JP7449469B2 - 結晶及びその製造方法、組成物、ソフトカプセル - Google Patents

Description

本発明は、結晶及びその製造方法、組成物、ソフトカプセルに関する。

ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）は、新しいビタミンの可能性があることが提案されており、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患要望治療作用、損傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害－制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。これまでにピロロキノリンキノンジナトリウムが食品として登録されており（非特許文献１）、このＰＱＱ塩の結晶構造についても報告されている（非特許文献２）。

また、ピロロキノリンキノンを含む具体的な製品として、特許文献１には、ピロロキノリンキノンと食用油脂を含むソフトカプセル充填用の調整液組成物が開示されている。このようなソフトカプセルは、グリセリンとゼラチンで作られたカプセル被膜内に食用油と対象物を混合した内容物で形成される。ソフトカプセルは、サプリや医薬品等の摂取方法として広く使用されている。

特開2012-036094号公報

EFSA J, doi: 10.2903/j.efsa.2017.5058 Chemistry Central Journal volume 6, Article number: 57 (2012)

ところで、ＰＱＱは、発酵法で得られる粗生成物を精製して晶析により結晶化し、乾燥して得ることができる。このＰＱＱは水分量により色が変わることが知られており、乾燥によってＰＱＱは変色することが懸念される。このような変色は、ＰＱＱを含む食用品又は医薬品等の外観を損ねる可能性があるため、乾燥しても変色しないＰＱＱ組成物やＰＱＱ結晶が求められている。

具体的には、ＰＱＱをソフトカプセルの内容物としたときに、水分の減少によりＰＱＱが変色することが懸念される。このような変色は、ＰＱＱとともに配合される成分やソフトカプセルを形成するカプセル材料によって、進行するものと考えられる。また、ソフトカプセルの内容物は、油とＰＱＱを加熱混合して調製することがあり、このような加熱によっても変色がさらに進行することが懸念される。

本発明者らが鋭意検討したところ、実際に、ＰＱＱを含むソフトカプセルが変色していくことが分かった。このような色の変化は、ソフトカプセル内におけるＰＱＱの安定性の低下を意味するものとも捉えることができる。そのため、このような加熱や乾燥環境下においても変色し難いＰＱＱ結晶やＰＱＱ組成物が求められている。

本発明は、上記問題点を鑑みてなされたものであり、熱安定性が向上し、加熱による変色が抑制されたピロロキノリンキノンジナトリウムの結晶及びその製造方法、並びに、当該結晶を含む組成物及びソフトカプセルを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンと混合することにより、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
ピロロキノリンキノンジナトリウムと、グリセリンと、を含む、
結晶。
〔２〕
前記ピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量が、前記結晶の総量に対して、５～８５質量％であり、
前記グリセリンの含有量が、前記結晶の総量に対して、１５～９５質量％である、
〔１〕に記載の結晶。
〔３〕
Ｃｕ－Ｋαを用いた粉末Ｘ線回折において、８．６±０．４°，９．６±０．４°，１３．４±０．４°，１７．１±０．４°，２３．７±０．４°，２７．０±０．４°，及び２７．９±０．４°に２θピークを示す、
〔１〕又は〔２〕に記載の結晶。
〔４〕
前記結晶の結晶格子に含まれる、前記ピロロキノリンキノンジナトリウム分子と前記グリセリン分子が１：１の割合である、
〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の結晶。
〔５〕
〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の結晶と、
糖及び／又は有機酸と、を含む、
組成物。
〔６〕
油脂をさらに含む、
〔５〕に記載の組成物。
〔７〕
〔５〕又は〔６〕に記載の組成物を内容物として含む、
ソフトカプセル。
〔８〕
〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の結晶の製造方法であって、
グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの混合物を、２０～２１０℃で加熱して結晶を得る工程を有する、
結晶の製造方法。

本発明によれば、熱安定性が向上し、加熱による変色が抑制されたピロロキノリンキノンジナトリウムの結晶を提供することができる。

比較例Ａ１におけるピロロキノリンキノンジナトリウムの光学顕微鏡写真（対物２０倍） 実施例Ａ１で得られた紫色混合物の光学顕微鏡写真（対物２０倍）結晶の粉末Ｘ線回折の結果を示す図である。 比較例Ａ１におけるピロロキノリンキノンジナトリウムの粉末Ｘ線回折の結果を示す図である。 実施例Ａ１で得られた紫色混合物の粉末Ｘ線回折の結果を示す図である。 図３と図４の粉末Ｘ線回折の結果を重ね合わせた図である。 実施例Ｂ１におけるピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶の光学顕微鏡写真（対物２０倍） 実施例Ｂ１におけるピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶の粉末Ｘ線回折の結果を示す図である。 ピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶の構造を示す図である。 実施例３で得られた暗赤色結晶の粉末Ｘ線回折の結果を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

〔結晶〕
本実施形態の結晶（以下、「ＰＱＱグリセリン結晶」ともいう。）は、ピロロキノリンキノンジナトリウムと、グリセリンと、を含む。ピロロキノリンキノンジナトリウムは、下記式（１）で表されるピロロキノリンキノンの３つのカルボキシル基のうちの二つがナトリウム塩となった構造を有する。ナトリウム塩を形成するカルボキシル基の位置は結晶化条件によって変わることがある。

本実施形態のＰＱＱグリセリン結晶は、その結晶格子に含まれるピロロキノリンキノンジナトリウム分子とグリセリン分子とが１：１の割合であることが好ましいが、ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンとが結晶格子を構成するものであれば、その分子比は上記に限定されるものではない。なお、結晶格子に含まれるピロロキノリンキノンジナトリウム分子とグリセリン分子の数は、単結晶構造解析により同定することができる。本実施形態において、「ＰＱＱグリセリン結晶」には、ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンとが結晶格子を構成する所謂結晶の他、当該結晶と、その結晶格子外に存在するピロロキノリンキノンジナトリウム又はグリセリンと、の混合物も含まれる。

ピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量は、ＰＱＱグリセリン結晶の総量に対して、好ましくは５～８５質量％であり、ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数が１である理想的なＰＱＱグリセリン結晶におけるピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量は、好ましくは７５～８５質量％である。結晶格子にあるグリセリンではなく格子外のグリセリンを含む組成において、ピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量は、好ましくは２０～８５質量％であり、より好ましくは３５～８５質量％であり、さらに好ましくは５０～８５質量％であり、特に好ましくは６５～８５質量％である。ピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量が上記範囲内であることにより、結晶の安定性がより向上し、耐変色性がより向上する傾向にある。

グリセリンの含有量は、ＰＱＱグリセリン結晶の総量に対して、好ましくは１５～９５質量％であり、ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数が１である理想的なＰＱＱグリセリン結晶におけるグリセリンの含有量は、好ましくは１５～２５質量％である。結晶格子にあるグリセリンではなく格子外のグリセリンを含む組成において、グリセリンの含有量は、好ましくは１５～８０質量％であり、より好ましくは１５～６５質量％であり、さらに好ましくは１５～５０質量％であり、特に好ましくは１５～３５質量％である。グリセリンの含有量が上記範囲内であることにより、結晶の安定性がより向上し、耐変色性がより向上する傾向にある。

ＰＱＱグリセリン結晶中において、結晶格子内及び結晶格子外におけるピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数の比は、好ましくは０．５～２であり、より好ましくは０．８～１．２である。ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数が１である理想的なＰＱＱグリセリン結晶における分子数の比は１である。結晶格子にあるグリセリンではなく格子外のグリセリンを含む組成において、分子数の比は、好ましくは１．８～１２．５であり、より好ましくは３．０～１０であり、さらに好ましくは３．５～８．０であり、特に好ましくは３．５～６．０である。ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数の比が上記範囲内であることにより、結晶の安定性がより向上する傾向にある。

また、ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンとにより構成される結晶格子には、水分子が含まれないことが好ましい。他方で、結晶格子外に水分子は含まれていてもよい。この場合、水の含有量は、ＰＱＱグリセリン結晶に対して、好ましくは５．０質量％以下であり、より好ましくは３．０質量％以下であり、さらに好ましくは１．０質量％以下である。水の含有量の下限は、特に制限されないが、検出限界以下である。

ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンがＰＱＱグリセリン結晶を形成しているかどうかは顕微鏡、粉末Ｘ線回折、単結晶Ｘ線解析、電子顕微鏡等で確認することが可能である。

例えば、本実施形態のＰＱＱグリセリン結晶は、Ｃｕ－Ｋαを用いた粉末Ｘ線回折において、８．６±０．４°，９．６±０．４°，１３．４±０．４°，１７．１±０．４°，２３．７±０．４°，２７．０±０．４°，及び２７．９±０．４°に２θピークを示すことが好ましい。

このような粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定は、例えば、下記の測定条件で行うことができる。その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。
（測定条件）
装置 ：株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００
Ｘ線 ：Ｃｕ－Ｋα／管電圧１００ｋＶ／管電流４０ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅 ：０．０２０°

また、ＰＱＱグリセリン結晶は、単結晶Ｘ線構造分析において、例えば以下のディメンジョンを有することが好ましい。
格子パラメータ
ａ＝８．７１１００Å
ｂ＝９．６０９００Å
ｃ＝１０．９３２００Å
Ｖ＝８５１．９９９９８ų

本実施形態に係るＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶の各ピークの相対強度は、下記の評価基準に従って、表１で表すことができる。なお、表１では、最大強度を有するピークに対するパーセンテージとして相対強度を標記する。

ｖｓ：最大の強度（cps・deg)を有するピークに対するピーク強度５０－１００％
ｗ ：最大の強度（cps・deg)を有するピークに対するピーク強度２５－５０％
ｖｗ：最大の強度（cps・deg)を有するピークに対するピーク強度０－２５％

本実施形態のＰＱＱグリセリン結晶は、赤系の色を有する傾向にある。ＰＱＱグリセリン結晶の色は、決勝に含まれるピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンの割合にもよるため、制限されないが、例えば、赤、赤紫、赤茶、暗茶、濃茶などと表現される色をとる。このなかでは、担体のピロロキノリンキノンジナトリウムはより赤い色を呈する傾向にあり、ＰＱＱグリセリン結晶もその色に近い色とすることがより好ましい。

〔結晶の製造方法〕
本実施形態のＰＱＱグリセリン結晶の製造方法は、グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの混合物を、２０～１８０℃で加熱してＰＱＱグリセリン結晶を得る工程を有する。

原料として用いるピロロキノリンキノンジナトリウムは、アモルファス、結晶のどちらの状態でもよい。また、原料として用いるピロロキノリンキノンジナトリウムは、ピロロキノリンキノンジナトリウム三水和物やピロロキノリンキノンジナトリウム五水和物などの結晶溶媒を含むものであってもより。このなかでも、ピロロキノリンキノンジナトリウム三水和物結晶が好ましい。原料として用いるピロロキノリンキノンジナトリウムは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。

原料として用いるピロロキノリンキノンジナトリウムは、Ｃｕ－Ｋαを用いた粉末Ｘ線回折において、９．１±０．４°、１０．３±０．４°、１３．８±０．４°、１７．７±０．４°、１８．３±０．４°、２４．０±０．４°、２７．４±０．４°、３１．２±０．４°、３９．５±０．４°に２θピークを示すことが好ましい。

原料として用いるグリセリンとしては、特に制限されないが、例えば、食品に使用できる精製されたグリセリンが好ましい。また、原料として用いるグリセリンは、水を含むグリセリン水溶液の状態であってもよい。このようなグリセリン水溶液に含まれる水の含有量は、好ましくは２０～７０質量％である。グリセリン水溶液に含まれる水の含有量がこの範囲にあれば、得られる結晶は無水物として得ることができる。親水性のピロロキノリンキノンジナトリウムにおいて、得られる結晶に水分が含まれないのは予想外である。

さらに、混合物は、グリセリン以外の分散媒を含んでいてもよい。分散媒としては、特に制限されないが、例えば、水、エタノール、食用油脂などが挙げられる。特に、水やエタノールなど容易に揮発する分散媒は、混合物から除去しやすいため好ましい。

混合物におけるピロロキノリンキノンジナトリウムの添加量は、グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの総量に対して、好ましくは５～８５質量％であり、より好ましくは１０～８０質量％であり、さらに好ましくは１５～７５質量％であり、よりさらに好ましくは２０～７０質量％であり、さらにより好ましくは２５～６５質量％であり、特に好ましくは３０～６０質量％である。ピロロキノリンキノンジナトリウムの添加量が上記範囲内であることにより、結晶の収率がより向上する傾向にある。

混合物におけるグリセリンの含有量が、グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの総量に対して、好ましくは１５～９５質量％であり、より好ましくは２０～９０質量％であり、さらに好ましくは２５～８５質量％であり、よりさらに好ましくは３０～８０質量％であり、さらにより好ましくは３５～７５質量％であり、特に好ましくは４０～７０質量％である。グリセリンの添加量が上記範囲内であることにより、結晶の収率がより向上する傾向にある。

また、混合物において、ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数の比は、好ましくは１．０～１６であり、より好ましくは１．５～１４であり、さらに好ましくは１．８～１２．５であり、よりさらに好ましくは３．０～１０であり、さらにより好ましくは３．５～８．０であり、特に好ましくは３．５～６．０である。ピロロキノリンキノンジナトリウム１分子に対するグリセリンの分子数の比が上記範囲内であることにより、結晶の収率がより向上する傾向にある。

上記工程において、グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの混合物を加熱することにより、ＰＱＱグリセリン結晶を得ることができる。より具体的には、この工程においてグリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムによりアモルファス化した複合体が形成し、これが結晶化するものと考えられる。但し、結晶化プロセスは上記に限定されるものではない。なお、ＰＱＱグリセリン結晶が得られているか否かの判断は、顕微鏡、粉末Ｘ線回折、単結晶Ｘ線解析、電子顕微鏡等で行うことが可能である。

上記工程における加熱温度は、２０～２１０℃であり、好ましくは４０～２１０℃であり、より好ましくは５０～１８０℃であり、さらに好ましくは５０～１５０℃である。加熱温度が２０℃以上、特には４０℃以上であることにより、結晶化プロセスより促進される。また、加熱温度が２１０℃以下であることにより、上記工程をより安全に行うことが可能となり、また、高熱による不測の反応などを抑制することができる。

上記工程における加熱時間は、好ましくは５時間以上であり、より好ましくは１０時間以上であり、さらに好ましくは１５時間以上であり、よりさらに好ましくは１７時間以上である。また、上記工程における加熱時間は、好ましくは５００時間以下であり、より好ましくは３５０時間以下であり、さらに好ましくは２００時間以下であり、よりさらに好ましくは５０時間以下であり、さらにより好ましくは３０時間以下である。加熱時間が５時間以上であることにより、ＰＱＱグリセリン結晶の収率がより向上する傾向にある。また、加熱時間が５００時間以下であることにより、ＰＱＱグリセリン結晶の製造コストが抑えられる傾向にある。

上記のようにして、作製されたＰＱＱグリセリン結晶は、混合物中から、精製することができる。精製方法は特に制限されないが、混合物中に析出、沈殿したＰＱＱグリセリン結晶を濾別し、洗浄する方法や、混合物から不要な液体成分、例えば未反応のグリセリンやその他の分散媒を除去する方法が挙げられる。

また、ＰＱＱグリセリン結晶は、混合物に含まれる状態で、目的に応じた利用に供してもよい。例えば、ＰＱＱグリセリン結晶を含む混合物と、他の成分とを混合して、後述するソフトカプセルの内容物を調整することができる。

〔組成物〕
本実施形態の組成物は、上記ＰＱＱグリセリン結晶と、糖及び／又は有機酸と、を含む。このような組成物とすることにより、ＰＱＱグリセリン結晶を含む組成物の色がより赤色となりやすい。

組成物に用いる糖としては、特に制限されないが、例えば、単糖、二糖、多糖のいずれを使用してもよい。より具体的には、グルコース、フルクトース、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、パラチニット、デンプン、水あめ、還元水あめが挙げられる。このなかでも、糖アルコールが好ましく、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、パラチニット、還元水あめがより好ましい。糖は、一種類単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。

また、組成物に用いる有機酸としては、特に制限されないが、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、乳酸が挙げられる。このなかでも、クエン酸がより好ましい。有機酸は、一種類単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。

糖や酸の含有量は、ＰＱＱグリセリン結晶１００質量部に対して、好ましくは１０～５００質量部であり、より好ましくは１０～４００質量部であり、２０～３００質量部であり、好ましくは３０～２００質量部であり、添加することで組成物の色をより赤くすることができる。

本実施形態の組成物は、油脂をさらに含んでもよい。油脂としては、特に制限されないが、例えば、中佐脂肪酸グリセリド、ミツロウ、グリセリン脂肪酸エステル、パーム油、オリーブ油、コーン油、こめ油、魚油、ラード、牛脂、ごま油、ヒマワリ油等食用油などが挙げられる。油脂は、一種類単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。このような油脂を含むことにより、組成物をソフトカプセルの内容物としてより好適に用いることができる。

油脂の含有量は、ＰＱＱグリセリン結晶１００質量部に対して、好ましくは２０～５００質量部であり、より好ましくは２０～４００質量部であり、２０～３００質量部であり、好ましくは３０～２００質量部である。油脂を、添加することで組成物の色をより赤くすることができる。

そのほか、本実施形態の組成物は、上記成分の他に、コエンザイムＱ１０、アスタキサンチン、ＤＨＡ、イチョウ葉エキスなどを含んでいてもよい。

本実施形態の組成物の製造方法は、特に制限されないが、例えば、ＰＱＱグリセリン結晶と、各成分を混合する方法の他、ＰＱＱグリセリン結晶の製造方法における混合物に対して、上記各成分の一部または全部を添加し、ＰＱＱグリセリン結晶の作製と他の成分の混合を同時に行ってもよい。

〔ソフトカプセル〕
本実施形態のソフトカプセルは、上記組成物を内容物として含む。これにより、変色しにくく、内容物の変化のない透明なソフトカプセルを提供することができる。

なお、ＰＱＱグリセリン結晶は、内容物の製造と同時に行ってもよい。例えば、ソフトカプセル用の内容物は、４０～６０℃に加温した食用油脂にピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンを混合・撹拌しながら、均一に分散させることにより調製することができる。この混合・撹拌に用いる装置としては、特に制限されないが、例えば、バイオミキサー、ホモジェッター等の高速撹拌機または高速粉砕機が挙げられる。

このようにして得られるソフトカプセル用の内容物を、常法に従い、ソフトカプセル被膜で包み込むことによりソフトカプセル剤を製造することができる。ソフトカプセル被膜としては、特に制限されないが、例えば、ゼラチンを主成分とする皮膜が挙げられる。このような皮膜は、ゼラチンと水とグリセリンを混合し加熱してシート状にし、乾燥して水分を除去することで作成することができる。そして、このシートを用いて内容物を含み切断と接着を行うことでカプセルにする。

また、本実施形態の組成物は、二重押し出し装置を使用するシームレス型のソフトカプセルにも問題なく使用できる。シームレスカプセルでは被膜はカプセル形成後に、乾燥する。

以下、実施例及び比較例によって本実施形態をより詳細に説明するが、本実施形態はこれらの例に限定されるものではない。また、下記表の「％」は、特に断りがない限り、質量％を示す。

〔試薬〕
以下使用するピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱを用いた。また、ゼラチンは野洲化学工業株式会社Ａ製ゼラチンパウダーを用いた。その他の試薬は特に言及がない限り和光純薬製を用いた。

〔比較例Ａ１〕
まず、ピロロキノリンキノンジナトリウムの光学顕微鏡写真を図１に示す。図１から、ピロロキノリンキノンジナトリウム塩は単体では結晶性の物質であることが分かる。

〔実施例Ａ１：５０％ピロロキノリンキノンジナトリウム〕
乳鉢でピロロキノリンキノンジナトリウム１ｇとグリセリン１ｇを混合した。この混合物を７０℃のオーブンに入れて２０時間加熱し、紫色の混合物を得た。この混合物は、流動性のある粘土状の固体であった。

図２に、この混合物の光学顕微鏡写真を示す。光学顕微鏡写真では、図１のようなピロロキノリンキノンジナトリウム単体の結晶は認められず、このことから、グリセリンの添加により、ピロロキノリンキノンジナトリウムの結晶構造に変化が生じたものと考えられる。

（粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ））
比較例Ａ１のピロロキノリンキノンジナトリウムと、実施例Ａ１で得られた紫色の混合物に対して、Ｘ線構造解析装置を用いて下記の条件にて、粉末Ｘ線回折によるＸ線構造解析を行った。比較例Ａ１のピロロキノリンキノンジナトリウムの粉末Ｘ線回折結果を図３に示し、実施例Ａ１で得られた紫色の混合物の粉末Ｘ線回折結果を図４に示す。また、図３と図４の結果を重ね合わせた結果を、図５に示す。
（測定条件）
装置 ：株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００
Ｘ線 ：Ｃｕ－Ｋα／管電圧１００ｋＶ／管電流４０ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅 ：０．０２０°

図３に示す比較例Ａ１のピロロキノリンキノンジナトリウムのＸ線回折結果では、９．１，１０．３，１３．８，１７．７，１８．３，２４．０，２７．４，３１．２，３９．５に２θピークが認められた。これに対して、図４に示す実施例Ａ１の混合物のＸ線回折結果では、８．６°，９．６°，１３．２°，１６．８°，２３．７°，２６．６°，及び２７．４°に２θピークが認められた。

図４に示す実施例Ａ１の混合物では、ピロロキノリンキノンジナトリウムのＸ線回折結果で見られた多くの２θピークが消失しており、一方で、グリセリンにより２７．４°の２θピークが強く見える。図４で認められる２θピークは、グリセリンとピロロキノリンキノンを含む結晶中におけるピロロキノリンキノンジナトリウムの面間隔の距離と考えられる。

図３及び図４に示される上記粉末Ｘ線回折の結果と、図１及び図２に示される光学顕微鏡写真の結果を考慮すると、実施例Ａ１の紫色の混合物においては、グリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶が生成していると考えられる。なお、図２に示される光学顕微鏡写真の拡大率では、明確な結晶形は見られないが、上記粉末Ｘ線回折の結果からすれば、実施例Ａ１の紫色の混合物においては、非常に小さな結晶が生成していると考えられる。

（熱安定性試験）
実施例Ａ１の紫色の混合物と、比較例１のピロロキノリンキノンジナトリウムを、それぞれねじ付き試験管に入れた。そして、試験管を１２０℃のアルミブロックバスで１時間加熱した。加熱前後のサンプルの色の変化と、加熱前後のＨＰＬＣ分析によるピロロキノリンキノン回収率を算出した結果を下記表２に示す。

なお、ピロロキノリンキノン回収率は、島津製作所製ＨＰＬＣを使ってＵＶ検出器により算出した。具体的には、全てのピロロキノリンキノンを還元化するため、サンプルを前処理液（５％アスコルビン酸１０％γシクロデキストリン、０．４％リン酸（８５％））と混合し、４０℃で１時間反応させて、その後ＨＰＬＣ分析に供した。測定条件を以下に示す。
送液ユニット：LC-10AD（島津製作所社製）
逆相カラム ：InertSustain C18
粒子径5μm、内径4.6mm×長さ150mm
溶離液 ：35％MeOH/0.4％リン酸(85％)（pH2.1）
流速 ：1.5mL/min、
カラム温度 ：40℃
注入量 ：10μL
検出器ＵＶ ：320nm
分析時間 ：30min

上記表１に示されるように、実施例Ａ１で得られたグリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶は、加熱による色の変化がなく、また回収率も１００％であり含有量の変化もないことが分かる。一方で、比較例Ａ１のピロロキノリンキノンジナトリウムは加熱による含有量の変化はないが、色の変化が認められた。このことから、実施例Ａ１で得られたグリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶は、熱安定性に優れるものであることが分かった。

〔実施例A２：６６．７％ピロロキノリンキノンジナトリウム〕
乳鉢でピロロキノリンキノンジナトリウム２ｇとグリセリン１ｇを混合した。この混合物を７０℃のオーブンに入れて２０時間加熱し、混合物を得た。得られた混合物の粉末Ｘ線回折結果は、図４と同等の２θピークを示した。これにより、ピロロキノリンキノンジナトリウムとグリセリンを２：１程度で混合した場合でも実施例Ａ１と同様の結晶が得られることが分かった。

〔実施例Ａ３〕
乳鉢でピロロキノリンキノンジナトリウム２．３４ｇと７０重量％グリセリン水溶液５０ｇを混合した。この混合物を７０℃の恒温機に入れて２週間保持し、混合物を得た。得られた混合物中の個体をろ過し、エタノールで洗浄した後、減圧乾燥を一晩実行することで、暗赤色の結晶２．３２ｇを得た。

得られた結晶の粉末Ｘ線回折結果を上記と同様の条件で得たところ、８．６°、９．６°、１３．２°、１６．８°、２３．７°、２６．６°、及び２７．４°に２θピークが認められた。これら２θピークは、図４で認められた２θピークと一致していた。すなわち、上記方法によって単離した暗赤色の結晶は、グリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶であることが分かった。またこれにより、実施例A1の粉末Ｘ線回折結果は、グリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶に由来するものであることが分かった。その結果を図６に示す。

〔実施例B１：単結晶構造解析〕
実施例Ａ１で生じた結晶をより詳細に分析するために下記試験を行った。水３ｇとグリセリン７ｇを混合し、７０重量％グリセリン水をし、ピロロキノリンキノンジナトリウム１０ｍｇと７０％グリセリン水溶液１ｍＬをサンプルビンに入れて、１週間７０℃で保管した。これにより、図６で示す菱形の結晶が得られた。

得られた結晶をMicroMount先端部へ取り付けた。高輝度単結晶構造解析装置 Varimax Saturn／1200Sを使用し、反射点の自動測定は問題なく行われた。なお、測定は-180℃で行った。

その結果、得られた菱形の結晶は、ピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶であることが分かった。上記のように水を含む７０重量％グリセリン水を用いて作製したにもかかわらず、ピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶は結晶構造に水が含まれていない無水物結晶であった。

以下に、PQQ構造図および水素解離とナトリウム結合に関する表を示す。原料のピロロキリンキノンジナトリウム三水和物（BioPQQ）ではC13が解離せず、ナトリウムもついていない。この結晶ではC13は解離してナトリウムが結合している。結晶変換が起こることでプロトンとナトリウムが移動している。このような変換が起こることは予想外である。
＊文献 K. IkemotoCryst. Growth Des. 2017, 17, 8, 4118-4123

単結晶データから粉末エックス線データへの変換は、結晶解析ソフトMercuryを使用して行った。その結果、ピロロキノリンキノンジナトリウムグリセリン結晶で認められた２θピークは、８．６°，９．７°，１３．４°，１７．１°，２３．７°，２７．０°，及び２７．９°であった。図７に、粉末Ｘ線データを示す。

なお、測定条件は以下のとおりである。
実験式 Ｃ₁₇Ｈ₁₂Ｎ₂Ｎａ₂Ｏ₁₁
分子量 ４６６．２７
結晶 色、晶癖 赤，プリズム
結晶サイズ ０．７００ × ０．１００ × ０．０２０ ｍｍ
結晶系 三斜晶系
格子系 単純格子
格子パラメータ ａ＝８．７１１００Å α＝１０７．３６５００ｏ
ｂ＝９．６０９００Å β＝１００．８７０００ｏ
ｃ＝１０．９３２００Å γ＝９２．９４５００ｏ
Ｖ＝８５１．９９９９８ų
空間群 Ｐ－１ （＃２）
Ｚ ｖａｌｕｅ ２
Ｄ_calc １．８１７ ｇ／ｃｍ³
Ｆ₀₀₀ ４７６．００
μ（ＭｏＫα） １．９４８ ｃｍ^-1

この分析結果より特定される構造を図８に示す。図８（１）は、ピロロキノリンキノンジナトリウム・グリセリン結晶構造を最小単位での表記した図である。また、（２）は対称構造も含んだ構造を示す図であり、（３）は元素番号をさらに併記した図である。
は、

〔実施例C１～３〕
乳鉢でピロロキノリンキノンジナトリウム０．２０ｇとグリセリン０．１０ｇと、下記表４に記載の糖０．１０ｇとを混合した。この混合物を７０℃のオーブンに入れて２０時間保持し、混合物を得た。

得られた混合物を入れたねじ付き試験管を１２０℃のアルミブロックバスで１時間加熱し、加熱前後のサンプルの色の変化を確認した。その結果を表４に示す。下記表４に示されるように、糖をさらに添加することで、得られる混合物の色が紫（実施例Ａ１）から、赤紫（実施例C１～C３）となり、赤みが増した。

さらに、実施例C１～３により得られた混合物の粉末Ｘ線回折結果を上記と同様の条件で得たところ、図４と同等の２θピークを示した。このことからすると、グリセリンとピロロキノリンキノンを含む新規な結晶形そのものは、糖を添加したとしても変化せず、当該結晶はさらに糖を添加することで色が変わるものであることがわかった。

〔実施例C４〕
乳鉢でピロロキノリンキノンジナトリウム５０ｍｇとグリセリン１５０ｍｇを混合し、７０℃のオーブンに入れて２０時間保持して、混合物を得た。得られた混合物をソルビトール５００ｍｇとともにテストチューブに加えて、混合したところ赤色を示した。

〔実施例C５～８、比較例C１〕
下記表５の組成になるように、各成分を乳鉢で混合し、７０℃のオーブンに入れて２０時間保持して、混合物を得た。この混合物を７０℃のオーブンに入れて一晩保持して、保持前後の色変化の有無を確認した。なお、比較例C１では、ピロロキノリンキノンジナトリウムをそのまま７０℃のオーブンに入れて一晩保持して、保持前後の色変化の有無を確認した。

〔実施例D：ソフトカプセル実験〕
ソフトカプセルは油と共にその成分をゼラチンシートで包んだものである。以下、ＰＱＱとグリセリンを含む混合物をソフトカプセルに封入した場合のモデル実験を行った。

下記表６の組成になるように、各成分を乳鉢で混合し、７０℃のオーブンに入れて２０時間保持して、混合物を得た。

（ゼラチンシート作製）
食用グリセリン４３０ｇと水５７０ｇを混合して４３％グリセリン水を調製した。その後、シリコンバット（１４×１８ｃｍ）にゼラチン５０ｇを均一になるように入れ、４３％グリセリン水５０ｇをその上から均一になるように添加して混合した。次いで、アルミホイルで蓋をして１２１℃のスチームで２時間以上加熱いて溶かした。これを７０℃で乾燥して水分を除去して、ゼラチンシート作製した。作製したゼラチンシートを、２．５ｃｍ円形に打ち抜いて、減圧乾燥を一晩行った。

（モデル実験）
ガラス製４ｃｍの時計皿に食用油（日清オイリオ製中佐脂肪酸オイルＯＤＯ）３００μＬと、上記のように調整した混合物２０ｍｇを入れた。ここにゼラチンシートで上から蓋をしてラップをかけた。加速試験として５０℃４日間保存して色の変化を観察した。その結果を表６に示す。

以上の結果から、ＰＱＱとグリセリンを含む混合物はソフトカプセル内に封入しても変色せず、また、食用油脂と混合してゼラチンが接触しても変色しない安定な混合物であることが分かった。

本発明の結晶は、ピロロキノリンキノンジナトリウムの機能を利用する、食品、機能性食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等を構成する成分の一つとして産業上の利用可能性を有する。

Claims (8)

1. ピロロキノリンキノンジナトリウムと、グリセリンと、を含む、
   結晶。
2. 前記ピロロキノリンキノンジナトリウムの含有量が、前記結晶の総量に対して、５～８５質量％であり、
   前記グリセリンの含有量が、前記結晶の総量に対して、１５～９５質量％である、
   請求項１に記載の結晶。
3. Ｃｕ－Ｋαを用いた粉末Ｘ線回折において、８．６±０．４°，９．６±０．４°，１３．４±０．４°，１７．１±０．４°，２３．７±０．４°，２７．０±０．４°，及び２７．９±０．４°に２θピークを示す、
   請求項１又は２に記載の結晶。
4. 前記結晶の結晶格子に含まれる、前記ピロロキノリンキノンジナトリウム分子と前記グリセリン分子が１：１の割合である、
   請求項１～３のいずれか一項に記載の結晶。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶と、
   糖及び／又は有機酸と、を含む、
   組成物。
6. 油脂をさらに含む、
   請求項５に記載の組成物。
7. 請求項５又は６に記載の組成物を内容物として含む、
   ソフトカプセル。
8. 請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶の製造方法であって、
   グリセリンとピロロキノリンキノンジナトリウムの混合物を、２０～２１０℃で加熱して結晶を得る工程を有する、
   結晶の製造方法。