、本発明に係る二ナトリウム塩の結晶Bを製造する方法であって、
（A'）懸濁結晶化法：20℃〜60℃の温度範囲内で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と平衡になるまで撹拌して懸濁液を得、ろ過して前記二ナトリウム塩の結晶Bを得る方法、あるいは
（B'）緩慢揮発法：ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と撹拌し、溶解するまで均一に混合し、そして20℃〜60℃の条件で溶媒を揮発させ、前記二ナトリウム塩の結晶Bを得る方法、
からなる群から選ばれる方法を提供する。
一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、化学合成または発酵生産によって製造される。
もう一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、結晶を含み、あるいは含まない。
もう一つの好適な例において、前記ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、不純物を含み、あるいは含まず、純度が98％〜100％、好ましくは98％〜100％である。
もう一つの好適な例において、方法（A'）〜（B'）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが100：1〜1：100である。方法（A'）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが100：1〜1：50、好ましくは100：1〜1：1である。方法（B'）では、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩と最初に使用される溶媒の質量体積比g/Lが50：1〜1：100、好ましくは10：1〜1：100である。
もう一つの好適な例において、方法（A'）〜（B'）は、室温〜55℃、好ましくは25〜50℃、より好ましくは室温、25℃または50℃で行われる。
もう一つの好適な例において、方法（A'）では、撹拌時間が2時間以上、好ましくは2時間〜10日、より好ましくは2時間〜7日である。
もう一つの好適な例において、方法（B'）では、揮発時間が2時間以上、好ましくは2時間〜14日、より好ましくは2時間〜10日で、前記揮発が真空条件で行われてもよい。
一部の実施形態において、前記方法（A'）および（B'）で使用される溶媒は、それぞれ以下の群から選ばれ、その比率が体積比である。
方法（A'）：アセトン、イソプロパノール、イソアミルアルコール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、メチル-t-ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ニトロメタン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、アセトン：エタン、メチルエチルケトン：エタン、ニトロメタン：エタン、酢酸エチル：エタン、メチル-t-ブチルエーテル：エタン、トルエン：エタン、アセトン：メチル-t-ブチルエーテル、メチルエチルケトン：メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル：メチル-t-ブチルエーテル、テトラヒドロフラン：メチル-t-ブチルエーテル、ニトロメタン：メチル-t-ブチルエーテル、酢酸エチル：メチル-t-ブチルエーテル、アセトン：トルエン、メチルエチルケトン：トルエン、テトラヒドラフラン：トルエン、ニトロメタン：トルエン、酢酸エチル：トルエン、アセトン：メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン：メチルイソブチルケトン、アセトニトリル：メチルイソブチルケトン、テトラヒドロフラン：メチルイソブチルケトン、ニトロメタン：メチルイソブチルケトン、酢酸エチル：メチルイソブチルケトン、メチル-t-ブチルエーテル：メチルイソブチルケトン、トルエン：メチルイソブチルケトン、テトラヒドロフラン：エタンで、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
方法（B'）：イソプロパノール：水、テトラヒドロフラン：水で、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が10：1〜1：10、好ましくは5：1〜1：5、より好ましくは4：1〜1：4である。
一つの好適な例において、25℃で方法（A'）を行う場合の溶媒は、アセトン、イソプロパノール、イソアミルアルコール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、メチル-t-ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ニトロメタン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、アセトン：エタン、メチルエチルケトン：エタン、ニトロメタン：エタン、酢酸エチル：エタン、メチル-t-ブチルエーテル：エタン、トルエン：エタン、アセトン：メチル-t-ブチルエーテル、メチルエチルケトン：メチル-t-ブチルエーテル、アセトニトリル：メチル-t-ブチルエーテル、テトラヒドロフラン：メチル-t-ブチルエーテル、ニトロメタン：メチル-t-ブチルエーテル、酢酸エチル：メチル-t-ブチルエーテル、アセトン：トルエン、メチルエチルケトン：トルエン、テトラヒドロフラン：トルエン、ニトロメタン：トルエン、酢酸エチル：トルエン、アセトン：メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン：メチルイソブチルケトン、アセトニトリル：メチルイソブチルケトン、テトラヒドロフラン：メチルイソブチルケトン、ニトロメタン：メチルイソブチルケトン、酢酸エチル：メチルイソブチルケトン、メチル-t-ブチルエーテル：メチルイソブチルケトン、トルエン：メチルイソブチルケトンで、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
もう一つの好適な例において、50℃で方法（A'）を行う場合の溶媒は、アセトン、イソプロパノール、イソアミルアルコール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メチル-t-ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ニトロメタン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、アセトン：エタン、メチルエチルケトン：エタン、テトラヒドロフラン：エタン、ニトロメタン：エタン、酢酸エチル：エタン、メチル-t-ブチルエーテル：エタン、アセトン：メチル-t-ブチルエーテル、メチルエチルケトン：メチル-t-ブチルエーテル、テトラヒドロフラン：メチル-t-ブチルエーテル、ニトロメタン：メチル-t-ブチルエーテル、酢酸エチル：メチル-t-ブチルエーテル、アセトン：トルエン、メチルエチルケトン：トルエン、テトラヒドロフラン：トルエン、ニトロメタン：トルエン、酢酸エチル：トルエン、アセトン：メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン：メチルイソブチルケトン、アセトニトリル：メチルイソブチルケトン、テトラヒドロフラン：メチルイソブチルケトン、ニトロメタン：メチルイソブチルケトン、酢酸エチル：メチルイソブチルケトン、メチル-t-ブチルエーテル：メチルイソブチルケトン、トルエン：メチルイソブチルケトンで、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が5：1〜1：5、好ましくは2：1〜1：2、より好ましくは1：1である。
もう一つの好適な例において、25℃で、方法（B'）を行う場合、使用される溶媒は、イソプロパノール：水（1：4）である。
もう一つの好適な例において、50℃で、方法（B'）を行う場合の溶媒は、テトラヒドロフラン：水（1：4）からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、高速液相クロマトグラフィーによって測定される、方法（A'）〜（B'）のいずれかに記載の方法で得られるPQQ二ナトリウム塩の純度が98.0％超、好ましくは99％超、より好ましくは99.5％超である。

本発明の第五では、
（I）本発明に係るピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶A、本発明に係るピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶B、本発明に係る方法で製造されるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Aおよび/または本発明に係る方法で製造されるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Bと、
（II）薬学的に、生理学的にまたは製剤学的に許容される担体および/または補助剤と、
を含む組成物または包装品を提供する。
一部の実施形態において、前記組成物または包装品は、薬物組成物、機能性食品、飼料、添加剤、微生物生長抑制剤および防腐剤からなる群から選ばれる。
一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶の添加量は、前記組成物の重量の0.001 wt％〜99.99 wt％、好ましくは0.01 wt％〜99.0 wt％、より好ましくは0.1 wt％〜90 wt％である。
もう一つの好適な例において、前記二ナトリウム塩の結晶の組成物または包装品における形態は、粉末、顆粒、またはマイクロペレットから選ばれ、好ましくは粉末の形態である。
もう一つの好適な例において、前記組成物または包装品は、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症の予防/緩和または治療、微生物生長の抑制、食物の保存時間の延長からなる群から選ばれる一つまたは複数の用途に使用される。
もう一つの好適な例において、前記組成物または包装品は、さらに、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症の予防/緩和または治療、微生物生長の抑制あるいは食物の保存時間の延長からなる群から選ばれる活性の一つまたは複数を有するほかの活性物質を含んでもよい。
本発明の第六では、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症、微生物感染からなる群から選ばれる疾患または症状の予防、緩和または治療に使用される薬物組成物または機能性食品の製造のための、本発明に係るピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶A、本発明に係るピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶B、本発明に係る方法で製造されるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Aおよび/または本発明に係る方法で製造されるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Bの用途を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物または機能性食品は、さらに、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症の予防/緩和または治療、微生物生長の抑制あるいは食物の保存時間の延長からなる群から選ばれる活性の一つまたは複数を有するほかの活性物質を含んでもよい。

本発明の他の主旨は、本文の公開される内容によって、この分野の技術者にとっては明らかになっている。また、本分野の一般技術者は、ここに記載される様々な特徴や方面を有効に組み合わせることができるが、これらの組み合わせも本出願の請求の範囲内に含まれる。

図1は、実施例1で得られた結晶Aの粉末X線回折（XRPD）スペクトルである。図2は、実施例1で得られた結晶Aの熱重量分析（TG）グラフである。図3は、実施例1で得られた結晶Aの示差走査熱量測定（DSC）チャートである。図4は、実施例1で得られた結晶Aの吸湿性（DVS）グラフである。図5は、実施例4で得られた結晶Bの粉末X線回折（XRPD）スペクトルである。図6は、実施例4で得られた結晶Bの熱重量分析（TG）グラフである。図7は、実施例4で得られた結晶Bの示差走査熱量測定（DSC）チャートである。図8は、実施例4で得られた結晶Bの吸湿性（DVS）グラフである。図9は、比較実施例1で得られた結晶Cの粉末X線回折（XRPD）スペクトルである。図10は、比較実施例1で得られた結晶Cの熱重量分析（TG）グラフである。図11は、比較実施例1で得られた結晶Cの示差走査熱量測定（DSC）チャートである。図12は、比較実施例1で得られた結晶Cの吸湿性（DVS）グラフである。図13Aは、結晶A、Bおよび結晶CのXRPDスペクトルの重ね比較である。図13Bは、結晶A、Bおよび結晶CのXRPDスペクトルの重ね拡大比較1である。図13Cは、結晶A、Bおよび結晶CのXRPDスペクトルの重ね拡大比較2である。図14は、結晶A、Bおよび結晶CのTGグラフの重ね比較である。図15は、結晶A、Bおよび結晶CのDSCチャートの重ね比較である。図16は、結晶A、Bおよび結晶CのDVSグラフの重ね比較である。図17Aは、結晶A、Bおよび結晶Cのラマン分光（Raman）スペクトルの重ね比較である。図17Bは、結晶A、Bおよび結晶CのRamanスペクトルの重ね拡大比較1である。図17Cは、結晶A、Bおよび結晶CのRamanスペクトルの重ね拡大比較2である。図18Aは、結晶A、Bおよび結晶Cの赤外分光（IR）スペクトルの重ね比較である。図18Bは、結晶A、Bおよび結晶CのIRスペクトルの重ね拡大比較1である。図18Cは、結晶A、Bおよび結晶CのIRスペクトルの重ね拡大比較2である。図19は、結晶A、B、結晶Cと結晶D（JACS，Journal of the American Chemical Society，1989年8月，111卷，17期，6822-6828で単結晶を示したPQQナトリウム塩の結晶）のXRPDスペクトルの重ね比較である。図20は、結晶A、B、結晶Eと結晶DのXRPDスペクトルの重ね比較である。図21は、結晶Eの吸湿性分析（DVS）グラフである。図22は、結晶A、Bおよび結晶EのDVSグラフの重ね比較である。

本発明者は、長期間にわたって深く研究したところ、PQQ二ナトリウム塩の結晶AおよびBを得、かつ意外に、当該結晶は、高い純度、低い吸湿度、優れた安定性などの良い特性を有し、その保存と使用はいずれも既知のPQQ二ナトリウム塩の固体よりも便利で、特にPQQ二ナトリウム塩を含む組成物または包装物の製造に適することを見出した。これに基づき、発明者らが本発明を完成した。

PQQ二ナトリウム塩の結晶の製造
ここで用いられるように、用語「結晶」は、本分野でよく知られる意味を有し、すなわち、結晶物質で構成され、内部の構造粒子（例えば原子、分子）が並進対称性の規律で配列する固体である。
ここで用いられるように、用語「ピロロキノリンキノン」は、「PQQ」と入れ替えて使用することができ、いずれも構造式が上述構造式Iで表される化合物を指す。本発明の結晶Aおよび結晶Bを得るための原料化合物として、使用されるPQQ二ナトリウム塩は、本分野の通常の方法によって得ることができ、例えば発酵法（例えば、特許文献CN 101228963 B）や有機化学合成法（J. Am. Chem. Soc., 1981, 103,5599〜5600）などによって製造される。原料に使用されるPQQ二ナトリウム塩は、結晶でも非晶質でもよい。また、使用される原料は、不純物を含有してもよい。
結晶の製造の前に、通常の方法によってPQQ二ナトリウム塩の異なる溶媒における溶解度を測定した後、適切な溶媒を選択して本発明の結晶を製造することができる。例えば、以下のような方法によってPQQ二ナトリウム塩の複数の溶媒における溶解度を測定することができる。
（1）約25mgのPQQ二ナトリウム塩を取り、それぞれ25℃および50℃の条件で1 mLの溶媒と撹拌して24 h以上平衡化させた後、それぞれ溶液をろ過し、液体の部分は真空で溶媒を揮発させて乾燥する。重量分析法によって原料薬の溶媒における近似溶解度を測定する。
重量分析法：正確に所定の体積（通常は0.5mL）のろ液を取って乾燥され且つ重量が測られた容器に入れ、M_空と記し、そして溶液とろ液の合計重量を測り、M₀と記し、ろ液の重量がM₀-M_空になる。真空で溶媒を揮発させた後、その合計重量（M₁と記する）を正確に測り、析出した固体の質量がM₁-M_空で、溶媒の質量がM₀-M₁で、これによって原料の当該溶媒における近似溶解度が以下の通りである。
X(g)=[( M₁-M_空)/( M₀-M₁)]×100(g)

PQQ二ナトリウム塩の結晶Aの製造
PQQ二ナトリウム塩の結晶Aは、方法（A）懸濁結晶化法、方法（B）緩慢揮発法または方法（C）貧溶媒沈殿結晶化法によって製造することができる。
方法（A）懸濁結晶化法、方法（B）緩慢揮発法または方法（C）貧溶媒沈殿結晶化法の例示は以下のとおりである。本分野の一般技術者は、常識によってこれらの方法における条件を調整することができる。
方法（A）：25℃と50℃における懸濁結晶化法：PQQ二ナトリウム塩を25℃と50℃の条件で溶媒と撹拌して24h以上平衡させ、ろ過して結晶を得る。方法（B）緩慢揮発法：PQQ二ナトリウム塩を溶媒と撹拌し、均一に混合し、溶解させ、そして25℃と50℃の条件で溶媒を揮発させ、結晶を得る。方法（C）貧溶媒沈殿結晶化法：上述（1）によって近似溶解度を測定し、室温の条件における溶解度が大きく違う2種類の溶媒を1組として組み合わせる。約5〜200mgのPQQ二ナトリウム塩を取って0.5〜5mlの溶解度の高い溶媒に溶解させた後、4〜20mlのPQQ二ナトリウム塩に対する溶解度が非常に低い溶媒（貧溶媒）を入れ、析出して沈殿し、結晶を得る。
25℃で方法（A）を行う操作に使用できる溶媒の例は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、水、メタノール：水(1:1)、エタノール：水(1:1)、アセトン：水(1:1)、アセトニトリル：水(1:1)、テトラヒドロフラン：水(1:1)、メタノール：ヘキサン(1:1)、エタノール：ヘキサン(1:1)、アセトニトリル：ヘキサン(1:1)、テトラヒドロフラン：ヘキサン(1:1)、メタノール：メチル-t-ブチルエーテル(1:1)、エタノール：メチル-t-ブチルエーテル(1:1)、メタノール：トルエン(1:1)、エタノール：トルエン(1:1)、アセトニトリル：トルエン(1:1)、メタノール：メチルイソブチルケトン(1:1)を含むが、これらに限定されない。
50℃で方法（A）を行う操作に使用できる溶媒の例は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、エタン、ヘプタン、メタノール：水(1:1)、エタノール：水(1:1)、アセトニトリル：水(1:1)、テトラヒドロフラン：水(1:1)、メタノール：ヘキサン(1:1)、エタノール：ヘキサン(1:1)、アセトニトリル：ヘキサン(1:1)、トルエン：ヘキサン(1:1)、メタノール：メチル-t-ブチルエーテル(1:1)、エタノール：メチル-t-ブチルエーテル(1:1)、メタノール：トルエン(1:1)、エタノール：トルエン(1:1)、アセトニトリル：トルエン(1:1)、メタノール：メチルイソブチルケトン(1:1)を含むが、これらに限定されない。ここで、原料と溶媒の質量体積比（g/L）は100：1〜1：1である。
方法（A）における前述の25℃と50℃の条件における撹拌・平衡化の時、好ましくは必要によって撹拌し、さらに真空条件で溶媒を揮発させ、撹拌時間は2h〜7dが好ましい。
25℃で方法（B）を行う操作に使用できる溶媒の例は、メタノール：水(1：2、1：6)、エタノール：水(1：2、1：6)、イソプロパノール：水（1：2）、アセトン：水(2：9、1：4)、アセトニトリル：水(2：5、1：4)、テトラヒドロフラン：水(2：5、1：4)を含むが、これらに限定されない。（3）50℃における緩慢揮発法に使用される溶媒の例を挙げると、メタノール：水(1：6)、エタノール：水(1：2)、イソプロパノール：水（1：2）、アセトン：水(2：9)、アセトニトリル：水(2：5、1：4)、テトラヒドロフラン：水(2：5)を含む。ここで、原料と溶媒の質量体積比（g/L）は10：1〜1：100である。
方法（B）における前述の撹拌・平衡化は、好ましくは必要によって撹拌し、さらに25℃と50℃の条件で溶媒を揮発させ、揮発時間は2h〜10dが好ましい。
方法（C）貧溶媒沈殿結晶化法における前述の室温の条件における溶解度が大きく違う2種類の溶媒の組み合わせ（溶媒/貧溶媒）は、水/メタノール、水/エタノール、水/イソプロパノール、水/アセトン、水/アセトニトリル、水/テトラヒドロフランなどを含む。ここで、原料と溶媒の質量体積比（g/L）は10：1〜1：100である。
方法（C）における前述の貧溶媒を入れた後の析出沈殿の時間は、2h〜2dとする。
本発明の方法（A）、（B）または（C）によって、非常に高い純度の結晶Aを得ることができ、高速液相クロマトグラフィーで純度を測定したところ、99.8％を超えることができる。

PQQ二ナトリウム塩の結晶Bの製造
PQQ二ナトリウム塩の結晶Bは、方法（A'）懸濁結晶化法または方法（B'）緩慢揮発法によって製造することができる。例えば、25℃と50℃で方法（A'）または（B'）を行うことによって結晶Bを製造することができる。本分野の一般技術者は、常識によってこれらの方法における条件を調整することができる。
25℃で方法（A'）を行う操作に使用できる溶媒の例は、アセトン、イソプロパノール、イソアミルアルコール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ヘキサン、ヘプタン、メチル-t-ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ニトロメタン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、アセトン：エタン（1：1）、メチルエチルケトン：エタン（1：1）、ニトロメタン：エタン（1：1）、酢酸エチル：エタン（1：1）、メチル-t-ブチルエーテル：エタン（1：1）、トルエン：エタン（1：1）、アセトン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、メチルエチルケトン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、アセトニトリル：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、テトラヒドロフラン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、ニトロメタン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、酢酸エチル：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、アセトン：トルエン（1：1）、メチルエチルケトン：トルエン（1：1）、テトラヒドロフラン：トルエン（1：1）、ニトロメタン：トルエン（1：1）、酢酸エチル：トルエン（1：1）、アセトン：メチルイソブチルケトン（1：1）、メチルエチルケトン：メチルイソブチルケトン（1：1）、アセトニトリル：メチルイソブチルケトン（1：1）、テトラヒドロフラン：メチルイソブチルケトン（1：1）、ニトロメタン：メチルイソブチルケトン（1：1）、酢酸エチル：メチルイソブチルケトン（1：1）、メチル-t-ブチルエーテル：メチルイソブチルケトン（1：1）、トルエン：メチルイソブチルケトン（1：1）を含むが、これらに限定されない。
50℃で方法（A'）を行う操作に使用できる溶媒の例は、アセトン、イソプロパノール、イソアミルアルコール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メチル-t-ブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、ニトロメタン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、アセトン：エタン（1：1）、メチルエチルケトン：エタン（1：1）、テトラヒドロフラン：エタン（1：1）、ニトロメタン：エタン（1：1）、酢酸エチル：エタン（1：1）、メチル-t-ブチルエーテル：エタン（1：1）、アセトン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、メチルエチルケトン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、テトラヒドロフラン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、ニトロメタン：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、酢酸エチル：メチル-t-ブチルエーテル（1：1）、アセトン：トルエン（1：1）、メチルエチルケトン：トルエン（1：1）、テトラヒドロフラン：トルエン（1：1）、ニトロメタン：トルエン（1：1）、酢酸エチル：トルエン（1：1）、アセトン：メチルイソブチルケトン（1：1）、メチルエチルケトン：メチルイソブチルケトン（1：1）、アセトニトリル：メチルイソブチルケトン（1：1）、テトラヒドロフラン：メチルイソブチルケトン（1：1）、ニトロメタン：メチルイソブチルケトン（1：1）、酢酸エチル：メチルイソブチルケトン（1：1）、メチル-t-ブチルエーテル：メチルイソブチルケトン（1：1）、トルエン：メチルイソブチルケトン（1：1）を含むが、これらに限定されない。ここで、原料と溶媒の質量体積比（g/L）は100：1〜1：1である。
方法（A'）で結晶Bを製造し、25℃と50℃の条件における撹拌・平衡化の時、好ましくは必要によって撹拌し、さらに真空条件で溶媒を揮発させ、撹拌時間は2h〜7dが好ましい。
25℃で方法（B'）を行う操作に使用できる溶媒の例は、イソプロパノール：水（1：4）などを含むが、これらに限定されない。50℃で方法（B'）を行う操作に使用できる溶媒の例は、テトラヒドロフラン：水(1：4)を含むが、これらに限定されない。ここで、原料と溶媒の質量体積比（g/L）は10：1〜1：100である。
方法（B'）の操作における撹拌・平衡化の時、好ましくは必要によって撹拌し、さらに25℃と50℃の条件で溶媒を揮発させ、揮発時間は2h〜10dが好ましい。

PQQ二ナトリウム塩の結晶の同定および性質
本発明者は、PQQ二ナトリウム塩の結晶を得た後、さらに様々な手段と装置でその性質を研究した。
「X線粉末回折」は、「X線多晶回折（XRDまたはXRPD）」とも呼ばれ、現在結晶構造（すなわち結晶形）を測定する場合よく使われる試験方法である。粉末X線回折装置を用いて、X線が結晶を透過するとき一連の回折スペクトルが生じ、そのスペクトルにおいて回折線およびその強度はそれぞれある構造の原子団で決められるため、結晶の具体的な結晶型構造が確定できる。
本発明のPQQ二ナトリウム塩の結晶は、特定の結晶の形態を有し、X線回折スペクトルにおいて特定の特徴ピークを有する。
結晶Aは、Cu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、大体9.2°、 9.6°、11.6°、13.5°、14.9°、16.0°、18.2°、18.8°、19.4°、20.4°、21.9°、22.7°、23.2°、23.8°、25.6°、26. 4°、27.3°、28.4°、30.7°、31.7°、32. 4°、33.7°、35.0°、35.8°、36.7°、38.0°、38.6°（いずれも±0.2°）の2θ角度で回折ピークを有するPQQ二ナトリウム塩の結晶である。
結晶Bは、Cu-Kα線回折による粉末X線回折スペクトルは、大体8.1°、9.0°、10.1°、13.7°、16.4°、17.6°、18.2°、23.9°、25.8°、27.2°、31.0°、39.5°（いずれも±0.2°）の2θ角度で回折ピークを有するPQQ二ナトリウム塩の結晶である。
以上の粉末X線回折の回折角2θの測定は、以下の測定条件で行われる。
装置型式：Bruker D8 advance
ターゲット：Cu-Kα（40kV、40mA）
試料と検出器の距離：30 cm
走査範囲：3°〜40°(2θ値)
走査ステップ：0.1 s
もちろん、以上のピーク値は、ほかのモノクロメーター付きの通常の粉末X線回折装置によって測定することもできる。また、上述の本発明で決められた結晶の形状に対する測定誤差が含まれることがあるため、ピーク値が測定誤差の範囲内にあれば、妥当と考えられる。
示差走査熱量測定（DSC）、熱重量分析（TG）、赤外分光（IR）などの通常の方法によって本発明の結晶に対して特徴付けや研究をすることもできる。
研究の結果、本発明の結晶Aおよび結晶Bは、含水物（例えば二水和物）でもよく、融点が分解温度以上で、上述粉末X線回折の回折角2θの測定ピークがあればよい。

既知の結晶と比較すると、本発明の結晶Aおよび結晶Bは、顕著に低下した吸湿性を有し、本発明の結晶が応用および保存において吸湿してバルクなどの不良形態になりにくいことで、優れた安定性と加工性を有する。

本発明の結晶の応用
本分野における既存の常識によると、PQQは、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療といった薬理作用を有し、同時に、食品における微生物の生長を抑制し、食物の保存時間を延ばすことができる。
そのため、本発明のPQQの結晶Aおよび結晶Bは、「薬学的にまたは生理学的にまたは製剤学的に許容される担体」と組み合わせて使用し、様々な組成物の有効成分として、経口投与、吹付け、鼻腔内、または経皮などの経路によって必要な対象に投与することができる。
本発明の組成物において、PQQ二ナトリウム塩の結晶Aおよび/またはBの有効成分は、組成物の合計重量の0.001〜99.9wt％、好ましくは1〜95wt％、より好ましくは5〜90wt％、さらに好ましくは10〜80wt％を占める。残量は、薬学的に允許される担体及び他の添加剤などの物質である。
ここで用いられるように、用語「薬学的にまたは生理学的にまたは製剤学的に許容される担体」とは、保健食品または薬物製剤に使用される担体で、様々な賦形剤や希釈剤を含み、自身が必要な活性成分ではなく、かつ投与後毒性がなくあるいは過剰な毒性がない。適切な担体は、当業者に熟知である。例えば、薬学的に許容される担体の詳細は、「レミントン・ファーマシューティカル・サイエンシーズ(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub. Co.，N.J. 1991)」に記載されている。
組成物において許容される担体は液体、例えば水、塩水、グリセリンやエタノールを含んでも良い。さらに、これらの担体には、充填剤、崩壊剤、滑剤、流動助剤、沸騰剤、潤滑剤或いは乳化剤、矯味剤、pH緩衝物質のような補助性の物質があってもよい。通常、これらの物質は無毒で不活性の薬学的に許容される水系媒体に配合してもよく、ここで、pHは通常約5〜8、好ましくは6〜8である。本発明の組成物は、薬物組成物、機能性食品、飼料、添加剤、微生物生長抑制剤および防腐剤から選ばれてもよい。
さらに、PQQの結晶Aまたは結晶Bは、単独でまたはほかの材料と組み合わせて使用することができ、前述のほかの材料は、ビタミン類、アミノ酸類、カロテノイド類、ω3脂肪酸類、ω6脂肪酸類、アスタキサンチンなどを含むが、これらに限定されない。
本発明の結晶または組成物を具体的な要求によって例えば薬物キット、機能性食品キットなどの包装品を製造することができ、前記包装品は、本発明のPQQ二ナトリウム塩の結晶、任意に、ほかの活性物質、ユーザーや医師に当該薬物キットの使用を指導する説明書、容器、賦形剤などを含み、本分野の技術者は具体的な要求によってその中の任意の成分を決めることができる。
本発明の組成物または包装品は、さらに、生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症の予防/緩和または治療、微生物生長の抑制あるいは食物の保存時間の延長からなる群から選ばれる活性の一つまたは複数を有するほかの活性物質を含んでもよい。このようなほかの活性物質は、ビタミン類、アミノ酸類、カロテノイド類、ω3脂肪酸類、ω6脂肪酸類、アスタキサンチンなどを含むが、これらに限定されない。

本発明の利点
本発明の主な利点は以下の通りである。
1．本発明は、PQQ二ナトリウム塩の2種類の新規な結晶形、即ち結晶Aおよび結晶Bを提供する。
2．本発明の結晶A、Bは、結晶度、安定性、吸湿性および加工性の面で既知のPQQ二ナトリウム塩の結晶または固体よりも顕著な優越性を有するため、工業、医薬や機能性食品などの分野で幅広い応用の未来性がある。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。本分野の技術者は、本発明に対して適切な修正、変更をすることができるが、これらの修正および変更はいずれも本発明の範囲内に含まれる。
以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、本分野における通常の方法を使用することができ、例えば「結晶薬物」（呂揚、杜冠華編集、人民衛生出版社、2009年）またはメーカーのお薦めの条件を参照してもよく、商事会社によって測定されてもよい。以下の実施例において、すべての試薬は市販のものである。
特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。

参考例．PQQ二ナトリウム塩の製造
以下のような操作によってPQQ二ナトリウム塩を得た。
Coreyらが1981年に報告した化学合成文献（J. Am. Chem. Soc., 1981, 103,5599〜5600）に基づき、合成プロセスの経路および条件を最適化して改善し、9つの工程で反応させてPQQ二ナトリウム塩を得た。
Coreyの文献と比較すると、本発明で使用される方法の最適化して改善したところは、主に、1）接触水素化反応の文献で使用される触媒の貴金属の白金をパラジウムに変えること、2）文献でのジアゾカップリング反応におけるカップリング試薬の2-メチルアセト酢酸メチルを2-メチルアセト酢酸エチルに変えること、3）文献においてエステル加水分解反応でまずオルトギ酸エステルと反応させてモノケタールを得た後、塩基性の条件で加水分解して最終産物を得るのを、直接塩基性の条件で加水分解した後、pHを調整して産物を得るのに改善したことである。
具体的な合成過程は、以下の通りである。
（1）ホルミル化反応：原料の2-メトキシ-5-ニトロアニリンは、ギ酸および無水酢酸の作用下でアミノ基がホルミル化して保護され、N-(2-メトキシ-5-ニトロフェニル)ホルムアミドを得た。
（2）接触水素化反応：アミノ基がホルミル化して保護された化合物は、エタノールを溶媒とし、パラジウム/炭素を触媒とする条件で、芳香族環のニトロ基がアミノ基に還元され、N-(5-アミノ-2-メトキシフェニル)ホルムアミドを得た。
（3）ジアゾカップリング反応：亜硝酸ナトリウムの作用下でアミノ基をジアゾ化した後、フルオロホウ酸ジアゾニウム塩を形成し、フルオロホウ酸ジアゾニウム塩を直接2-メチルアセト酢酸エチルとカップリングして2-{[(3-ホルムアミド-4-メトキシ)アリール]ヒドラゾノ}プロパン酸エチルを得た。
（4）ピロール環形成反応：前の工程の産物はギ酸の作用下でピロール環を形成し、6-ホルミルアミノ-5-メトキシ-1H-インドール-2-カルボン酸エチルを得た。
（5）ホルムアミド加水分解反応：工程1で保護されたホルムアミド基は酸性の条件でアミド結合が断裂し、遊離のアミノ基になり、6-アミノ-5-メトキシ-1H-インドール-2-カルボン酸エチルを得た。
（6）環形成反応：前の工程で遊離のアミノ基になった産物が2-オキソグルタコン酸ジメチルと反応して環を形成し、9-ヒドロキシ-5-メトキシ-6,7,8,9-テトラヒドロ-1H-ピロロ[2,3-f]キノリン-2,7,9-トリカルボン酸-2-エチル-7,9-ジメチルを得た。
（7）キノリン環の形成：前の工程の産物は酢酸銅および酸性条件でキノリン環を形成し、5-メトキシ-1H-ピロロ[2,3-f]キノリン-2,7,9-トリカルボン酸-2-エチル-7,9-ジメチルを得た。
（8）酸化反応：前の工程の産物は酸化剤の作用下でキノン環を形成し、4,5-ジオキシ-4,5-ジヒドロ-1H-ピロロ[2,3-f]キノリン-2,7,9-トリカルボン酸-2-エチル-7,9-ジメチルを得た。
（9）エステル加水分解反応：PQQエステルは塩基性条件で3つのエステル基が加水分解し、加水分解終了後6mol/Lの塩酸で溶液のpHを3.0に調整し、3時間保持後固体、即ちPQQ二ナトリウム塩を分離した。
得られたPQQ二ナトリウム塩の原料は、結晶Cである。
得られたPQQ二ナトリウム塩を高速液相クロマトグラフィーによって以下のような条件で測定したところ、純度が99.0％超であった。
装置型式：UlTiMate3000、米国ダイオネクス
カラム：YMC-C18 250×4.6mm I.D.
移動相：アセトニトリル：100mMリン酸二水素カリウム=12：88、リン酸でpH2.0に調整した
検出波長：249nm
カラム温度：35℃
流速：1.0 ml/min
仕込み量：10μl

実施例1．懸濁結晶化法によるPQQ二ナトリウム塩の結晶Aの製造および得られた結晶の性質の研究
以上の参考例のように製造された10mgのPQQ二ナトリウム塩（純度≧98、市販品としてsigma社からPQQ二ナトリウム塩、製品番号：80198-10MG-Fを購入してもよい。）を取り、25℃と50℃の条件で1mLのアセトニトリルと撹拌して5d平衡化した後、それぞれ溶液をろ過し、固体の部分を空気中で10min乾燥し、PQQ二ナトリウム塩の結晶Aを得た。
得られたPQQ二ナトリウム塩の結晶Aに対し、粉末X線回折分析（XRPD、図1）、熱重量分析（TG、図2）、示差走査熱量測定（DSC、図3）および吸湿性分析（DVS、図4）を行った。
1．粉末X線回折スペクトル
以下に示す条件で得られた結晶の粉末X線回折スペクトルを測定した。結果を図1に示す。粉末X線回折によってCu-Kα放射線で得られた2θのピークは、大体9.2°、9.6°、11.6°、13.5°、14.9°、16.0°、18.2°、18.8°、19.4°、20.4°、21.9°、22.7°、23.2°、23.8°、25.6°、26.4°、27.3°、28.4°、30.7°、31.7°、32.4°、33.7°、35.0°、35.8°、36.7°、38.0°、38.6°(いずれも±0.2°)にある。
装置型式：Bruker D8 advance
ターゲット：Cu-Kα（40kV、40mA）
試料と検出器の距離：30 cm
走査範囲：3°〜40°(2θ値)
走査ステップ：0.1 s
得られた固体は結晶性のものである。
2．熱重量分析
TG（図2）では、結晶Aは、30〜200℃で1.33％、6.02％の2箇所の重量ロス（一つの水分子の理論重量ロス値が4.6％）があり、水和物の可能性があり、分解ピーク値の温度が312.5℃であったことが示された。
装置型式：Netzsch TG 209F3
温度範囲：30〜400℃
走査速度：10K/min
パージガス：25 mL/min
保護ガス：15 mL/min
3．示差走査熱量測定
相応のDSC（図3）はこの温度区間（30〜200℃）で吸熱ピークが現れ、この結晶が水を含有することが示された。また、昇温範囲で溶融現象が見られなかったのは、その融点が薬物の分解温度以上である可能性があることを示した。
装置型式：Perkin Elmer DSC 8500
温度範囲：50〜280℃
走査速度：10℃/min
窒素ガス流速：50ml/min
4．吸湿性分析
DVS（図4）では、結晶Aは、40％RHで水分を1.6％、65％RHで水分を2.3％、80％RHで水分を2.8％吸収したことが示された。通常の保存環境において、40〜80％RHで、吸湿性の変化が2％未満で、わずかな吸湿性がある。
装置型式：SMS DVS Intrinsic、0〜95％RH
温度：25℃

実施例2．緩慢揮発法によるPQQ二ナトリウム塩の結晶Aの製造および得られた結晶の性質の研究
3mgのPQQ二ナトリウム塩を2組用意し（参考例で製造されたもの）、それぞれ160μL無水エタノール+560μL水を含む溶媒および160μL無水エタノール+320μL水を含む溶媒と均一に混合し、溶解させ、それぞれ25℃と50℃でゆっくり乾燥するまで揮発させ、溶媒を揮発させた後、減圧で乾燥し、PQQ二ナトリウム塩の結晶Aを得た。
実施例1に記載の条件で得られた結晶の粉末X線回折スペクトルを測定し、かつ熱重量分析、示差走査熱量測定および吸湿性分析を行ったが、得られた結果が実施例1と同様であった。

実施例3．貧溶媒沈殿結晶化法によるPQQ二ナトリウム塩の結晶Aの製造および得られた結晶の性質の研究
10mgのPQQ二ナトリウム塩を取り（参考例で製造されたもの）、2mLの水に溶解させ、かつ撹拌して平衡化させた。その後、6mLの無水エタノールを含有する褐色ガラス瓶に入れ、12h後沈殿が析出した。ろ過して得られた固体を加圧乾燥し、PQQ二ナトリウム塩の結晶Aを得た。
実施例1に記載の条件で得られた結晶の粉末X線回折スペクトルを測定し、かつ熱重量分析、示差走査熱量測定および吸湿性分析を行ったが、得られた結果が実施例1と同様であった。

実施例4．懸濁結晶化法によるPQQ二ナトリウム塩の結晶Bの製造および得られた結晶の性質の研究
10mgのPQQ二ナトリウム塩（参考例で製造されたもの）を取り、25℃と50℃の条件で1mLの酢酸エチルと撹拌して5d平衡化した後、それぞれ溶液をろ過し、固体の部分を減圧で乾燥し、PQQ二ナトリウム塩の結晶Bを得た。
実施例1で示された条件を使用し、得られたPQQ二ナトリウム塩の結晶Bに対し、粉末X線回折分析（XRPD、図5）、熱重量分析（TG、図6）、示差走査熱量測定（DSC、図7）および吸湿性分析（DVS、図8）を行った。
1．粉末X線回折分析
得られた結晶Bの粉末X線回折スペクトルを測定した。結果を図5に示す。粉末X線回折によってCu-Kα放射線で得られた2θのピークは、8.1°、9.0°、10.1°、13.7°、16.4°、17.6°、18.2°、23.9°、25.8°、27.2°、31.0°、39.5°(いずれも±0.2°)に現れた。
2．熱重量分析
TG（図6）では、結晶Ｂは、30〜200℃で5.98％、6.21％の2箇所の重量ロス区間（一つの水分子の理論重量ロス値が4.6％で、一つの酢酸エチルの理論重量ロス値が19.1％）があり、水和物の可能性があることが示された。分解ピーク値の温度が303.3℃であった。
3．示差走査熱量測定
相応のDSC（図7）はこの温度区間で吸熱ピークが現れ、この結晶が水を含有することが示された。また、昇温範囲で溶融現象が見られなかったのは、結晶Bの融点が薬物の分解温度以上である可能性があることを示した。
4．吸湿性分析
DVS（図8）では、結晶Bは、40％RHで水分を7.3％、65％RHで水分を11.0％、80％RHで水分を12.0％吸収したことが示された。相対湿度20〜40％の範囲で、一水和物を、相対湿度50％超の範囲で、二水和物を形成し、湿度がさらに増加すると、多水和物を形成する。

実施例5．緩慢揮発法によるPQQ二ナトリウム塩の結晶Bの製造および得られた結晶の性質の研究
3mgのPQQ二ナトリウム塩を2組用意し、一方は160μLイソプロパノール+960μL水を含む溶媒と均一に混合し、溶解させ、25℃で乾燥するまで揮発させ、もう一方は160μLテトラヒドロフラン+640μL水を含む溶媒と均一に混合し、溶解させ、50℃で揮発させた。溶媒を揮発させた後、減圧で乾燥し、PQQ二ナトリウム塩の結晶Bを得た。
実施例1に記載の条件で得られた結晶の粉末X線回折スペクトルを測定し、かつ熱重量分析、示差走査熱量測定および吸湿性分析を行ったが、得られた結果が実施例4と同様であった。

比較実施例1．PQQ二ナトリウム塩の結晶Cの製造および得られた結晶の性質の研究
PQQ二ナトリウム塩の結晶Cを得る方法の詳細は＜参考例＞を参照する。
実施例1で示された条件を使用し、得られたPQQ二ナトリウム塩の結晶Cに対し、粉末X線回折分析（XRPD、図9）、熱重量分析（TG、図10）、示差走査熱量測定（DSC、図11）および吸湿性分析（DVS、図12）を行った。
1．粉末X線回折スペクトル
結晶Cの粉末X線回折スペクトルは、結果を図9に示し、粉末X線回折によってCu-Kα放射線で得られた2θのピークは、8.2°、8.6°、9.0°、10.1°、13.7°、17.6°、18.2°、23. 9°、26.9°、27. 3°、28.3°、31.0°、31.6°、32.6°、39.4°、45.3°(いずれも±0.2°)に現れた。
2．熱重量分析
TG（図10）では、実験の開始段階ですでに顕著な重量ロスがあり、表面の水分が多く、また、結晶Cは、30〜180℃で4.37％、7.06％の2箇所の重量ロス区間（一つの水分子の理論重量ロス値が4.6％）があり、水和物の可能性があることが示された。
3．示差走査熱量測定
相応のDSC（図11）はこの温度区間で吸熱ピークが現れ、この結晶が水を含有することが示された。
4．吸湿性分析
DVS（図12）では、結晶Cは高い吸湿性を有し、通常の保存の湿度範囲内で、湿度の変化は5〜15％と幅が広いことが示された。40％RHで水分を7.8％、65％RHで水分を13.8％、80％RHで水分を15.7％吸収した。相対湿度20〜40％の範囲で、一水和物を、相対湿度50％超の範囲で、二水和物を形成し、湿度がさらに増加すると、多水和物を形成することが初歩的に推測された。

比較実施例2．単結晶データの粉末X線回折の結果への変換
非特許文献1(JACS，111卷，6822-6828)で報告された単結晶のX線構造分析のデータを使用し、当該結晶（結晶D）による粉末X線回折のピークをシミュレーションした。origin作図ソフトを使用し、結果を図19に示す。結果から、そのピーク値が本発明の結晶の位置と異なることがわかった（詳細は表2を参照する）。

比較実施例3．特許文献1に記載の結晶
特許文献1に記載の結晶1（本発明に記載の結晶E）の粉末X線回折を本発明の結晶A、Bと比較した。結果から、そのピーク値が本発明の結晶の位置と異なることがわかった（詳細は表2を参照する）。

比較例1．PQQ二ナトリウム塩の結晶AおよびBと結晶C、DおよびEの比較
XRPD、TG、DSC、DVS、ラーマン分光(Raman)および赤外分光(IR)の方法によって実施例で得られた3種類の結晶（即ち結晶A、BおよびC）を比較したが、ここのXRPD、TG、DSC、DVSの測定方法は実施例1に記載のものと同様である。
Ramanスペクトル
装置型式：Thermo DXR Raman Microscope
露出時間（秒）：2.0
レーザ：780nm
レーザ出力：50mW
レーザ：25μmスリット
IR
装置型式：Nicolet FTIR 6700
解析：4.000
サンプリング：2.0
光学速度：0.6329
開き口：100.00
検出器：DTGS KBr
ビームスプリッター：KBｒ

表2、表3および重ね図（図13〜18）では、実施例1で得られた結晶A、実施例4で得られた結晶B、比較実施例1で得られた結晶C、比較実施例2で得られた結晶D、比較実施例3で得られた結晶E（特許文献1、出願号CN201080031945）の比較結果をまとめた。

3．各結晶形の固体の特徴付けの重ね図分析
XRPDの重ね図（図13A〜C）では、結晶Aは、9.2°、9.6°、14.9°、16.0°などで結晶Bおよび結晶Cと顕著な違いがあり、結晶Bは、9.0°、10.1°、16.4°、23.9°、27.2°で結晶Cのピーク強度と顕著な違いがあることが示された。
TGの重ね図（図14）では、結晶A、B、Cはいずれも溶媒の重量ロスがあることが示された。
DSCの重ね図（図15）では、結晶A、B、Cはいずれも吸熱ピークが現れ、結晶A、B、Cの融点が薬物分解温度以上であることが示された。
DVSの重ね図（図16）では、3種類の結晶形の吸湿性が異なり、中では、結晶Aの吸湿性が最も低く、80％RHで水分を2.8％吸収し、結晶Bの吸湿性が中等で、80％RHで水分を12.0％吸収し、結晶Cの吸湿性が最も高く、80％RHで水分を15.7％吸収したことが示された。
ラーマン（Raman）分光スペクトルの重ね図（図17A〜C）の結果では、結晶Aは1579.70 cm^-1、1539.20 cm^-1、1327.07 cm^-1などで結晶B、結晶Cと異なることが示された。
赤外分光（IR）スペクトルの重ね図（図18A〜C）では、結晶Aは3072.05 cm^-1、1577.49 cm^-1、1295.93 cm^-1などで結晶B、結晶Cと異なることが示された。

比較例2．本発明のPQQ二ナトリウム塩の結晶と既存の技術文献で公開された結晶のXRPDの比較
特許文献1の実施例1に記載の方法によって結晶Eを製造し、かつ本発明の結晶A、Bおよび非特許文献1(JACS，111卷，6822-6828)で報告された単結晶とXRPDの比較を行った。この4種類の結晶の比較は図20に示す。
この図から、結晶Aは9.6°、11.6°、14.9°、16.0°、18.8°、19.4°、19.9°、20.4°などで結晶Eと顕著な違いがあることがわかる。そして、結晶Aおよび結晶BのスペクトルはJACSに記載の単結晶とも顕著な違いがある。

比較例3．本発明のPQQ二ナトリウム塩の結晶と結晶EのDVSおよび性質の比較
前述のように、特許文献1の実施例1に記載の方法によって結晶Eを製造した。前記実施例に使用されるDVS測定方法および条件を使用して結晶Eの吸湿性分析図（図21に示すように）を得、かつその吸湿性能を本発明の結晶Aおよび結晶Bと比較した（結果を図22に示す）。
図21から、結晶Eは、ある程度の吸湿性を有することがわかる。40％RHで水分を11.8％、65％RHで水分を13.0％、80％RHで水分を13.6％吸収した。通常の保存環境において、40〜80％RHで、吸湿性の変化が2％未満で、わずかな吸湿性がある。
図22におけるDVSグラフの重ね比較から、3種類の結晶形の吸湿性が異なることがわかる。中では、結晶Aの吸湿性が最も低く、湿度80％で水分を約3.3％吸収し、結晶Bの吸湿性が比較的に高く、湿度80％で水分を約12.0％吸収し、結晶Eの吸湿性が最も高く、湿度80％で水分を約13.6％吸収した。本発明の結晶の吸湿性は、既存技術の結晶Eよりもはるかに優れ、かつ結晶Aの性能が特に良い。

以上の実施例における結果をまとめると、以下のことがわかる。
本発明の結晶A、BのCu-Kα線回折を使用した粉末X線回折による2θ値はまったく新しいため、本発明の結晶形は新規なものであることが示唆される。
そして、本発明の結晶A、Bは、結晶度、安定性、吸湿性および加工性の面で顕著な優越性を有するため、工業、医薬や機能性食品などの分野で幅広い応用の未来性がある。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をする、あるいはここに記載される特徴を組み合わせることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims

Ｃｕ−Ｋα線回折による粉末Ｘ線回折スペクトルは、９．６±０．２°、１１．６±０．２°、１４．９±０．２°、１６．０±０．２°、１８．８±０．２°、１９．４±０．２°、２０．４±０．２°、２１．９±０．２°、２２．７±０．２°、２３．２±０．２°、２５．６±０．２°、３３．７±０．２°、３５．０±０．２°、３５．８±０．２°、３６．７±０．２°、３８．０±０．２°、３８．６±０．２°の２θ角度で回折ピークを有することを特徴とするピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Ａ。
前記結晶ＡのＣｕ−Ｋα線回折による粉末Ｘ線回折スペクトルは、９．２±０．２°、９．６±０．２°、１１．６±０．２°、１３．５±０．２°、１４．９±０．２°、１６．０±０．２°、１８．２±０．２°、１８．８±０．２°、１９．４±０．２°、２０．４±０．２°、２１．９±０．２°、２２．７±０．２°、２３．２±０．２°、２３．８±０．２°、２５．６±０．２°、２６．４±０．２°、２７．３±０．２°、２８．４±０．２°、３０．７±０．２°、３１．７±０．２°、３２．４±０．２°、３３．７±０．２°、３５．０±０．２°、３５．８±０．２°、３６．７±０．２°、３８．０±０．２°、３８．６±０．２°の２θ角度で回折ピークを有することを特徴とする請求項１に記載の二ナトリウム塩の結晶Ａ。
請求項１又は２のいずれかに記載の二ナトリウム塩の結晶Ａを製造する方法であって、
（Ａ）懸濁結晶化法：２０℃〜６０℃の温度範囲内で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と平衡になるまで撹拌して懸濁液を得、ろ過して前記二ナトリウム塩の結晶Ａを得る方法、
（Ｂ）緩慢揮発法：ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を溶媒と撹拌し、溶解するまで均一に混合し、そして２０℃〜６０℃の条件で溶媒を揮発させ、前記二ナトリウム塩の結晶Ａを得る方法、
（Ｃ）貧溶媒沈殿結晶化法：２０〜６０℃の温度範囲内で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩を高溶解度の溶媒に溶解させ、得られた系に低溶解度の貧溶媒を入れて前記二ナトリウム塩の結晶Ａを析出させ、
ここで、２５℃で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の前記高溶解度の溶媒における溶解度が≧０．３５ｇ／１００ｇ溶媒で、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の前記低溶解度の溶媒における溶解度が≧０．１５ｇ／１００ｇ溶媒である方法、
からなる群から選ばれることを特徴とする製造方法であって、
前記方法（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）で使用される溶媒は、それぞれ以下の群から選ばれ、
方法（Ａ）：アセトニトリル、メタノール、エタノール、水、ヘプタン、メタノール：水、エタノール：水、アセトン：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水、メタノール：メチル−ｔ−ブチルエーテル、エタノール：メチル−ｔ−ブチルエーテル、メタノール：メチルイソブチルケトンで、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が５：１〜１：５であり、
方法（Ｂ）：メタノール：水、エタノール：水、イソプロパノール：水、アセトン：水、アセトニトリル：水、テトラヒドロフラン：水で、ここで、各混合溶媒における各溶媒の体積比が１０：１〜１：１０であり、
方法（Ｃ）では、高溶解度の溶媒が水で、低溶解度の貧溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール及びアセトンから選ばれ、
その比率が体積比であることを特徴とする方法。
前記方法（Ａ）の各混合溶媒における各溶媒の体積比が２：１〜１：２であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記方法（Ａ）の各混合溶媒における各溶媒の体積比が１：１であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記方法（Ｂ）の各混合溶媒における各溶媒の体積比が５：１〜１：５であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
（Ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載のピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Ａと、
（ＩＩ）薬学的に、生理学的にまたは製剤学的に許容される担体および／または補助剤と、
を含む組成物または包装品。
前記組成物または包装品は、薬物組成物、機能性食品、飼料、添加剤、微生物生長抑制剤および防腐剤からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の組成物または包装品。
生長促進、抗炎症、亜鉛の増加および鉛の減少、肝臓疾患の予防・治療、白内障形成の減少、抗癌、神経再生の促進、心筋梗塞やアテローム性動脈硬化の予防・治療、酔い醒め、認知症、微生物感染からなる群から選ばれる疾患または症状の予防、緩和または治療に使用される薬物組成物または機能性食品の製造のための、請求項１又は２のいずれかに記載のピロロキノリンキノン二ナトリウム塩の結晶Ａの使用。