WO2014071772A1 - 吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 - Google Patents

吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 Download PDF

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朱理平
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诸城市浩天药业有限公司
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the invention relates to a novel crystallization of a disodium salt of pyrroloquinoline quinone and a preparation method thereof. Background technique
  • PQQ Pyrroloquinoline Quinone
  • PQQ-deficient mice have slow growth, poor reproductive ability, and are prone to joint inflammation, which may be one of the essential vitamins in the body;
  • PQQ protects the liver from CC14 or alcohol damage;
  • purified PQQ reduces glucocorticoid-induced cataract formation during chick embryo development;
  • PQQ protects nerve cells from NMDA toxicity, thereby preventing brain ischemia Hypoxia, to avoid severe shock in animal models;
  • PQQ also has prevention and treatment of myocardial ischemia, myocardial infarction, and effective prevention and treatment of atherosclerosis.
  • PQQ can be prepared by fermentation and chemical synthesis.
  • the crystalline form of PQQ disodium salt obtained by these methods is unstable and highly hygroscopic. In the temperature range of normal temperature storage, the humidity changes greatly, and the solid state is not ideal, thus causing the application and storage of PQQ disodium salt. Very adverse effects.
  • Patent Document 1 Application No. CN201080031945, Application Date: June 9, 2010
  • Patent Document 1 Application No. CN201080031945, Application Date: June 9, 2010
  • the crystal has high hygroscopicity and is not suitable for processing and storage. Therefore, in view of the application of PQQ in various aspects such as pharmacy, health care, food science, etc., there is an urgent need in the art to obtain PQQ crystals having high stability, excellent processability and storability in a high purity state and Preparation. Summary of the invention
  • One of the main objects of the present invention is to provide a stable PQQ disodium salt crystal and a preparation method thereof from the viewpoints of crystallinity, stability, hygroscopicity and/or processability.
  • the inventors of the present invention screened and obtained a crystal form suitable for applications such as medicine, food, health care, etc. by designing crystallization conditions of the PQQ disodium salt.
  • a disodium salt crystal A of pyrroloquinoline quinone wherein the crystal A has an X-ray powder diffraction pattern obtained by Cu- ⁇ ray diffraction and is diffracted at a 2 ⁇ angle as follows Peaks: 9.6 ⁇ 0.2 °, 11.6 ⁇ 0.2 °, 14.9 ⁇ 0.2 °, 16.0 ⁇ 0.2 °, 18.8 ⁇ 0.2.
  • the X-ray powder diffraction pattern of the crystal A obtained by Cu-K ⁇ -ray diffraction has a diffraction peak at a temperature of 2 ⁇ as follows: 9.2 ⁇ 0.2. , 9.6 ⁇ 0.2. , 11.6 ⁇ 0.2. , 13.5 ⁇ 0.2. 14.9 + 0.2°, 16.0 ⁇ 0.2°, 18.2 ⁇ 0.2°, 18.8 ⁇ 0.2. 19.4 ⁇ 0.2°, 20.4 ⁇ 0.2°, 21.9 ⁇ 0.2°, 22.7 ⁇ 0.2.
  • the X-ray powder diffraction pattern of the crystalline ruthenium obtained by Cu-K alpha ray diffraction is substantially as shown in Fig. 1.
  • the hygroscopicity of the disodium salt crystals A 65 to 80% RH is less than 3% at 25 °C.
  • the change in wettability of the disodium salt crystal A at 25 ° C from 65% RH to 80% RH is less than 1%, preferably less than 0.6%.
  • thermogravimetric analysis curve of the disodium salt crystal A in the range of 30-400 ° C is substantially as shown in Fig. 2.
  • the disodium salt crystal A is a dihydrate.
  • the differential scanning calorimetry pattern obtained by the disodium salt crystal A in the range of 50-280 ° C at a scan rate of 10 ° C/min is substantially as shown in FIG.
  • a disodium salt crystal of pyrroloquinoline quinone said crystal B
  • the X-ray powder diffraction pattern obtained by Cu-K ⁇ -ray diffraction has diffraction peaks at the following 2 ⁇ angles: 8.1 ⁇ 0.2°, 9.0 ⁇ 0.2°, 10.1 ⁇ 0.2. 13.7 ⁇ 0.2°, 16.4 ⁇ 0.2°, 17.6 ⁇ 0.2°, 18.2 ⁇ 0.2°, 23.9 ⁇ 0.2°, 25.8 ⁇ 0.2°, 27.2 ⁇ 0.2°, 31.0 ⁇ 0.2°, 39.5 ⁇ 0.2°.
  • the X-ray powder diffraction pattern obtained by Cu-K ⁇ ray diffraction of the crystalline ruthenium has a peak intensity of less than 600 at the following 2 ⁇ angle.
  • the peak intensity of the X-ray powder diffraction pattern obtained by Cu-K ⁇ ray diffraction of the crystal enthalpy at the following 2 ⁇ angle is (2 ⁇ /peak intensity): 9.0 517, 10.1 366, 16.4 107, 23.9 582, 27.2°/51 1 (The peak intensity may vary somewhat depending on the experimental and sample conditions, etc., but the range of the difference is within the range that one of ordinary skill in the art can expect).
  • the moisture content of the disodium salt crystal B at 65 to 80% RH is lower than or equal to 12.0% at 25 °C.
  • the change in wettability of the disodium salt crystal B at 25 ° C from 65% RH to 80% RH is less than 1.5%, preferably less than or equal to 1.0%.
  • the X-ray powder diffraction pattern of the crystal B obtained by Cu-K alpha ray diffraction is substantially as shown in Fig. 5.
  • thermogravimetric analysis curve of the disodium salt crystal enthalpy in the range of 30-400 ° C is substantially as shown in Fig. 6.
  • the disodium salt crystal B is a dihydrate.
  • the differential scanning calorimetry pattern obtained by the disodium salt crystal B in the range of 50-280 ° C at a scanning rate of 10 ° C / min is substantially as shown in FIG.
  • a process for the preparation of the disodium salt crystal A of the invention the preparation method being selected from the group consisting of:
  • the solvent is evaporated to dryness at 60 ° C to obtain the disodium salt crystal A;
  • (C) Antisolvent precipitation crystallization method Dissolving pyrroloquinoline quinone disodium salt in a high solubility solvent at a temperature range of 20 to 60 ° C, and adding a low solubility antisolvent to the resulting system to precipitate the second Sodium salt crystal A, wherein, at 25 ° C, the solubility of pyrroloquinoline quinone disodium salt in the high solubility solvent is 0.35 g / 100 g solvent, pyrroloquinoline quinone disodium salt in the low solubility antisolvent The solubility in the solution is 0.15 g / 100 g of solvent.
  • the pyrroloquinoline quinone disodium salt is prepared by chemical synthesis or fermentation production. In another preferred embodiment, the pyrroloquinoline quinone disodium salt contains or does not contain crystals.
  • the pyrroloquinoline quinone disodium salt may or may not contain impurities, and the purity thereof is
  • the mass-to-volume ratio g/L between the pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is from 100:1 to 1:100.
  • the mass-to-volume ratio g/L between the pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is from 100:1 to 1:50, preferably from 100:1 to 1:1.
  • the mass-to-volume ratio g/L between the pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is 50:1 to 1:100, preferably
  • the methods (A) to (C) are carried out at room temperature to 55 ° C, preferably 25 to 50 ° C, more preferably room temperature, 25 ° C or 50 ° C.
  • the agitation time in the methods (A) and (B) is at least 2 hours, preferably 2 hours to 10 days, more preferably 2 hours to 7 days.
  • the volatilization time in the method (B) is at least 2 hours, preferably 2 hours to 14 days, more preferably 2 hours to 10 days; and the volatilization can be carried out under vacuum.
  • the purity of the PQQ disodium salt obtained by the method according to any one of the methods (A) to (C) is determined by high performance liquid chromatography to be higher than 99.0%, preferably higher than 99.5%, more It is preferably higher than 99.8%.
  • the solvents used in the methods (A), (B), and (C) are each selected from the group consisting of, wherein the ratio is a volume ratio:
  • the high solubility solvent in the method (C) is water, and the low solubility antisolvent is selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, acetone, acetonitrile and tetrahydrofuran.
  • the solvent for carrying out the process (A) at 25 ° C is selected from the group consisting of acetonitrile, methanol, ethanol, water, methanol: water, ethanol: water, acetone: water, acetonitrile: water, tetrahydrofuran: Water, methanol: hexane, ethanol: hexane, acetonitrile: hexane, tetrahydrofuran: hexane, methanol: methyl tert-butyl ether, ethanol: methyl tert-butyl ether, methanol: toluene, ethanol: toluene, acetonitrile: Toluene, methanol: methyl isobutyl ketone, wherein the volume ratio of each solvent in each mixed solvent is 5:1-1:5, preferably 2:1 to 1:2, more preferably 1:1.
  • the solvent for carrying out the process (A) at 50 ° C is selected from the group consisting of acetonitrile, methanol, ethanol, acetamidine, hydrazine, methanol: water, ethanol: water, acetonitrile: water, tetrahydrofuran : water, methanol: hexane, ethanol: hexane, acetonitrile: hexane, toluene: hexane, methanol: methyl tert-butyl ether, ethanol: methyl tert-butyl ether, methanol: toluene, ethanol: toluene, acetonitrile Toluene, methanol: methyl isobutyl ketone, wherein the volume ratio of each solvent in each mixed solvent is 5:1 to 1:5, preferably 2:1 to 1:2, more preferably 1:1.
  • the solvent used in carrying out the method (B) at 25 ° C is selected from the group consisting of methanol: water (1:2 to 1:6), ethanol: water (1:2 to 1:6). , Isopropanol: water (1:2), acetone: water (2:9 ⁇ 1:4), acetonitrile: water (2:5 ⁇ 1:4), tetrahydrofuran: water (2:5 ⁇ 1:4) .
  • the solvent for carrying out the process (B) at 50 ° C is selected from the group consisting of methanol: water (1:6), ethanol: water (1:2), isopropanol: water (1) : 2), Acetone: water (2:9), acetonitrile: water (2:5 to 1:4), tetrahydrofuran: water (2:5).
  • a process for the preparation of the disodium salt crystals B of the invention the process being selected from the group consisting of:
  • the pyrroloquinoline quinone disodium salt is prepared by chemical synthesis or fermentation production.
  • the pyrroloquinoline quinone disodium salt contains or does not contain crystals.
  • the pyrroloquinoline quinone disodium salt may or may not contain impurities, and the purity thereof is
  • the mass-to-volume ratio g/L between the pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is 100:1 to 1:100. .
  • the mass-to-volume ratio g/L between the pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is from 100:1 to 1:50, preferably from 100:1 to 1:1.
  • the mass-to-volume ratio g/L between pyrroloquinoline quinone disodium salt and the initially used solvent is 50:1 to 1:100, preferably
  • the method ( ⁇ ') ⁇ ( ⁇ ') is carried out at room temperature to 55 ° C, preferably 25 to 50 ° C, more preferably room temperature, 25 ° C or 50 ° C.
  • the stirring time in the method ( ⁇ ') is at least 2 hours, preferably 2 hours to 10 days, more preferably 2 hours to 7 days.
  • the volatilization time in the process ( ⁇ ') is at least 2 hours, preferably 2 hours to 14 days, more preferably 2 hours to 10 days; and the volatilization can be carried out under vacuum.
  • the solvents used in the methods ( ⁇ ') and ( ⁇ ') are each selected from the group consisting of:
  • the solvent when the method ( ⁇ ') is carried out at 25 ° C is selected from the group consisting of acetone, isopropanol, isoamyl alcohol, ethyl acetate, isopropyl acetate, hexanthene, hydrazine, Methyl tert-butyl ether, methyl isobutyl ketone, methylene chloride, chloroform, tetrahydrofuran, toluene, nitroguanidine, diethyl ether, methyl ethyl ketone, acetone: acetamidine, methyl ethyl ketone: ethyl hydrazine, nitroguanidine: ⁇ , ethyl acetate: acetamidine, methyl tert-butyl ether: acetamidine, toluene: acetamidine, acetone: methyl tert-butyl ether,
  • the solvent at the time of the process ( ⁇ ') at 50 ° C is selected from the group consisting of acetone, isopropanol, isoamyl alcohol, ethyl acetate, isopropyl acetate, methyl t-butyl Ether, methyl isobutyl ketone, methylene chloride, chloroform, tetrahydrofuran, toluene, nitroformamidine, diethyl ether, methyl ethyl ketone, acetone: ethyl hydrazine, methyl ethyl ketone: ethyl hydrazine, tetrahydrofuran: ethyl hydrazine, nitroguanidine: ⁇ , ethyl acetate: acetamidine, methyl tert-butyl ether: acetamidine, acetone: methyl tert-butyl ether, methyl e
  • the solvent used in the process ( ⁇ ') at 25 ° C is isopropanol: water (1:4).
  • the solvent at the time of carrying out the process ( ⁇ ') at 50 ° C is selected from the group consisting of tetrahydrofuran: water (1:4).
  • the purity of the PQQ disodium salt obtained by the method of any one of the methods ( ⁇ ') to ( ⁇ ') is determined by high performance liquid chromatography to be higher than 98.0%, preferably higher than 99%. More preferably, it is higher than 99.5%.
  • a composition or package comprising:
  • the composition or package is selected from the group consisting of a pharmaceutical composition, a functional food, a vocabulary, an additive, a microbial growth inhibitor, and a preservative.
  • the disodium salt crystals are added in an amount of 0.001 wt% to 99.99 wt%, preferably 0.01 ⁇ [% to 99.0 wt%, more preferably 0.1 ⁇ [% to 90] by weight of the composition. Wt%.
  • the form of the disodium salt crystals in the composition or package is selected from the group consisting of: powder, granules, or pellets, preferably in powder form.
  • the composition or package is for one or more uses selected from the group consisting of: growth promoting, anti-inflammatory, zinc-increasing, preventing liver disease, reducing cataract formation, preventing cancer, Promote nerve regeneration, prevent myocardial infarction, atherosclerosis, hangover, prevent/resolve or treat senile dementia, inhibit microbial growth, and prolong food preservation time.
  • composition or package may further comprise one or more other active substances having an activity selected from the group consisting of: growth promoting, anti-inflammatory, zinc increasing, lead prevention, liver disease prevention, reduction Cataract formation, anti-cancer, promotion of nerve regeneration, prevention of myocardial infarction, atherosclerosis, hangover, prevention/remission or treatment of senile dementia, inhibition of microbial growth or prolonged food preservation time.
  • active substances having an activity selected from the group consisting of: growth promoting, anti-inflammatory, zinc increasing, lead prevention, liver disease prevention, reduction Cataract formation, anti-cancer, promotion of nerve regeneration, prevention of myocardial infarction, atherosclerosis, hangover, prevention/remission or treatment of senile dementia, inhibition of microbial growth or prolonged food preservation time.
  • a disodium salt crystal of pyrroloquinoline quinone of the present invention A The disodium salt crystal of pyrroloquinoline quinone of the invention B, the disodium salt of pyrroloquinoline quinone prepared by the method of the invention, and/or the pyrrole prepared by the method of the invention
  • the pharmaceutical composition or functional food may further comprise one or more other active substances having an activity selected from the group consisting of: growth promotion, anti-inflammatory, zinc-increasing, lead prevention, and prevention of liver diseases.
  • growth promotion anti-inflammatory, zinc-increasing, lead prevention, and prevention of liver diseases.
  • Other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from this disclosure. Also, those skilled in the art can effectively combine the various features and aspects described herein, and such combinations are still within the scope of the present application.
  • Figure 1 X-ray powder diffraction (XRPD) pattern of the crystal A obtained in Example 1;
  • FIG. 1 Differential Scanning Calorimetry (DSC) chart of Crystal A obtained in Example 1;
  • FIG. 4 Hygroscopicity analysis (DVS) chart of the crystal A obtained in Example 1;
  • Figure 5 X-ray powder diffraction (XRPD) pattern of the crystal B obtained in Example 4.
  • FIG. 7 Differential Scanning Calorimetry (DSC) chart of the crystal B obtained in Example 4.
  • FIG. 8 Hygroscopicity analysis (DVS) chart of the crystal B obtained in Example 4.
  • Fig. 9 X-ray powder diffraction (XRPD) pattern of the crystal C obtained in Comparative Example 1;
  • Fig. 10 Thermogravimetric analysis (TG) chart of the crystal C obtained in Comparative Example 1.
  • FIG 11 Differential Scanning Calorimetry (DSC) chart of the crystal C obtained in Comparative Example 1;
  • Figure 12 Hygroscopicity analysis (DVS) chart of the crystal C obtained in Comparative Example 1.
  • Figure 13A Superposition comparison of XRPD spectra of crystals A, B and crystal C;
  • Fig. 13B XRPD spectrum of crystal A, B and crystal C are superimposed and enlarged 1 ;
  • Figure 13C XRPD pattern of crystallized A, B and crystal C.
  • Figure 14 Superposition comparison of TG spectra of crystal A, B and crystal C
  • Figure 15 Superposition comparison of DSC spectra of crystal A, B and crystal C
  • Figure 16 DVS spectrum overlay of crystallization A, B and crystallization C;
  • Figure 17A Raman spectrum overlay comparison of crystals A, B and crystal C;
  • Figure 17B Raman spectrum overlay magnification comparison of crystal A, B and crystal C 1;
  • Figure 17C Raman spectrum of the crystals A, B and crystallization C.
  • FIG 18A Infrared spectroscopy (IR) spectra of crystals A, B and crystallization C are superimposed;
  • Figure 18B IR spectra of crystals A, B and crystal C are superimposed and enlarged 1;
  • Figure 18C IR spectra of crystals A, B and crystal C are superimposed and enlarged 2;
  • Figure 19 XRPD of Crystalline A, B, Crystalline C and Crystalline D (JACS, Journal of the American Chemical Society, August 1989, Vol. 111, No. 17, 6822-6828, shown as single crystal PQQ sodium salt crystals) Spectral overlay comparison;
  • the inventors have obtained long-term and in-depth research and obtained PQQ disodium salt crystals A and B, and unexpectedly found that the crystal has excellent properties such as high purity, low moisture absorption and good stability, and its storage and use are better.
  • the known PQQ disodium salt solids are more convenient and are particularly suitable for use in the preparation of compositions or packages comprising PQQ disodium salt. On this basis, the inventors have completed the present invention.
  • crystal has the meaning conventionally known in the art, that is, a solid consisting of a crystalline material whose internal structural points (e.g., atoms, molecules) are arranged in a translational periodicity.
  • the terms "pyroloquinoline quinone” and “PQQ” are used interchangeably and refer to a compound of the formula I as defined above.
  • the PQQ disodium salt used can be obtained by a conventional method in the art, for example, by a fermentation method (for example, Patent Document CN 101228963 B) and an organic chemical synthesis method (J. Am). . Chem. Soc, 1981, 103, 5599 ⁇ 5600) Preparation.
  • the PQQ disodium salt used in the raw material may be crystalline or amorphous.
  • the raw materials used may also contain impurities.
  • the solubility of the PQQ disodium salt in different solvents can be determined by a conventional method before the preparation of the crystallization, and The crystals of the invention are then prepared using a suitable solvent.
  • the solubility of PQQ disodium salt in various solvents can be determined by the following method:
  • PQQ disodium salt crystal A can be obtained by the method (A) suspension crystallization method, method (B) slow evaporation method or method (C) anti-solvent precipitation crystallization method.
  • PQQ disodium salt is dissolved in 0.5 to 5 ml of a solvent having a high solubility, and then 4 to 20 ml of a solvent (anti-solvent) highly insoluble to PQQ disodium salt is added, and precipitation is precipitated to obtain crystals.
  • solvents which can be used in the operation of the method (A) at 50 ° C include, but are not limited to: acetonitrile, methanol, ethanol, acetamidine, hydrazine, methanol: water (1:1), ethanol: water (1: 1), acetonitrile: water (1:1), tetrahydrofuran: water (1:1), methanol: hexane (1:1), ethanol: hexane (1:1), acetonitrile: hexane (1:1) , Toluene: hexane (1:1), Methanol: Methyl tert-butyl ether (1:1), Ethanol: Methyl tert-butyl ether (1:1), Methanol: Toluene (1:1), Ethanol: Toluene (1:1), Ethanol: Toluene (1:1), acetonitrile: toluene (1:1), m
  • the stirring is carried out at 25 ° C and 50 ° C, preferably, stirring is carried out as needed, and then the solvent is evaporated under vacuum, and the stirring time is preferably 2 h to 7 d.
  • solvents used in the slow volatilization method at (3) 50 ° C including methanol: water (1:6), ethanol: water (1 : 2), isopropanol: water (1:2), acetone: water (2:9), acetonitrile: water (2:5; 1:4), tetrahydrofuran: water (2:5).
  • the mass to volume ratio (g/L) of the raw material to the solvent is from 10:1 to 1:100.
  • the stirring balance described in the method (B) is preferably carried out as needed, and then the solvent is evaporated at 25 ° C and 50 ° C, and the drying time is preferably 2 h to 10 d.
  • the time for precipitation of the anti-solvent after the addition of the anti-solvent described in the method (C) is set to 2h to 2d.
  • Very high purity crystal A can be obtained by the method (A), (B) or (C) of the present invention, and its purity can be determined to be more than 99.8% by high performance liquid chromatography.
  • PQQ disodium salt crystallization B can be obtained by a method ( ⁇ ') suspension crystallization method or a method ( ⁇ ') slow evaporation method.
  • the crystallization enthalpy can be prepared by carrying out the method ( ⁇ ') or ( ⁇ ') at 25 ° C and 50 ° C.
  • One of ordinary skill in the art can adjust the conditions in these methods based on common sense:
  • solvents that can be used in the process at 50 ° C include, but are not limited to: acetone, isopropanol, isoamyl alcohol, ethyl acetate, isopropyl acetate, methyl tert-butyl ether, Methyl isobutyl ketone, chloroform, chloroform, tetrahydrofuran, toluene, nitroformamidine, diethyl ether, methyl ethyl ketone, acetone: ethyl hydrazine (1:1), methyl ethyl ketone: ethyl hydrazine (1:1), tetrahydrofuran: acetamidine (1:1), nitroformamidine: acetamidine (1:1), ethyl acetate: acetamidine (1:1), methyl tert-butyl ether: acetamidine (1:1), Acetone: methyl tert
  • the crystallization B is prepared by the method ( ⁇ '), and when stirring is carried out at 25 ° C and 50 ° C, stirring is preferably carried out as needed, and then the solvent is evaporated under vacuum, and the stirring time is preferably 2 h to 7 d.
  • solvents that can be used in the process at 25 ° C, including but not limited to: isopropanol: water (1:4), etc.; can be used in the process ( ⁇ ') at 50 ° C
  • solvents include, but are not limited to: tetrahydrofuran: water (1:4).
  • the mass to volume ratio (g/L) of the raw material to the solvent is from 10:1 to 1:100.
  • the mixture is stirred and balanced in the operation, it is preferred to carry out stirring as needed, and then the solvent is evaporated at 25 ° C and 50 ° C, and the drying time is preferably 2 h to 10 d.
  • the inventors further studied the properties of PQQ disodium salt crystals using various methods and instruments.
  • X-ray powder diffraction also known as “X-ray polycrystalline diffraction (XRD or SRPD)" is a commonly used test method for determining crystal structure (ie, crystal form).
  • An X-ray powder diffractometer is used to generate a series of diffraction patterns when X-rays are transmitted through the crystal. The different diffraction lines and their intensities in the spectrum are determined by the atomic groups of a certain structure, thereby determining the specific crystal structure of the crystal.
  • the PQQ disodium salt crystal of the present invention has a specific crystal morphology which has a specific characteristic peak in an X-ray diffraction pattern.
  • the X-ray powder diffraction pattern of crystal A obtained by Cu-K ⁇ -ray diffraction has a diffraction peak at about 2 ⁇ angle: 9.2. , 9.6. 11.6. 13.5. 14.9. , 16.0. 18.2. 18.8. 19.4. 20.4. 21.9. 22.7. , 23.2. 23.8. 25.6. 26.4. 27.3. 28.4. 30.7. 31.7. 32.4. 33.7. , 35.0. 35.8. 36.7. , 38.0. , 38.6. PQQ disodium salt crystals (all ⁇ 0.2%).
  • the X-ray powder diffraction pattern obtained by crystallizing cerium by Cu-K ⁇ ray diffraction has diffraction peaks at about 2 ⁇ angles as follows: 8.1°, 9.0°, 10.1. , 13.7. 16.4. 17.6. 18.2. 23.9. 25.8. 27.2. , 31.0. , Crystallization of PQQ disodium salt at 39.5° (both ⁇ 0.2°).
  • the measurement of the diffraction angle 2 ⁇ of the above X-ray powder diffraction was carried out under the following measurement conditions.
  • the above peaks can also be observed by other conventional X-ray powder diffraction instruments equipped with a monochromator. Further, the above-described crystal shape specified in the present invention may contain a measurement error, and therefore, the peak value is considered to be reasonable as long as it is within the measurement error range.
  • the crystal of the present invention can also be characterized and studied by conventional methods such as differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (CTG), and infrared scanning (IR).
  • DSC differential scanning calorimetry
  • CCG thermogravimetric analysis
  • IR infrared scanning
  • the crystal ruthenium and the crystal ruthenium of the present invention may be a hydrate (e.g., a dihydrate) having a melting point above the decomposition temperature thereof as long as it has a measurement peak of a diffraction angle of 2 ⁇ of the above X-ray powder diffraction.
  • the crystals A and B of the present invention have significantly reduced hygroscopicity, so that the crystal of the present invention is not easily hygroscopic in application and storage to form undesirable forms such as agglomerates, thereby having good stability and Processability.
  • Application of the crystal of the invention is a hydrate (e.g., a dihydrate) having a melting point above the decomposition temperature thereof as long as it has a measurement peak of a diffraction angle of 2 ⁇ of the above X-ray powder diffraction.
  • PQQ has the pharmacological effects of promoting growth, anti-inflammatory, zinc-increasing lead, preventing liver disease, reducing cataract formation, anti-cancer, promoting nerve regeneration, preventing and treating myocardial infarction and atherosclerosis, PQQ also inhibits microbial growth in foods and can extend the shelf life of food.
  • the PQQ crystal A and the crystal B of the present invention can be used in combination with a "pharmaceutically or physiologically or pharmaceutically acceptable carrier" as an active ingredient of various compositions by oral, spraying, intranasal, or transdermal. The skin and other routes are given to the desired subject.
  • the PQQ disodium salt crystal A and/or B active ingredient in the composition of the present invention is 0.001 to 99.9% by weight based on the total weight of the composition; preferably from 1 to 95% by weight, more preferably from 5 to 90% by weight, based on the total weight of the composition. More preferably, it is 10 to 80% by weight.
  • the balance is a pharmaceutically acceptable carrier and other additives.
  • the term "pharmaceutically or physiologically or pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier for use in a nutraceutical or pharmaceutical formulation, including various excipients and diluents, which are not necessarily active in themselves. No, and no or no excessive toxicity after application. Suitable carriers are well known to those of ordinary skill in the art. For example, pharmaceutically acceptable carriers are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., NJ 1991.
  • Acceptable carriers in the compositions may contain liquids such as water, saline, glycerol and ethanol.
  • auxiliary substances such as fillers, disintegrants, lubricants, glidants, effervescent agents, wetting or emulsifying agents, flavoring agents, pH buffering substances and the like may also be present in these carriers.
  • these materials can be formulated in a non-toxic, inert, andpharmaceutically acceptable aqueous carrier medium wherein the pH is usually from about 5 to about 8, preferably, the pH is from about 6 to about 8.
  • the composition of the present invention may be selected from the group consisting of pharmaceutical compositions, functional foods, literary materials, additives, microbial growth inhibitors, and preservatives.
  • PQQ crystal A or crystal B can be used alone or in combination with other materials including, but not limited to, vitamins, amino acids, carotenoids, omega 3 fatty acids, omega 6 fatty acids, astaxanthin, and the like.
  • the crystal or composition of the present invention may be packaged according to specific needs, such as a kit, a functional food kit, etc., which may comprise: a PQQ disodium salt crystal of the present invention; optionally, other active substances, instructions
  • a kit such as a kit, a functional food kit, etc.
  • the user or physician uses the instructions, containers, excipients, and the like of the kit, and those skilled in the art can determine the optional components therein according to specific needs.
  • composition or package of the present invention may further comprise one or more other active substances having an activity selected from the group consisting of: growth promoting, anti-inflammatory, zinc increasing and lead reducing, preventing liver disease, reducing cataract formation, preventing cancer, Promotes nerve regeneration, prevents myocardial infarction, atherosclerosis, hangover, prevents/alleviates or treats senile dementia, inhibits microbial growth or prolongs food preservation time.
  • active substances include, but are not limited to, vitamins, amino acids, carotenoids, omega 3 fatty acids, omega 6 fatty acids, astaxanthin, and the like.
  • the crystals A and B of the present invention have significant advantages in terms of crystallinity, stability, hygroscopicity, and processability as compared with known PQQ disodium salt crystals or solids, and thus are in industrial, pharmaceutical, and functional foods. Other fields have broad application prospects.
  • the PQQ disodium salt was obtained by the following procedure:
  • the optimization of the method used in the present invention mainly lies in: 1) changing the noble metal platinum of the catalyst used in the catalytic hydrogenation reaction to palladium; 2) coupling reagent in the diazotization coupling reaction in the literature. Methyl 2-methylacetoacetate was changed to ethyl 2-methylacetoacetate; 3) The ester hydrolysis reaction in the literature was first reacted with orthoformate to obtain a monoketal and then hydrolyzed under basic conditions to obtain the final product. The product is obtained by adjusting the pH directly after hydrolysis under basic conditions.
  • the diazonium fluoroborate is formed by diazotization of the amino group under the action of sodium nitrite, and the diazonium fluoroborate is directly coupled with 2-methylacetoacetate to obtain 2- ⁇ [ (3-formamido-4-methoxy)aryl]ilonyl propionate;
  • Oxidation reaction The product of the previous step forms an anthracene ring under the action of an oxidizing agent to obtain 4,5-dioxo-4,5-dihydro-1hydro-pyrrole [2,3-f]quinoline-2,7,9 - tricarboxylic acid-2-ethyl ester-7,9-dimethyl ester;
  • the obtained PQQ disodium salt raw material is crystal C.
  • the obtained PQQ disodium salt can be determined by high performance liquid chromatography to have a purity greater than 99.0% under the following conditions: Instrument model: UlTiMate3000, American Dion
  • PQQ disodium salt prepared according to the method of the above reference example (purity ⁇ 98, also commercially available sigma company PQQ disodium salt, article number: 80198-10MG-F), at 25 ° C and 50 ° C conditions After stirring for 5 days with 1 mL of acetonitrile, the solution was separately filtered, and the solid portion was dried in air for 10 min to obtain PQQ disodium salt crystal A.
  • the obtained PQQ disodium salt crystal A was subjected to X-ray powder diffraction analysis (XRPD, Fig. 1), thermogravimetric analysis (TG, Fig. 2), differential scanning calorimetry (DSC, Fig. 3), and hygroscopicity analysis (DVS, Figure 4)
  • the X-ray powder diffraction pattern of the obtained crystal was measured under the conditions shown below. The results are shown in Figure 1.
  • the peak of 20 obtained by X-ray powder diffraction using Cu- ⁇ radiation is about: 9.2°, 9.6°, 1 1.6°, 13.5. 14.9. , 16.0. 18.2. 18.8. 19.4. 20.4. 21.9. 22.7. , 23.2. 23.8. 25.6. 26.4°, 27.3°, 28.4°, 30.7°, 31.7°, 32.4°, 33.7°, 35.0°, 35.8°, 36.7°, 38.0°, 38.6. (all ⁇ 0.2 °).
  • the solid obtained is crystalline.
  • TG (Fig. 2) shows that the crystal enthalpy has 1.33% and 6.02% weight loss at 30 ⁇ 200 °C (the theoretical weight loss of a water molecule is 4.6%), which may be hydrate, and the decomposition peak temperature is 312.5 °C.
  • the corresponding DSC (Fig. 3) has an endothermic peak in this temperature range (30 ⁇ 200 °C), indicating that the crystal contains water. Also, no melting phenomenon was observed in the temperature rise range, which indicates that the melting point may be above the decomposition temperature of the drug.
  • DVS (Fig. 4) shows that crystal A absorbs 1.6% of water at 40% RH, 2.3% of moisture at 65% RH, and 2.8% of moisture at 80% RH.
  • hygroscopicity change is less than 2%, only slightly hygroscopic.
  • Example 3 Preparation of POO disodium salt crystals by anti-solvent precipitation crystallization A and properties of the obtained crystals were taken as 1 mg of PQQ disodium salt (prepared in the reference example), dissolved in 2 mL of water, and stirred and equilibrated. Subsequently, it was placed in a brown glass bottle containing 6 mL of absolute ethanol, and after 12 hours, a precipitate was precipitated. The solid obtained by filtration was subjected to pressure drying to obtain PQQ disodium salt crystal A.
  • Example 4 Preparation of POO disodium salt crystals B by suspension crystallization and the properties of the obtained crystals
  • TG (Fig. 6) shows that crystallization B has a weight loss interval of 5.98% and 6.21% at 30 to 200 °C (the theoretical weight loss value of a water molecule is 4.6%, and the theoretical weight loss value of ethyl acetate is 19.1%). May be a hydrate.
  • the decomposition peak temperature is 303.3 °C.
  • the corresponding DSC (Fig. 7) has an endothermic peak in this temperature range, indicating that the crystal contains water. Also, no melting phenomenon was observed in the temperature rise range, which indicates that the melting point of the crystal B may be above the decomposition temperature of the drug. 4. Hygroscopic analysis
  • DVS (Fig. 8) shows that crystallization B absorbs 7.3% of water at 40% RH, absorbs 1.0% at 65% RH, and absorbs 12.0% at 80% RH.
  • a monohydrate is formed; in a range of relative humidity of more than 50, a dihydrate is formed; and humidity is further increased to form a polyhydrate.
  • Example 5 Preparation of POO disodium salt crystals B by slow volatilization method and properties of the obtained crystals
  • the X-ray powder diffraction spectrum of the crystal C shows the result in Fig. 9, and the peak of 2 ⁇ obtained by using the Cu- ⁇ ⁇ ray by X-ray powder diffraction appeared 8.2. , 8.6. , 9.0. 10.1. , 13.7. 17.6. 18.2. , 23. 9. 26.9. 27.1. 28.3. , 3 1.0. , 3 1.6. 32.6. , 39.4. 45.3. ( ⁇ 0.2.).
  • TG (Fig. 10) shows that there is obvious weight loss at the beginning of the experiment, and the surface moisture is more.
  • the crystal C has 4.37% and 7.06% weight loss at 30 ⁇ 180 °C (the theoretical weight loss value of a water molecule is 4.6%). ), may be a hydrate.
  • the corresponding DSC (Fig. 1 1) has an endothermic peak appearing in this temperature range, indicating that the crystal contains water.
  • DVS (Fig. 12) shows that crystallization C is extremely hygroscopic, and the humidity varies greatly in the range of 5-15% in the normal storage humidity range.
  • the moisture content in the 40% RH is 7.8%, the moisture in the 65% RH is 13.8%, and the moisture in the 80% RH is 15.7%.
  • Non-Patent Document 1 JACS, 161, 6822-6828
  • the X-ray of the single crystal reported in Non-Patent Document 1 is close to the data of the structural analysis, and the peak of the X-ray powder diffraction caused by the crystal (crystal D) is simulated.
  • the results are shown in Figure 19 using the origin mapping software. The results showed that the peak value was different from the crystallization position of the present invention (see Table 2 for details). Comparative Example 3.
  • Patent Document 1 JACS, 161, 6822-6828
  • the three crystals obtained in the examples were compared by XRPD, TG, DSC, DVS, Raman spectroscopy (Raman) and infrared spectroscopy (IR), among which XRPD, TG, DSC, DVS
  • the test method is as described in Example 1.
  • Spectroscope KBr Table 2, Table 3, and overlay (Figs. 13-18) summarize the crystals obtained in Example 1, the crystals obtained in Example 4, the crystals obtained in Comparative Example 1, and the crystals D obtained in Comparative Example 2, The comparison result of the crystal E (Patent Document 1, Application No. CN20108003 1945) described in Example 3. [Table 2] (Where the bold indicates the inch compared with the crystal C
  • the XRPD overlay (Fig. 13A-C) shows that the crystal A is significantly different from the crystal B and the crystal C at 9.2°, 9.6°, 14.9°, 16.0°, etc., and the crystal B is at 9.0°, 10.1°, 16.4°, 23.9°. 27.2° is significantly different from the crystal C peak strength.
  • the TG overlay (Fig. 14) shows: Crystallization A, B, and C all have solvent weight loss.
  • the DSC overlay (Fig. 15) shows that the crystals A, B, and C all have endothermic peaks, and the melting points of crystals A, B, and C are above the decomposition temperature of the drug.
  • the DVS overlay (Fig. 16) shows: The wettability of the three crystal forms is different, among which, the crystallization A has the lowest wettability, and the 80% RH absorbs 2.8%.
  • the crystallization B has a moderate wettability, and the 80% RH absorbs 12.0%.
  • Crystallization C has the highest wettability, and absorbs 15.7% of water at 80% RH.
  • the Raman spectrum overlay (Fig. 17A-C) shows that the crystal A differs from the crystal B and the crystal C at 1579.70 cm - 1539.20 cm" 1 , 1327.07 cm- 1 .
  • IR spectrum (IR) spectrum overlay (Fig. 18A-C): Crystalline A differs from crystal B and crystal C at 3072.05 cm - 1577.49 cm" 1 , 1295.93 cm- 1 .
  • Comparative Example 2. POO disodium salt crystal of the present invention is compared with XRPD of the crystal disclosed in the prior art document. According to the method described in Patent Document 1, Example 1, crystal E is obtained, and crystals A and B and non-patent of the present invention are obtained. The single crystals reported in Document 1 (JACS, Vol. 1 1 1 , 6822-6828) were compared for XRPD. A comparison of these four crystals is shown in Figure 20.
  • the crystal E was obtained according to the method described in Example 1 of Patent Document 1.
  • the hygroscopicity analysis chart of the crystal E (shown in Fig. 21) was obtained by the DVS test method and conditions used in the foregoing examples, and the hygroscopic property thereof was compared with the crystal A and the crystal B of the present invention (the results are shown in Fig. 22). ).
  • the crystal E has a certain wettability.
  • RH absorbs moisture by 1.8%, absorbs moisture by 13.0% at 65% RH, and absorbs 13.6% at 80% RH.
  • hygroscopicity change is less than 2%, slightly hygroscopic.
  • crystal A has the least wettability, and absorbs about 3.3% at 80% humidity
  • crystal B has a large wettability, and absorbs about 12.0% at 80% humidity
  • crystal E has the highest wettability, and absorbs about 13.6 at 80% humidity. %.
  • Crystalline A The crystallizing property of the crystal of the present invention is superior to that of the prior art crystal E, and the crystal A property is particularly excellent.
  • crystal ruthenium and osmium of the present invention have obvious advantages in crystallinity, stability, hygroscopicity, and processability, and thus have broad application prospects in fields such as industrial, pharmaceutical, and functional foods.

Abstract

提供了吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和结晶B，其制备方法及其应用。该结晶具有低吸湿性和高稳定性，具有优良的使用和储存性能。

Description

吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶
技术领域
本发明涉及吡咯并喹啉醌的二钠盐的新型结晶及其制备方法。 背景技术
吡咯并喹啉醌 (Pyrroloquinoline Quinone, PQQ)是最早从微生物中发现的小分 子化合物， 它是细菌中多种重要酶类的辅基， 在高等真核生物体内也有存在， 并 广泛分布于人体各组织器官。 PQQ是一种无味无嗅的化合物， 其分子式如结构式 I所示：
Figure imgf000002_0001
结构式 I 近年来， 对于 PQQ的研究表明， 它是一种对人体健康非常有利的物质： PQQ 缺乏的小鼠生长缓慢， 生殖能力差， 并且容易产生关节炎症， 可能是体内必需的 维生素之一； 作为一种抗氧化剂， PQQ能够保护肝脏免受 CC14或酒精损伤； 纯 化的 PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成； PQQ保护神经细 胞免受 NMDA毒性影响， 从而防止脑部缺血缺氧， 避免动物模型发生严重的休 克； 此外， PQQ还具有防治心肌缺血， 心肌梗死， 有效地预防和治疗动脉粥样硬 化作用。
目前 PQQ可以通过发酵法和化学合成的方法制备获得。 但由这些方法获得的 PQQ二钠盐结晶晶型不稳定， 极具引湿性， 在常温储存的温度范围内， 湿度变化 幅度大， 固体状态不理想， 从而对 PQQ二钠盐的应用和储存造成了非常不利的影 响。
日本三菱瓦斯化学株式会社已就 PQQ二钠盐的晶体 1(即本专利申请中所述结 晶 E)申请了专利 (专利文献 1，申请号 CN201080031945，申请日 2010年 6月 9日）。 然而经本发明人研究发现， 该晶体吸湿性高， 不利于加工和储存。 因此， 考虑到 PQQ在药学、 保健学、 食品学等多种方面中的应用， 本领域迫 切需要在高纯度状态下获得在具有高稳定性、优异可加工性和可存储性的 PQQ结 晶及其制备方法。 发明内容
本发明的主要目的之一正是为了从结晶度、 稳定性、 吸湿性和 /或加工性等方 面出发， 提供稳定的 PQQ的二钠盐结晶及其制备方法。本发明的发明人通过设计 PQQ二钠盐的结晶化条件， 筛选并获得了适合医药、 食品、 保健等应用的晶型。
在本发明的第一方面中， 提供了一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A， 所述结晶 A 用 Cu-Κα射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在如下的 2Θ角度有衍射峰 :9.6±0.2°、 11.6±0.2°、 14.9±0.2°、 16.0±0.2°、 18.8±0.2。、 19.4±0.2°、 20.4±0.2°、 21.9±0.2°、 22.7±0.2°、 23.2±0.2°、 25.6±0.2°、 33.7±0.2°、 35.0±0.2°、 35.8±0.2°、 36.7±0.2°、 38.0±0.2°、 38.6±0.2°。
在一些实施方式中， 所述结晶 A用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱 在如下的 2Θ角度有衍射峰: 9.2±0.2。、 9.6±0.2。、 11.6±0.2。、 13.5±0.2。、 14.9 + 0.2°、 16.0±0.2°、 18.2±0.2°、 18.8±0.2。、 19.4±0.2°、 20.4±0.2°、 21.9±0.2°、 22.7 ±0.2。、 23.2±0.2°、 23.8±0.2°、 25.6±0.2°、 26.4±0.2°、 27.3±0.2°、 28.4±0.2°、 30.7±0.2°、 31.7±0.2°、 32.4±0.2°、 33.7±0.2°、 35.0±0.2°、 35.8±0.2°、 36.7±0.2°、 38.0±0.2°、 38.6±0.2°。
在另一些实施方式中， 所述结晶 Α用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图 谱基本上如图 1所示。
在一个优选例中，在 25°C下，所述二钠盐结晶 A 65〜80%RH时的引湿性低于 3%。 在另一个优选例中， 在 25°C下， 所述二钠盐结晶 A在从 65%RH变化到 80%RH 时的引湿性变化小于 1%， 优选小于 0.6%。
在另一个优选例中， 所述二钠盐结晶 A在 30-400°C范围内的热重分析曲线基本上 如图 2所示。
在另一个优选例中， 所述二钠盐结晶 A是二水合物。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶 A在 50-280°C范围内、 以 10°C/min的扫描速 率得到的差示扫描量热分析图谱基本上如图 3所示。 在本发明的第二方面中， 提供了一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B， 所述结晶 B 用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在如下的 2Θ角度有衍射峰： 8.1 ± 0.2°、 9.0± 0.2°、 10.1 ± 0.2。、 13.7± 0.2°、 16.4±0.2°、 17.6± 0.2°、 18.2± 0.2°、 23.9± 0.2°、 25.8 ± 0.2°、 27.2± 0.2°、 31.0± 0.2°、 39.5 ± 0.2°。
在一些实施方式中， 所述结晶 Β用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱 中在如下 2Θ角度的峰强度均小于 600。
在一个优选例中， 所述结晶 Β用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱中 在如下 2Θ角度的峰强度为 (2Θ/峰强度)： 9.0 517、 10.1 366、 16.4 107、 23.9 582、 27.2°/51 1(峰强因实验和样品条件等可存在一定差异， 但该差异范围在本领域普通技 术人员可预期的范围内)。
在 25°C下， 所述二钠盐结晶 B在 65〜80%RH时的引湿性低于或等于 12.0%。 在一个优选例中， 在 25°C下， 所述二钠盐结晶 B在从 65%RH变化到 80%RH时 的引湿性变化小于 1.5%， 优选小于或等于 1.0%。
在另一些实施方式中， 所述结晶 B用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图 谱基本上如图 5所示。
在一个优选例中， 所述二钠盐结晶 Β在 30-400°C范围内的热重分析曲线基本上如 图 6所示。
在另一个优选例中， 所述二钠盐结晶 B是二水合物。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶 B在 50-280°C范围内、 以 10°C/min的扫描速 率得到的差示扫描量热分析图谱基本上如图 7所示。 在本发明的第三方面中， 提供了制备本发明所述的二钠盐结晶 A的方法， 所述制 备方法选自下组：
(A) 混悬结晶法： 在 20°C〜60°C温度范围内， 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌 至平衡得到混悬液， 过滤得到所述二钠盐结晶 A;
(B) 缓慢挥发法： 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、 混匀至溶解， 并在 20°C〜
60°C的条件下将溶剂挥干， 得到所述二钠盐结晶 A;
(C) 反溶剂沉淀结晶法： 在 20〜60°C的温度范围下， 将吡咯并喹啉醌二钠盐溶解 在高溶解度溶剂中， 在所得体系中加入低溶解度反溶剂以析出所述二钠盐结晶 A， 其中， 25°C下，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述高溶解度溶剂中的溶解度 0.35 g/100g 溶剂， 吡咯并喹啉醌二钠盐在所述低溶解度反溶剂中的溶解度 0.15 g/100g溶剂。
在一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐通过化学合成或发酵生产制备。 在另一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐含或不含结晶。
在另一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐可含或不含杂质， 其纯度为
98%~ 100%， 优选 99%~ 100%。
在另一个优选例中， 在方法 (A)〜 (C)中， 吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂 之间的质量体积比 g/L为 100:1~1:100。 在方法 (A)中， 吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使 用的溶剂之间的质量体积比 g/L为 100:1~1:50， 优选 100:1~1:1。 在方法 (B)中， 吡咯 并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比 g/L为 50:1~1:100， 优选
10:1~1:100。
在另一个优选例中， 方法 (A)〜 (C)在室温〜 55°C， 优选 25〜50°C， 更优选室温、 25°C或 50°C下进行。
在另一个优选例中， 方法 (A)和 (B)中的搅拌时间至少为 2小时， 优选 2小时〜 10 天， 更优选 2小时〜 7天。
在另一个优选例中， 方法 (B)中的挥发时间至少为 2小时， 优选 2小时〜 14天， 更 优选 2小时〜 10天； 所述挥发可在真空条件下进行。
在另一个优选例中， 由高效液相色谱法测定通过方法 (A)〜(C)中任一种所述方法 获得的 PQQ二钠盐的纯度高于 99.0%， 优选高于 99.5%， 更优选高于 99.8%。
在一些实施方式中， 所述方法 (A)、 （B)和 (C)中所用的溶剂分别选自下组， 其中的 比例为体积比：
方法 (A): 乙腈、 甲醇、 乙醇、 水、 乙垸、 庚垸、 甲醇:水、 乙醇:水、 丙酮:水、 乙 腈:水、 四氢呋喃:水、 甲醇:己垸、 乙醇:己垸、 乙腈:己垸、 四氢呋喃:己垸、 甲醇:甲基 叔丁基醚、 乙醇:甲基叔丁基醚、 甲醇:甲苯、 乙醇:甲苯、 乙腈:甲苯、 甲醇:甲基异丁 基酮、 甲苯:乙垸， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5:1~1:5， 优选 2:1~1:2， 更优 选 1:1;
方法 (B): 甲醇:水、 乙醇:水、 异丙醇：水、 丙酮:水、 乙腈:水、 四氢呋喃:水， 其中 各混合溶剂中各溶剂的体积比为 10:1~1:10， 优选 5:1~1:5；
方法 (C)中的高溶解度溶剂为水， 低溶解度反溶剂选自： 甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙 酮、 乙腈和四氢呋喃。
在一个优选例中， 在 25°C下进行方法 (A)时的溶剂选自下组： 乙腈、 甲醇、 乙醇、 水、 甲醇:水、 乙醇:水、 丙酮:水、 乙腈:水、 四氢呋喃:水、 甲醇:己垸、 乙醇:己垸、 乙 腈:己垸、 四氢呋喃:己垸、 甲醇:甲基叔丁基醚、 乙醇:甲基叔丁基醚、 甲醇:甲苯、 乙 醇:甲苯、 乙腈:甲苯、 甲醇:甲基异丁基酮， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5:1-1:5, 优选 2:1~1:2， 更优选 1:1。
在另一个优选例中，在 50°C下进行方法 (A)时的溶剂选自下组： 乙腈、 甲醇、乙醇、 乙垸、 庚垸、 甲醇:水、 乙醇:水、 乙腈:水、 四氢呋喃:水、 甲醇:己垸、 乙醇:己垸、 乙 腈:己垸、 甲苯:己垸、 甲醇:甲基叔丁基醚、 乙醇:甲基叔丁基醚、 甲醇:甲苯、 乙醇:甲 苯、 乙腈:甲苯、 甲醇:甲基异丁基酮， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5:1~1:5， 优选 2:1~1:2， 更优选 1:1。
在另一个优选例中， 在 25°C下进行方法 (B)时所用溶剂选自下组： 甲醇:水 (1:2〜 1:6)、 乙醇:水 (1:2〜1:6)、 异丙醇：水 (1:2)、 丙酮:水 (2:9〜1:4)、 乙腈:水 (2:5〜1:4)、 四 氢呋喃：水 (2:5〜1:4)。
在另一个优选例中， 在 50°C下进行方法 (B)时的溶剂选自下组： 甲醇:水 (1:6)、 乙 醇:水 (1:2)、 异丙醇：水 (1:2)、 丙酮:水 (2:9)、 乙腈:水 (2:5〜1:4)、 四氢呋喃:水 (2:5)。 在本发明的第四方面中， 提供了制备本发明所述的二钠盐结晶 B的方法， 所述制 备方法选自下组：
(Α') 混悬结晶法： 在 20°C〜60°C温度范围内， 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌 至平衡得到混悬液， 过滤得到所述二钠盐结晶 B; 或
(Β') 缓慢挥发法： 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、 混匀至溶解， 并在 20°C〜 60°C的条件下将溶剂挥干， 得到所述二钠盐结晶 B。
在一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐通过化学合成或发酵生产制备。
在另一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐含或不含结晶。
在另一个优选例中， 所述吡咯并喹啉醌二钠盐可含或不含杂质， 其纯度为
98%~100%， 优选 98%~100%。
在另一个优选例中， 在方法 (Α')〜 (Β')中， 吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂 之间的质量体积比 g/L为 100:1~1:100。 在方法 (Α')中， 吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使 用的溶剂之间的质量体积比 g/L为 100:1~1:50， 优选 100:1~1:1。 在方法 (Β')中， 吡咯 并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比 g/L为 50:1~1:100， 优选
10:1~1:100。
在另一个优选例中， 方法 (Α')〜 (Β')在室温〜 55°C， 优选 25〜50°C， 更优选室温、 25°C或 50°C下进行。
在另一个优选例中， 方法 (Α')中的搅拌时间至少为 2小时， 优选 2小时〜 10天， 更优选 2小时〜 7天。 在另一个优选例中， 方法 (Β')中的挥发时间至少为 2小时， 优选 2小时〜 14天， 更优选 2小时〜 10天； 所述挥发可在真空条件下进行。
在一些实施方式中， 所述方法 (Α')和 (Β')中所用的溶剂分别选自下组， 其中的比例 为体积比：
方法 (Α'): 丙酮、 异丙醇、 异戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 己垸、 庚垸、 甲基叔 丁基醚、 甲基异丁基酮、 二氯甲垸、 氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、 硝基甲垸、 乙醚、 甲乙 酮、 丙酮:乙垸、 甲乙酮:乙垸、 硝基甲垸:乙垸、 乙酸乙酯:乙垸、 甲基叔丁基醚:乙垸、 甲苯:乙垸、 丙酮:甲基叔丁基醚、 甲乙酮：甲基叔丁基醚、 乙腈:甲基叔丁基醚、 四氢呋 喃:甲基叔丁基醚、 硝基甲垸:甲基叔丁基醚、 乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、 丙酮:甲苯、 甲 乙酮:甲苯、 四氢呋喃:甲苯、 硝基甲垸:甲苯、 乙酸乙酯:甲苯、 丙酮:甲基异丁基酮、 甲乙酮：甲基异丁基酮、 乙腈:甲基异丁基酮、 四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲垸:甲基 异丁基酮、 乙酸乙酯:甲基异丁基酮、 甲基叔丁基醚：甲基异丁基酮、 甲苯:甲基异丁基 酮、 四氢呋喃:乙垸， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5: 1~1 :5， 优选 2: 1~1 :2， 更 优选 1 : 1 ;
方法 (Β'): 异丙醇：水、 四氢呋喃:水， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为
10: 1-1 : 10, 优选 5: 1 :5， 更优选 4: 1 :4。
在一个优选例中， 在 25°C下进行方法 (Α')时的溶剂选自下组： 丙酮、 异丙醇、 异 戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 己垸、 庚垸、 甲基叔丁基醚、 甲基异丁基酮、 二氯甲 垸、 氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、 硝基甲垸、 乙醚、 甲乙酮、 丙酮:乙垸、 甲乙酮:乙垸、 硝基甲垸:乙垸、 乙酸乙酯:乙垸、 甲基叔丁基醚:乙垸、 甲苯:乙垸、 丙酮:甲基叔丁基 醚、 甲乙酮：甲基叔丁基醚、 乙腈:甲基叔丁基醚、 四氢呋喃:甲基叔丁基醚、 硝基甲垸: 甲基叔丁基醚、 乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、 丙酮:甲苯、 甲乙酮:甲苯、 四氢呋喃:甲苯、 硝基甲垸:甲苯、 乙酸乙酯:甲苯、 丙酮:甲基异丁基酮、 甲乙酮：甲基异丁基酮、 乙腈： 甲基异丁基酮、 四氢呋喃:甲基异丁基酮、 硝基甲垸:甲基异丁基酮、 乙酸乙酯:甲基异 丁基酮、 甲基叔丁基醚：甲基异丁基酮、 甲苯:甲基异丁基酮， 其中各混合溶剂中各溶 剂的体积比为 5: 1~1 :5， 优选 2: 1~1 :2， 更优选 1 : 1。
在另一个优选例中， 在 50°C下进行方法 (Α')时的溶剂选自下组： 丙酮、 异丙醇、 异戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 甲基叔丁基醚、 甲基异丁基酮、 二氯甲垸、 氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、 硝基甲垸、 乙醚、 甲乙酮、 丙酮:乙垸、 甲乙酮:乙垸、 四氢呋喃:乙 垸、 硝基甲垸:乙垸、 乙酸乙酯:乙垸、 甲基叔丁基醚:乙垸、 丙酮:甲基叔丁基醚、 甲乙 酮:甲基叔丁基醚、 四氢呋喃:甲基叔丁基醚、硝基甲垸:甲基叔丁基醚、 乙酸乙酯:甲基 叔丁基醚、 丙酮:甲苯、 甲乙酮:甲苯、 四氢呋喃:甲苯、 硝基甲垸:甲苯、 乙酸乙酯:甲 苯、 丙酮:甲基异丁基酮、 甲乙酮：甲基异丁基酮、 乙腈:甲基异丁基酮、 四氢呋喃:甲基 异丁基酮、 硝基甲垸:甲基异丁基酮、 乙酸乙酯:甲基异丁基酮、 甲基叔丁基醚:甲基异 丁基酮、 甲苯:甲基异丁基酮， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5: 1~1 :5， 优选 2: 1-1 :2, 更优选 1 : 1。
在另一个优选例中， 在 25°C下进行方法 (Β')时所用溶剂为异丙醇：水 (1 :4)。
在另一个优选例中， 在 50°C下进行方法 (Β')时的溶剂选自下组： 四氢呋喃:水 (1 :4)。 在另一个优选例中， 由高效液相色谱法测定通过方法 (Α')〜(Β')中任一种所述方法 获得的 PQQ二钠盐的纯度高于 98.0%， 优选高于 99%， 更优选高于 99.5%。 在本发明的第五方面中， 提供了一种组合物或包装品， 其包含：
(I) 本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 Α、本发明所述的吡咯并喹啉醌的二 钠盐结晶 Β、 通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 Α和 /或通过 本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B;
(II) 药学上、 生理学上或制剂学上可接受的载体和 /或辅料。
在一些实施方式中， 所述组合物或包装品选自下组： 药物组合物、 功能性食品、 词料、 添加剂、 微生物生长抑制剂和防腐剂。
在一个优选例中， 所述二钠盐结晶的加入量为所述组合物重量的 0.001 wt%至 99.99 wt%， 优选 0.01 \¥【％至 99.0 wt%， 更优选 0.1 \¥【％至 90 wt%。
在另一优选例中， 所述二钠盐结晶在组合物或包装品中的形式选自： 粉末、 颗粒、 或微丸， 优选粉末形式。
在另一个优选例中， 所述组合物或包装品用于选自下组的一种或多种用途： 促生 长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障形成、 抗癌、 促进神经再生、 防治 心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 预防 /缓解或治疗老年痴呆、 抑制微生物生长、 延长食 物保存时间。
在另一个优选例中， 所述组合物或包装品还可包含具有选自下组的活性的一种或 多种其它活性物质： 促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障形成、 抗 癌、 促进神经再生、 防治心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 预防 /缓解或治疗老年痴呆、 抑制微生物生长或延长食物保存时间。 在本发明的第六方面中， 提供了本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A、 本 发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B、通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉 醌的二钠盐结晶 A和 /或通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B 的用途， 其用于制备用于预防、 缓解或治疗选自下组的疾病或症状的药物组合物或功 能性食品： 促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障形成、 抗癌、 促进 神经再生、 防治心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 老年痴呆、 微生物感染。
在另一个优选例中， 所述药物组合物或功能性食品还可包含具有选自下组的活性 的一种或多种其它活性物质： 促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障 形成、 抗癌、 促进神经再生、 防治心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 预防 /缓解或治疗老 年痴呆、 抑制微生物生长或延长食物保存时间。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 并且， 本领域普通技术人员可对本文中所述的各种特征和方面进行有效的组 合， 这些组合仍然在本申请所要求保护的范围之内。 附图说明
图 1 : 实施例 1中得到的结晶 A的 X-射线粉末衍射 (XRPD)图；
图 2: 实施例 1中得到的结晶 A的热失重分析 (TG)图；
图 3: 实施例 1中得到的结晶 A的差示扫描量热分析 (DSC)图；
图 4: 实施例 1中得到的结晶 A的吸湿性分析 (DVS)图；
图 5: 实施例 4中得到的结晶 B的 X-射线粉末衍射 (XRPD)图；
图 6: 实施例 4中得到的结晶 B的热失重分析 (TG)图；
图 7: 实施例 4中得到的结晶 B的差示扫描量热分析 (DSC)图；
图 8: 实施例 4中得到的结晶 B的吸湿性分析 (DVS)图；
图 9: 比较实施例 1中得到的结晶 C的 X-射线粉末衍射 (XRPD)图； 图 10: 比较实施例 1中得到的结晶 C的热失重分析 (TG)图；
图 11 : 比较实施例 1中得到的结晶 C的差示扫描量热分析 (DSC)图； 图 12: 比较实施例 1中得到的结晶 C的吸湿性分析 (DVS)图；
图 13A: 结晶 A、 B以及结晶 C的 XRPD谱图叠加比较；
图 13B: 结晶 A、 B以及结晶 C的 XRPD谱图叠加放大比较 1 ;
图 13C: 结晶 A、 B以及结晶 C的 XRPD谱图叠加放大比较 2;
图 14: 结晶 A、 B以及结晶 C的 TG谱图叠加比较； 图 15: 结晶 A、 B以及结晶 C的 DSC谱图叠加比较；
图 16: 结晶 A、 B以及结晶 C的 DVS谱图叠加比较；
图 17A: 结晶 A、 B以及结晶 C的拉曼光谱 (Raman)谱图叠加比较；
图 17B: 结晶 A、 B以及结晶 C的 Raman谱图叠加放大比较 1;
图 17C: 结晶 A、 B以及结晶 C的 Raman谱图叠加放大比较 2;
图 18A: 结晶 A、 B以及结晶 C的红外光谱 (IR)谱图叠加比较；
图 18B: 结晶 A、 B以及结晶 C的 IR谱图叠加放大比较 1;
图 18C: 结晶 A、 B以及结晶 C的 IR谱图叠加放大比较 2;
图 19: 结晶 A、 B、 结晶 C与结晶 D(JACS， Journal of the American Chemical Society, 1989年 8月， 111卷， 17期， 6822-6828中显示为单晶的 PQQ钠盐结晶) 的 XRPD谱图叠加比较；
图 20: 结晶 A、 B、 结晶 E与结晶 D的 XRPD谱图叠加比较；
图 21: 结晶 E的吸湿性分析 (DVS)图；
图 22: 结晶 A、 B以及结晶 E的 DVS谱图叠加比较。 具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究制得了 PQQ二钠盐晶体 A和 B， 并出乎意料 地发现该晶体具有纯度高、 吸湿度低、 稳定性佳等优良特性， 其存放和使用均较 已知的 PQQ二钠盐固体更为方便， 特别适合用作制备包含 PQQ二钠盐的组合物 或包装物。 在此基础上， 发明人完成了本发明。
POO二钠盐晶体的制备
如本文所用， 术语 "晶体"具有本领域中常规知晓的含义， 即由结晶物质构成 的、 其内部的构造质点 (如原子、 分子)呈平移周期性规律排列的固体。
如本文所用， 术语 "吡咯并喹啉醌"与 "PQQ"可互换使用， 均是指结构式如 上文结构式 I所示的化合物。 作为获得本发明晶体 A和晶体 B的原料化合物， 所 使用的 PQQ二钠盐可以本领域中常规方法获得， 例如通过发酵法 (例如， 专利文 献 CN 101228963 B)和有机化学合成法 (J. Am. Chem. Soc, 1981, 103，5599〜5600) 等制备。 原料中使用的 PQQ二钠盐可以是结晶也可以是非晶质的。 此外， 所用原 料也可以含有杂质。
在结晶制备前， 可通过常规方法测定 PQQ二钠盐在不同溶剂中的溶解度， 并 随后选用适当的溶剂制备本发明的结晶。例如， 可采用如下方法测定 PQQ二钠盐 在多种溶剂中的溶解度：
(1)取大约 25mg PQQ二钠盐，分别在 25 °C和 50 °C条件下与 1 ml溶剂搅拌平衡 至少 24 h， 随后， 分别过滤溶液， 液体部分在真空中将溶剂挥干。 利用重量分析 法测定原料药在溶剂中的近似溶解度。
重量分析法： 准确取一定体积 (一般为 0.5mL)的滤液放入干燥且已称好重量的 容器中， 记为 M s， 随即称量容器加滤液的总重量， 记为 Mo， 则滤液重量为 Mo-M 空。 于真空中挥干溶剂后再准确称量其总重量 (记为 则析出的固体质量为 Mi M s， 溶剂的质量为 Mo 据此原料在该溶剂中的近似溶解度为：
X(g)=[( M M空) /( Mo-M ] X 100(g)
【表 1】 PQQ二钠盐在各种溶剂中的溶解度
Figure imgf000011_0001
乙腈:甲基叔丁基醚 π: ) 0.10 0.04
乙腈： 甲基叔丁基醚 (hi) 0.03 0.02
乙腈：甲苯（1:1) 0.04 0.00
乙腈:甲基异丁基甲酮 Π:】） 0.09 0.04
POO二钠盐结晶 Α的制备
PQQ二钠盐结晶 A可通过方法 (A)混悬结晶法、 方法 (B)缓慢挥发法或方法 (C) 反溶剂沉淀结晶法制得。
方法 (A)混悬结晶法、方法 (B)缓慢挥发法或方法 (C)反溶剂沉淀结晶法的示例如 下。 本领域普通技术人员可根据常识对这些方法中的条件进行调整：
方法 (A): 25°C和 50°C混悬结晶法： 将 PQQ二钠盐在 25°C和 50°C条件下与溶 剂搅拌平衡至少 24h， 过滤得到结晶。 方法 (B)缓慢挥发法： 将 PQQ二钠盐与溶剂 搅拌、 混匀、 溶解， 并在 25°C和 50°C条件下将溶剂挥干得到结晶。 方法 (C)反溶 剂沉淀结晶法： 根据上述 (1)测得近似溶解度， 取两种在室温条件下溶解度相差很 大的溶剂作为一组相结合。 取大约 5-200mg PQQ二钠盐溶解在 0.5~5ml溶解度很 高的溶剂中， 随后， 加入 4-20ml对 PQQ二钠盐高度不溶的溶剂 (反溶剂)， 析出沉 淀， 获得结晶。
在 25°C进行方法 (A)操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 乙腈、 甲醇、 乙醇、 水、 甲醇： 水 （1:1)、 乙醇： 水 （1:1)、 丙酮： 水（1:1)、 乙腈： 水 （1:1) 、 四氢呋喃： 水 （1:1) 、 甲醇： 己垸 (1:1) 、 乙醇： 己垸 （1:1) 、 乙腈 ： 己垸 (1:1) 、 四氢呋喃： 己垸 (1:1) 、 甲醇： 甲基叔丁基醚 (1:1) 、 乙醇： 甲基叔丁基醚 (1:1) 、 甲醇： 甲苯 （1:1) 、 乙醇 ： 甲苯 (1:1) 、 乙腈： 甲苯 (1:1) 、 甲醇： 甲基异丁基酮
(1:1)；
在 50°C进行方法 (A)操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 乙腈、 甲醇、 乙醇、 乙垸、 庚垸、 甲醇:水 （1:1)、 乙醇:水 （1:1)、 乙腈:水 （1:1) 、 四氢呋喃： 水 (1:1) 、 甲醇:己垸 (1:1) 、 乙醇:己垸 (1:1) 、 乙腈 ：己垸 (1:1) 、 甲苯:己垸 (1:1)、 甲醇： 甲基叔丁基醚 (1:1) 、 乙醇： 甲基叔丁基醚 (1:1) 、 甲醇:甲苯 （1:1) 、 乙醇 ： 甲苯 (1:1) 、 乙腈:甲苯 (1:1) 、 甲醇:甲基异丁基酮 (1:1)。 其中原料与溶剂的质量体 积比 (g/L) 为 100:1〜1:1。
方法 (A)中所述在 25 °C和 50°C条件下的搅拌平衡时， 优选根据需要进行搅拌， 然后在真空条件下挥干溶剂， 搅拌时间优选 2h~7d。
在 25°C进行方法 (B)操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 甲醇:水 (1:2; 1:6)、 乙醇:水（1:2; 1:6)、 异丙醇：水（1:2)、 丙酮:水 (2:9; 1:4)、 乙腈:水 (2:5; 1:4)、 四氢呋喃:水 (2:5; 1:4)； 若列举 (3)50°C缓慢挥发法中使用溶剂的例子、 包括甲醇: 水 (1:6)、 乙醇:水 (1:2)、 异丙醇：水 (1:2)、 丙酮:水 (2:9)、 乙腈:水 (2:5; 1:4)、 四氢呋 喃:水 (2:5)。 其中原料与溶剂的质量体积比 (g/L)为 10:1~1:100。
方法 (B)中所述的搅拌平衡， 优选根据需要进行搅拌， 然后在 25°C和 50°C条件 下挥干溶剂， 挥干时间优选 2h~10d。
方法 (C)反溶剂沉淀结晶法中所述两种在室温条件下溶解度相差很大的溶剂组 合 (溶剂 /反溶剂)， 包括水 /甲醇， 水 /乙醇， 水 /异丙醇， 水 /丙酮， 水 /乙腈， 水 /四 氢呋喃， 等。 其中原料与溶剂的质量体积比 (g/L)为 10:1〜1:100。
方法 (C)中所述的加入反溶剂后析出沉淀的时间， 设为 2h~2d。
通过本发明方法 (A)、（B)或 (C)可获得极高纯度的结晶 A， 由高效液相色谱法确 定其纯度可大于 99.8%。
POO二钠盐结晶 B的制备
PQQ二钠盐结晶 B可通过方法 (Α')混悬结晶法或方法 (Β')缓慢挥发法制得。 例 如， 可通过在 25°C和 50°C进行方法 (Α')或 (Β')来制备结晶 Β。本领域普通技术人员 可根据常识对这些方法中的条件进行调整：
在 25°C进行方法 (Α')操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 丙酮、 异丙 醇、 异戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 己垸、 庚垸、 甲基叔丁基醚、 甲基异丁基 酮、二氯甲垸、氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、硝基甲垸、 乙醚、 甲乙酮、丙酮:乙垸 (1:1)、 甲乙酮：乙垸 (1:1)、 硝基甲垸:乙垸 (1:1)、 乙酸乙酯:乙垸 (1:1)、 甲基叔丁基醚：乙垸 (1:1)、 甲苯:乙垸 (1:1)、 丙酮:甲基叔丁基醚 (1:1)、 甲乙酮:甲基叔丁基醚 (1:1)、 乙 腈:甲基叔丁基醚 (1:1)、 四氢呋喃:甲基叔丁基醚 (1:1)、 硝基甲垸:甲基叔丁基醚 (1:1), 乙酸乙酯:甲基叔丁基醚 (1:1)、 丙酮:甲苯 (1:1)、 甲乙酮：甲苯 (1:1)、 四氢呋 喃:甲苯 (1:1)、 硝基甲垸:甲苯 (1:1)、 乙酸乙酯:甲苯 (1:1)、 丙酮:甲基异丁基酮 (1:1)、 甲乙酮:甲基异丁基酮 (1:1)、 乙腈:甲基异丁基酮 (1:1)、 四氢呋喃:甲基异丁基酮 (1:1)、硝基甲垸:甲基异丁基酮 (1:1)、 乙酸乙酯:甲基异丁基酮 (1:1)、 甲基叔丁基醚: 甲基异丁基酮 (1:1)、 甲苯:甲基异丁基酮 (1:1)。
在 50°C进行方法 (Α')操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 丙酮、 异丙 醇、 异戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 甲基叔丁基醚、 甲基异丁基酮、 二氯甲垸、 氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、 硝基甲垸、 乙醚、 甲乙酮、 丙酮:乙垸 (1:1)、 甲乙酮：乙垸 (1:1)、 四氢呋喃:乙垸 (1:1)、 硝基甲垸:乙垸 (1:1)、 乙酸乙酯:乙垸 (1:1)、 甲基叔丁 基醚:乙垸 (1:1)、 丙酮:甲基叔丁基醚 (1:1)、 甲乙酮:甲基叔丁基醚 (1:1)、 四氢呋喃: 甲基叔丁基醚 (1:1)、 硝基甲垸:甲基叔丁基醚 (1:1)、 乙酸乙酯:甲基叔丁基醚 (1:1)、 丙酮:甲苯 (1:1)、 甲乙酮：甲苯 (1:1)、 四氢呋喃:甲苯 (1:1)、 硝基甲垸:甲苯 (1:1)、 乙 酸乙酯：甲苯 (1:1)、 丙酮:甲基异丁基酮 (1:1)、 甲乙酮:甲基异丁基酮 (1:1)、 乙腈:甲 基异丁基酮 (1:1)、 四氢呋喃:甲基异丁基酮 (1:1)、 硝基甲垸:甲基异丁基酮 (1:1)、 乙 酸乙酯:甲基异丁基酮 (1:1)、 甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮 (1:1)、 甲苯:甲基异丁基 酮 (1:1)。 其中原料与溶剂的质量体积比 (g/L)为 100:1~1:1。
结晶 B用方法 (Α')制备， 在 25°C和 50°C条件下的搅拌平衡时， 优选根据需要 进行搅拌， 然后在真空条件下挥干溶剂， 搅拌时间优选 2h~7d。
在 25°C进行方法 (Β')操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 异丙醇： 水 (1:4)等； 在 50°C进行方法 (Β')操作中可使用的溶剂的例子， 包括但不限于： 四氢 呋喃： 水 (1:4)。 其中原料与溶剂的质量体积比 (g/L)为 10:1~1:100。
方法 (Β')操作中搅拌平衡时， 优选根据需要进行搅拌， 然后在 25°C和 50°C条件 下挥干溶剂， 挥干时间优选 2h~10d。
POO二钠盐晶体的鉴定和性质
本发明人在获得 PQQ二钠盐晶体后进一步采用多种方式和仪器对其性质进行 了研究。
"X射线粉末衍射" ， 又称 "X射线多晶衍射 (XRD或 SRPD)" 是目前用于测 定晶体构造 (即晶型)的常用试验方法。 采用 X射线粉末衍射仪， 在 X射线透过晶 体时产生一系列衍射图谱， 该图谱中不同的衍射线及其强度由一定结构的原子团 所决定， 由此确定晶体的具体晶型结构。
本发明的 PQQ二钠盐晶体具有特定的晶体形态， 其在 X射线衍射图谱中具有 特定的特征峰。
结晶 A用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在约如下的 2Θ角度有 衍射峰： 9.2。、 9.6。、 11.6。、 13.5。、 14.9。、 16.0。、 18.2。、 18.8。、 19.4。、 20.4。、 21.9。、 22.7。、 23.2。、 23.8。、 25.6。、 26.4。、 27.3。、 28.4。、 30.7。、 31.7。、 32.4。、 33.7。、 35.0。、 35.8。、 36.7。、 38.0。、 38.6。 (均为 ±0.2。）的 PQQ二钠盐结晶。
结晶 Β用 Cu-K α射线衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在约如下的 2Θ角度有 衍射峰: 8.1°、 9.0°、 10.1。、 13.7。、 16.4。、 17.6。、 18.2。、 23.9。、 25.8。、 27.2。、 31.0。、 39.5° (均为 ± 0.2°)的 PQQ二钠盐结晶。
以上 X射线粉末衍射的衍射角 2Θ的测定， 在以下的测定条件进行。
仪器型号： Bruker D8 advance
靶： Cu-K a(40kV， 40mA)
样品到检测器距离： 30 cm
扫描范围： 3。-40。(2θ值)
扫描步径： 0.1 s
应理解， 以上峰值也可以由其它安装有单色器的一般的 X射线粉末衍射仪器 观测到。 此外， 上述对于本发明中规定的结晶形状可能含有测定误差， 因此， 峰 值只要在测定误差范围内， 即认为合理。
也可采用差示量热扫描分析 (DSC )、 热重分析 CTG )、 红外扫描 (IR)等常规方法 对本发明的晶体进行表征和研究。
经研究， 本发明的晶体 Α和晶体 Β可以是含水物 (如二水合物)， 其熔点在其分 解温度以上， 只要具有上述 X射线粉末衍射的衍射角 2Θ的测定峰即可。 与已知结晶相比， 本发明的晶体 A和晶体 B具有显著降低的吸湿性， 使得本 发明的晶体在应用和储存中不易吸湿形成诸如团块等不良形态， 从而具有良好的 稳定性和可加工性。 本发明晶体的应用
根据本领域中的现有常识， PQQ具有促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾 病、 减少白内障形成、 抗癌、 促进神经再生、 防治心梗和动脉粥样硬化的药理作 用， 同时， PQQ还可抑制食品中微生物生长， 可以延长食物的保存时间。
因此， 本发明的 PQQ结晶 A和结晶 B能够与 "药学上或生理学上或制剂学上 可接受的载体 " 组合使用， 作为多种组合物的有效成分， 通过口服、 喷涂、 鼻腔 内、 或透皮等途径给予所需的对象。
本发明的组合物中 PQQ二钠盐晶体 A和 /或 B有效成分占组合物总重量的 0.001〜99.9wt%； 优选为组合物总重量的 l〜95wt%， 较优选为 5〜90wt%， 更优 选 10〜80wt%。 余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
如本文所用， 术语"药学上或生理学上或制剂学上可接受的载体"指用于保健 品或药物制剂的载体， 包括各种赋形剂和稀释剂， 它们本身并不是必要的活性成 分， 且施用后没有或没有过分的毒性。 合适的载体是本领域普通技术人员所熟知 的。 例如， 药学上可接受的载体详细记载于 《雷明顿药物科学》 （Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co.， N.J. 1991)。
在组合物中可接受的载体可含有液体， 如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 这些 载体中还可能存在辅助性的物质， 如填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 助流剂、 泡腾剂、 润湿剂或乳化剂、 矫味剂、 pH缓冲物质等。 通常， 可将这些物质配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳地， pH 约为 6-8。 本发明的组合物可选自： 药物组合物、 功能性食品、 词料、 添加剂、 微 生物生长抑制剂和防腐剂。
另外， PQQ结晶 A或结晶 B能够单独或与其它材料组合使用， 所述其它材料 包括但不限于： 维生素类、 氨基酸类、 类胡萝卜素类、 ω3脂肪酸类、 ω6脂肪酸 类、 虾青素等。
可将本发明的结晶或组合物按照具体需要制成包装品， 例如药盒、 功能性食品 套盒等， 其中可包含： 本发明的 PQQ二钠盐晶体； 任选的， 其它活性物质、 指导 用户或医师使用该药盒的说明书、 容器、 赋形剂等， 本领域技术人员可根据具体 需要来确定其中的任选组分。
本发明的组合物或包装品还可包含具有选自下组的活性的一种或多种其它活性物 质： 促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障形成、 抗癌、 促进神经再 生、 防治心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 预防 /缓解或治疗老年痴呆、 抑制微生物生长 或延长食物保存时间。 这些其它活性物质包括但不限于： 维生素类、 氨基酸类、 类 胡萝卜素类、 ω3脂肪酸类、 ω6脂肪酸类、 虾青素等。 本发明的优点
本发明的优点主要在于：
1. 本发明中提供了 PQQ二钠盐的两种新晶型， 即结晶 Α和结晶 Β ;
2. 本发明的结晶 A、 B在结晶度、 稳定性、 吸湿性以及可加工性方面与已知 PQQ二钠盐晶体或固体相比具有明显的优越性， 因此在工业、 医药和功能性食品 等领域具有广泛的应用前景。 实施例
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。 本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、 变动， 这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 可采用本领域中的常规方法， 例如 参考 《晶型药物》 （吕扬、 杜冠华主编， 人民卫生出版社， 2009年)或按照供应商 所建议的条件， 也可由商业公司提供测试。 以下实施例中所有试剂都可来源于市 售。
除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 除非另行定义， 文中所使用的 所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外， 任何与所记载 内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。 文中所述的较佳实施方 法与材料仅作示范之用。 参考例 . POO二钠盐的制备
通过如下操作得到 PQQ二钠盐：
在 Corey等人 1981年报道的化学合成文献 (J. Am. Chem. Soc, 1981,
103，5599〜5600)的基础上， 对合成工艺路线和条件进行优化改进， 经九步反应得 到 PQQ二钠盐。
与 Corey的文献相比， 本发明所用方法优化改进之处主要在于： 1)将催化氢化 反应文献用的催化剂贵金属铂改为钯； 2)将文献中重氮化偶联反应中的偶联试剂 2-甲基乙酰乙酸甲酯改为 2-甲基乙酰乙酸乙酯； 3)将文献中酯水解反应先与原甲 酸酯反应得到单缩酮再在碱性条件下水解得到最终产物， 改进为直接在碱性条件 下水解后调 pH得到产物。
具体合成过程如下：
(1) 甲酰化反应：原料 2-甲氧基 -5-硝基苯胺在甲酸和乙酸酐作用下氨基被甲酰 化保护得到 N-(2-甲氧基 -5-硝基苯基)甲酰胺；
(2) 催化氢化反应： 氨基被甲酰化保护后的化合物在乙醇作溶剂， 钯 /炭作催化 剂的条件下， 芳环硝基被还原为氨基得到 N-(5-氨基 -2-甲氧基苯基)甲酰胺；
(3) 重氮化偶联反应： 在亚硝酸钠作用下氨基重氮化后形成氟硼酸重氮盐， 氟 硼酸重氮盐直接与 2-甲基乙酰乙酸乙酯偶联得到 2- {[(3-甲酰胺基 -4-甲氧基)芳基] 亚肼基 丙酸乙酯；
(4) 成吡咯环反应： 前一步产物在甲酸作用下形成吡咯环得到 6-甲酰氨基 -5- 甲氧基 -1氢 -吲哚 -2-羧酸乙酯； (5) 甲酰胺水解反应： 将第一步保护的甲酰胺基在酸性条件下酰胺键打开游离 出氨基得到 6-氨基 -5-甲氧基 -1氢 -吲哚 -2-羧酸乙酯；
(6) 成环反应： 前一步游离出氨基的产物和 2-氧代戊烯二酸二甲酯反应成环得 到 9-羟基 -5-甲氧基 -6，7，8，9-四氢 - 1氢 -吡咯 [2，3-f]喹啉 -2，7，9-三羧酸 -2-乙酯 -7,9-二 甲酯；
(7) 喹啉环的形成： 前一步产物在醋酸铜和酸性条件下形成喹啉环得到 5-甲氧 基 -1氢 -吡咯 [2，3-f]喹啉 -2，7，9-三羧酸 -2-乙酯 -7,9-二甲酯；
(8) 氧化反应： 前一步产物在氧化剂作用下形成醌环得到 4，5-二氧 -4,5-二氢化 -1氢 -吡咯 [2，3-f]喹啉 -2，7，9-三羧酸 -2-乙酯 -7,9-二甲酯；
(9) 酯水解反应： PQQ酯在碱性条件下三个酯基水解， 水解完成后用 6mol/L 的盐酸将溶液 pH调到 3.0， 保持 3小时后分离出固体即为 PQQ二钠盐。
所得 PQQ二钠盐原料即为结晶 C。
所得 PQQ二钠盐用高效液相色谱法在如下所示条件下可测得纯度大于 99.0%: 仪器型号： UlTiMate3000， 美国戴安
色谱柱： YMC-C 18 250 X 4.6mm I.D.
流动相： 乙腈： lOOmM磷酸二氢钾 =12 : 88， 用磷酸调整 pH为 2.0
检测波长： 249nm
柱温： 35 °C
流速： 1.0 ml/min
进样量： ΙΟμΙ 实施例 1. 用混悬结晶法制备 ΡΟΟ二钠盐结晶 Α及所得结晶的性质研究
取按如上参考例方法制备的 l Omg PQQ二钠盐 (纯度≥98， 也可采用市购 sigma 公司 PQQ二钠盐， 货号： 80198- 10MG-F), 在 25 °C和 50°C条件下与 lmL乙腈搅 拌平衡 5d， 随后分别过滤溶液， 固体部分在空气中干燥 10min， 得到 PQQ二钠盐 结晶 A。
对所得 PQQ二钠盐结晶 A进行 X射线粉末衍射分析 (XRPD， 图 1)、 热重分析 (TG, 图 2)、 差示扫描量热分析 (DSC， 图 3)和吸湿性分析 (DVS， 图 4)
1. X射线粉末衍射谱图
在下面所示的条件下测定所得结晶的 X射线粉末衍射谱图。 在图 1中表示结 果。通过 X射线粉末衍射使用 Cu-Κ α 放射线得到的20的峰在约：9.2°、9.6°、1 1.6°、 13.5。、 14.9。、 16.0。、 18.2。、 18.8。、 19.4。、 20.4。、 21.9。、 22.7。、 23.2。、 23.8。、 25.6。、 26.4°、 27.3°、 28.4°、 30.7°、 31.7°、 32.4°、 33.7°、 35.0°、 35.8°、 36.7°、 38.0°、 38.6。 (均 为 ± 0.2°)。
仪器型号： Bruker D8 advance
靶： Cu-K a(40kV， 40mA)
样品到检测器距离： 30 cm
扫描范围： 3。-40。(2θ值)
扫描步径： 0.1 s
得到的固体是结晶性的。
2. 热重分析
TG (图 2)显示， 结晶 Α在 30~200 °C有 1.33%、 6.02%两个失重 (一个水分子的理 论失重值为 4.6%)， 可能是水合物， 分解峰值温度 312.5 °C。
仪器型号： Netzsch TG 209F3
温度范围： 30-400 °C
扫描速率： l OK/min
吹扫气： 25 mL/min
保护气： 15 mL/min
3. 差示扫描量热分析
对应的 DSC (图 3)在该温度区间 (30~200 °C )有吸热峰出现， 表明该晶体含水。 并且， 在升温范围内没有发现熔融现象， 这表明其熔点可能在药物分解温度以上。
仪器型号： Perkin Elmer DSC 8500
温度范围： 50-280 °C
扫描速率： 10 °C /min
氮气流速： 50ml/min
4. 吸湿性分析
DVS (图 4)显示， 晶体 A在 40%RH吸收水分 1.6%，在 65%RH吸收水分 2.3%， 在 80%RH吸收水分 2.8%。 在常规存储环境中， 40-80RH, 吸湿性变化小于 2%， 仅略有吸湿性。
仪器型号： SMS DVS Intrinsic , 0~95%RH，
温度： 25 实施例 2. 用缓慢挥发法制备 POO二钠盐结晶 A及所得结晶的性质研究 准备 3mg PQQ二钠盐两份 (参考例中所制备)，分别与含 16(^L无水乙醇 +56(^L 水和含 16(^L无水乙醇 +320μ 水的溶剂混匀， 溶解， 分别在 25 °C和 50 °C缓慢挥 发至干， 溶剂挥干后减压干燥得到 PQQ二钠盐结晶 A。
在实施例 1所述条件下检测所得结晶的 X射线粉末衍射谱图， 并进行热重分 析、 差示扫描量热分析和吸湿性分析， 所得结果同实施例 1。 实施例 3. 用反溶剂沉淀结晶法制备 POO二钠盐结晶 A及所得结晶的性质研究 取 l Omg PQQ二钠盐 (参考例中所制备)， 溶解在 2mL水中， 并搅拌平衡。 随后 放入含有 6mL无水乙醇的棕色玻璃瓶中， 12h后将析出沉淀。 对过滤得到的固体 进行加压干燥， 得到 PQQ二钠盐结晶 A。
在实施例 1所述条件下检测所得结晶的 X射线粉末衍射谱图， 并进行热重分 析、 差示扫描量热分析和吸湿性分析， 所得结果同实施例 1。 实施例 4. 用混悬结晶法制备 POO二钠盐结晶 B及所得结晶的性质研究
取 l Omg PQQ二钠盐 (参考例中所制备）， 在 25 °C和 50°C条件下与 l mL乙酸乙 酯搅拌平衡 5d， 随后分别过滤溶液， 固体部分减压干燥得到 PQQ二钠盐结晶 B。
采用实施例 1所示条件， 对所得 PQQ二钠盐结晶 B进行 X射线粉末衍射分析 (X PD , 图 5)、 热重分析 TG， 图 6)、 差示扫描量热分析 (DSC， 图 7)和吸湿性分 析 (DVS， 图 8) :
1. X射线粉末衍射分析
测定所得结晶 B的 X射线粉末衍射谱图。 在图 5中表示结果。 通过 X射线粉 末衍射使用 Cu-Κ α 放射线得到的 2Θ的峰出现 8. 1 °、 9.0°、 10.1 °、 13.7。、 16.4。、 17.6。、 18.2。、 23.9。、 25.8。、 27.2。、 31.0。、 39.5。 (均为 ± 0.2。）。
2. 热重分析
TG (图 6)显示， 结晶 B在 30~200°C有 5.98%、 6.21 %两个失重区间（一个水分子 的理论失重值 4.6%， 一个乙酸乙酯的理论失重值 19. 1%)， 可能是水合物。 分解峰 值温度 303.3 °C。
3. 差示扫描量热分析
对应的 DSC (图 7)在该温度区间有吸热峰出现， 表明该晶体含水。 并且， 在升 温范围内没有发现熔融现象， 这表明晶体 B的熔点可能在药物分解温度以上。 4. 吸湿性分析
DVS (图 8)显示，结晶 B在 40%RH吸收水分 7.3%，在 65%RH吸收水分 1 1.0%， 在 80%RH吸收水分 12.0%。 在相对湿度 20-40范围内， 形成一水合物； 在相对湿 度大于 50范围内， 形成二水合物； 湿度进一步增加， 可形成多水合物。 实施例 5. 用缓慢挥发法制备 POO二钠盐结晶 B及所得结晶的性质研究
准备 3mg PQQ二钠盐两份，一份与含 160μ 异丙醇 +960μ 水溶剂混匀，溶解， 在 25 °C挥发至干； 一份与含 16(^L四氢呋喃 +64(^L水溶剂混匀， 溶解， 在 50 °C 挥发。 溶剂挥干之后减压干燥， 得到 PQQ二钠盐结晶 B。
在实施例 1所述条件下检测所得结晶的 X射线粉末衍射谱图， 并进行热重分 析、 差示扫描量热分析和吸湿性分析， 所得结果同实施例 4。 比较实施例 1. POP二钠盐结晶 C的制备及所得结晶的性质研究
PQQ二钠盐结晶 C的获得方法详见<参考例 >。
采用实施例 1所示条件， 对所得 PQQ二钠盐结晶 C进行 X射线粉末衍射分析 (X PD , 图 9)、 热重分析 (TG， 图 10)、 差示扫描量热分析 (DSC， 图 1 1)和吸湿性 分析 (DVS， 图 12) :
1. X射线粉末衍射谱图
结晶 C的 X射线粉末衍射谱图， 在图 9中表示结果， 通过 X射线粉末衍射使 用 Cu-Κ α 射线得到的 2Θ的峰出现 8.2。、 8.6。、 9.0。、 10.1。、 13.7。、 17.6。、 18.2。、 23. 9。、 26.9。、 27. 3。、 28.3。、 3 1.0。、 3 1.6。、 32.6。、 39.4。、 45.3。（为 ± 0.2。）。
2. 热重分析
TG (图 10)显示， 实验开始阶段就已经有明显失重， 表面水分较多， 另外， 结 晶 C在 30~180 °C有 4.37%、 7.06%两个失重 (一个水分子的理论失重值 4.6%)， 可 能是水合物。
3. 差示扫描量热分析
对应的 DSC (图 1 1)在该温度区间有吸热峰出现， 表明该晶体含水。
4. 吸湿性分析
DVS (图 12)显示， 结晶 C极具引湿性， 在常规储存湿度范围内， 湿度变化幅度 大，在 5- 15%。在 40%RH含水分 7.8%，在 65%RH吸收水分 13.8%，在 80%RH 吸 收水分 15.7%。 初步推断： 在相对湿度 20-40范围内， 形成一水合物； 在相对湿 度大于 50范围内， 形成二水合物； 湿度进一步增加， 可形成多水合物。 比较实施例 2. 单晶数据向 X射线粉末衍射结果转换
将非专利文献 1 (JACS， 1 1 1卷， 6822-6828)中报道的单晶的 X射线接近结构解 析的数据， 对该结晶（结晶 D )引起的 X射线粉末衍射的峰进行模拟。 使用 origin 作图软件， 在图 19中表示结果。 结果表明， 其峰值与本发明的结晶位置不同 (详 见表 2)。 比较实施例 3. 专利文献 1所述结晶
将专利文献 1所述结晶 1 (本发明所述结晶 E ) 的 X射线粉末衍射与本发明结 晶八、 B比较。 结果表明， 其峰值与本发明的结晶位置不同 （详见表 2 ) 。 比较例 1. POO二钠盐结晶 A和 B与结晶 C、 D和 E的比较
通过 XRPD、 TG、 DSC、 DVS、 拉曼光谱 (Raman)和红外光谱 (IR)的方法比较 实施例中所得的三种晶体 (即结晶 A、 B和 C)， 其中 XRPD、 TG、 DSC、 DVS测 试方法如实施例 1所述。
Raman光谱
仪器型号： Thermo DX Raman Microscope
曝光时间 (秒）： 2.0
激光： 780nm
激光功率： 50mW
激光： 25μηι狭缝
I
仪器型号： Nicolet FTIR 6700
解析： 4.000
样品获得： 2.0
光学速度： 0.6329
光圈： 100.00
检测器： DTGS KBr
分光镜： KBr 表 2、表 3和叠加图（图 13- 18)中总结了实施例 1所得结晶 、 实施例 4所得结 晶8、 比较实施例 1所得结晶 、 比较实施例 2所得结晶 D， 比较实施例 3所述 结晶 E (专利文献 1， 申请号 CN20108003 1945)的比较结果。 【表 2】 （其中粗体表示与结晶 C相比的寸
晶型 PQQ二钠盐 PQQ二钠盐 PQQ二钠盐 ¾曰日
结晶 E 名称 结晶 A 结晶 B 结晶 c D
结晶 比较实 专利 实施例 1、 2、 3 实施例 4、 5 比较实施例 1
方法 施例 2 文献 1
2Θ 峰强 2Θ 峰强 2Θ 峰强 2Θ 2Θ
7.2° 166
8.1° 1404 8.2° 1028 7.9°
8.6° 584
9.2° 3520 9.0° 517 9.0° 1 125 9.1。
9.6° 406
10.1。 366 10.1。 1083 10.1。
11.6。 208
550 13.7。 238 13.7。 913
14.9。 798
15.7。
16.0。 1021 16.4。 107
159 284
155 291 728
18.8。 449
19.4。 210
寸寸''
20.4° 573 20.7 121
21.4。
21.9。 595 21.8。 o
22.7° 132 22.4°
23.2。 166 23.2 204 23.3°
23.8。 585 23.9。 582 23.9。 2701 24.0。
24.6。
24.8。
25.6。 192 25.8。 1 16 25.8 162
26.4° 753 26.9。 639 26.3。
26.8。
27.3° 3924 27.2° 51 1 27.3° 1466 27.4°
27.8。
28.4° 1798 28.3° 266
29.2°
29.7°
30.7。 340
31.0。 136 31.0。 351 31.2。 101 31.6。 271
32.4° 207 32.6。 241 32.4°
33.7。 129 33.5。
34.4°
34.8。
35.0。 97 35.0。
35.8。 488 36.0。
36.7。 181
37.8。
38.0。 441
38.6。 277 38.5。
39.5。 98 39.4° 388 39.4° 39.5。
45.3。 156
2. 【表 3】
寸'
Figure imgf000024_0001
3. 各种晶型固体表征的叠加图分析
XRPD叠加图（图 13A-C)显示： 结晶 A在 9.2°、 9.6°、 14.9°、 16.0°等与结晶 B 和结晶 C有明显差别， 结晶 B在 9.0°、 10.1°、 16.4°、 23.9°、 27.2°与结晶 C峰强 有明显差别。
TG叠加图（图 14)显示： 结晶 A、 B、 C均有溶剂失重。
DSC叠加图（图 15)显示： 结晶 A、 B、 C均有吸热峰出现， 结晶 A、 B、 C的 熔点在药物分解温度以上。
DVS叠加图（图 16)显示： 三种晶型的引湿性不同， 其中， 结晶 A的引湿性最 小， 在 80%RH吸收水分 2.8%; 结晶 B引湿性中等， 在 80%RH吸收水分 12.0%; 结晶 C引湿性最大， 在 80%RH吸收水分 15.7%。
拉曼 (Raman)光谱谱图叠加（图 17A-C)结果显示： 结晶 A在 1579.70 cm— 1539.20 cm"1 , 1327.07 cm— 1等处与结晶 B、 结晶 C有差别。
红外光谱 (IR)谱图叠加（图 18A-C): 结晶 A在 3072.05 cm- 1577.49 cm"1 , 1295.93 cm— 1等处与结晶 B、 结晶 C有差别。 比较例 2. 本发明的 POO二钠盐结晶与现有技术文献所公开结晶的 XRPD比较 根据专利文献 1实施例 1所述方法制得结晶 E， 并与本发明的结晶 A和 B以 及非专利文献 1 (JACS， 1 1 1卷， 6822-6828)中报道的单晶进行 XRPD比较。 这四 种晶体的比较图如图 20所示。
由该图可明显看出： 结晶 A在 9.6°、 1 1.6。、 14.9°、 16.0°、 18.8°、 19.4°、 19.9°、
20.4°等与结晶 E有明显差别。 并且， 结晶 A和结晶 B的图谱与 JACS所述单晶也 有明显差别。 比较例 3. 本发明的 POO二钠盐结晶与结晶 E的 DVS及性质比较
如前所述， 根据专利文献 1实施例 1所述方法制得结晶 E。 采用前述实施例 中所用 DVS测试方法和条件获得结晶 E的吸湿性分析图 (如图 21所示)， 并将其 吸湿性能与本发明的结晶 A和结晶 B进行比较 (结果如图 22所示)。
由图 21可知：结晶 E具有一定的引湿性。在 40%RH吸收水分 1 1.8%，在 65%RH 吸收水分 13.0%， 在 80%RH吸收水分 13.6%。 在常规存储环境中， 40-80%RH， 吸湿性变化小于 2%， 略有吸湿性。
由图 22中的 DVS谱图叠加比较可以看出， 三种晶型的引湿性不同。 其中， 结晶 A的引湿性最小， 在湿度 80%时吸水约 3.3% ; 结晶 B引湿性较大， 在湿度 80%时吸水约 12.0% ; 结晶 E引湿性最大， 在湿度 80%时吸水约 13.6%。 结晶 A 本发明晶体的引湿性优于现有技术的结晶 E， 且结晶 A性能尤为优异。
综上实施例中的结果表明：
本发明的结晶 A、 B通过 X射线粉末衍射使用 Cu-K α放射线得到的 2Θ值是 全新的， 提示本发明的结晶型是新型的。
并且， 本发明的结晶 Α、 Β在结晶度、 稳定性、 吸湿性以及可加工性方面具 有明显的优越性， 因此在工业、 医药和功能性食品等领域具有广泛的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改或对本文所描述的特征进行组合， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A， 其特征在于， 所述结晶 A用 Cu-Κα射线 衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在如下的 2Θ角度有衍射峰： 9.6±0.2°、 11.6±0.2°、 14.9±0.2°、 16.0±0.2°、 18.8±0.2。、 19.4±0.2°、 20.4±0.2°、 21.9±0.2°、 22.7±0.2°、 23.2±0.2°、 25.6±0.2°、 33.7±0.2°、 35.0±0.2°、 35.8±0.2°、 36.7±0.2°、 38.0±0.2°、 38.6±0.2°。
2. 如权利要求 1所述的二钠盐结晶 A， 其特征在于， 所述结晶 A用 Cu-Κα射线 衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在如下的 2Θ角度有衍射峰： 9.2±0.2°、 9.6±0.2°、 11.6±0.2。、 13.5±0.2°、 14.9±0.2°、 16.0±0.2°、 18.2±0.2°、 18.8±0.2°、 19.4±0.2°、 20.4±0.2°、 21.9±0.2°、 22.7±0.2°、 23.2±0.2°、 23.8±0.2°、 25.6±0.2°、 26.4±0.2°、 27.3±0.2°、 28.4±0.2°、 30.7±0.2°、 31.7±0.2°、 32.4±0.2°、 33.7±0.2°、 35.0±0.2°、 35.8±0.2°、 36.7±0.2°、 38.0±0.2°、 38.6±0.2°。
3. 如权利要求 1所述的二钠盐结晶 A， 其特征在于， 所述结晶 A用 Cu-Κα射线 衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱基本上如图 1所示。
4. 一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B， 其特征在于， 所述结晶 B用 Cu-Κα射线 衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱在如下的 2Θ角度有衍射峰： 8.1±0.2°、 9.0±0.2°、 10.1 ±0.2。、 13.7±0.2°、 16.4±0.2°、 17.6±0.2°、 18.2±0.2°、 23.9±0.2°、 25.8±0.2°、 27.2±0.2°、 31.0±0.2°、 39.5±0.2°。
5. 如权利要求 4所述的二钠盐结晶 B， 其特征在于， 所述结晶 B用 Cu-K α射线 衍射得到的 X-射线粉末衍射图谱基本上如图 5所示。
6. 制备权利要求 1〜3中任一项所述的二钠盐结晶 Α的方法， 其特征在于， 所述 制备方法选自下组：
(A) 混悬结晶法： 在 20°C〜60°C温度范围内， 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌 至平衡得到混悬液， 过滤得到所述二钠盐结晶 A;
(B) 缓慢挥发法： 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、 混匀至溶解， 并在 20°C〜 60°C的条件下将溶剂挥干， 得到所述二钠盐结晶 A;
(C) 反溶剂沉淀结晶法： 在 20〜60°C的温度范围下， 将吡咯并喹啉醌二钠盐溶解 在高溶解度溶剂中， 在所得体系中加入低溶解度反溶剂以析出所述二钠盐结晶 A， 其中， 25°C下，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述高溶解度溶剂中的溶解度 0.35 g/100g 溶剂， 吡咯并喹啉醌二钠盐在所述低溶解度反溶剂中的溶解度 0.15 g/100g溶剂。
7. 如权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述方法 (A)、 （B)和 (C)中所用的溶剂 分别选自下组， 其中的比例为体积比：
方法 (A): 乙腈、 甲醇、 乙醇、 水、 乙垸、 庚垸、 甲醇:水、 乙醇:水、 丙酮:水、 乙 腈:水、 四氢呋喃:水、 甲醇:己垸、 乙醇:己垸、 乙腈:己垸、 四氢呋喃:己垸、 甲醇:甲基 叔丁基醚、 乙醇:甲基叔丁基醚、 甲醇:甲苯、 乙醇:甲苯、 乙腈:甲苯、 甲醇:甲基异丁 基酮、 甲苯:乙垸， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5: 1~1 :5， 优选 2: 1~1 :2， 更优 选 1 : 1 ;
方法 (B): 甲醇:水、 乙醇:水、 异丙醇：水、 丙酮:水、 乙腈:水、 四氢呋喃:水， 其中 各混合溶剂中各溶剂的体积比为 10: 1~1 : 10， 优选 5: 1~1 :5；
方法 (C)中的高溶解度溶剂为水， 低溶解度反溶剂选自： 甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙 酮、 乙腈和四氢呋喃。
8. 制备权利要求 4〜5中任一项所述的二钠盐结晶 B的方法， 其特征在于， 所述 制备方法选自下组：
(Α') 混悬结晶法： 在 20°C〜60°C温度范围内， 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌 至平衡得到混悬液， 过滤得到所述二钠盐结晶 B; 或
(Β') 缓慢挥发法： 将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、 混匀至溶解， 并在 20°C〜 60°C的条件下将溶剂挥干， 得到所述二钠盐结晶 B。
9. 如权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 所述方法 (Α')和 (Β')中所用的溶剂分别 选自下组， 其中的比例为体积比：
方法 (Α'): 丙酮、 异丙醇、 异戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸异丙酯、 己垸、 庚垸、 甲基叔 丁基醚、 甲基异丁基酮、 二氯甲垸、 氯仿、 四氢呋喃、 甲苯、 硝基甲垸、 乙醚、 甲乙 酮、 丙酮:乙垸、 甲乙酮:乙垸、 硝基甲垸:乙垸、 乙酸乙酯:乙垸、 甲基叔丁基醚:乙垸、 甲苯:乙垸、 丙酮:甲基叔丁基醚、 甲乙酮：甲基叔丁基醚、 乙腈:甲基叔丁基醚、 四氢呋 喃:甲基叔丁基醚、 硝基甲垸:甲基叔丁基醚、 乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、 丙酮:甲苯、 甲 乙酮:甲苯、 四氢呋喃:甲苯、 硝基甲垸:甲苯、 乙酸乙酯:甲苯、 丙酮:甲基异丁基酮、 甲乙酮：甲基异丁基酮、 乙腈:甲基异丁基酮、 四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲垸:甲基 异丁基酮、 乙酸乙酯:甲基异丁基酮、 甲基叔丁基醚：甲基异丁基酮、 甲苯:甲基异丁基 酮、 四氢呋喃:乙垸， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为 5: 1~1 :5， 优选 2: 1~1 :2， 更 优选 1 : 1 ;
方法 (Β'): 异丙醇：水、 四氢呋喃:水， 其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为
10: 1-1 : 10, 优选 5: 1 :5， 更优选 4: 1 :4。
10. 一种组合物或包装品， 其包含：
(I) 权利要求 1〜3中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 、 权利要求 4〜5 中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B、 通过权利要求 6〜7中任一项所述的 方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A和 /或通过权利要求 8〜9中任一项所述的方 法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B;
(II) 药学上、 生理学上或制剂学上可接受的载体和 /或辅料。
11. 如权利要求 10所述的组合物或包装品， 其特征在于， 所述组合物或包装品选 自下组： 药物组合物、 功能性食品、 词料、 添加剂、 微生物生长抑制剂和防腐剂。
12. 权利要求 1〜3中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A、权利要求 4〜5 中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B、 通过权利要求 6〜7中任一项所述的 方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 A和 /或通过权利要求 8〜9中任一项所述的方 法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶 B的用途， 其特征在于， 其用于制备用于预防、 缓解或治疗选自下组的疾病或症状的药物组合物或功能性食品：
促生长、 抗炎、 增锌降铅、 防治肝脏疾病、 减少白内障形成、 抗癌、 促进神经再 生、 防治心梗、 动脉粥样硬化、 解酒、 老年痴呆、 微生物感染。
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