JP2579595B2 - 新規微生物および該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フザリウム属又はアス
ペルギルス属に属する新規微生物、および該微生物を用
いて２，６−ジメチルナフタレンを酸化し、２，６−ナ
フタレンジカルボン酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２，６−ナフタレンジカルボン酸あるい
は、そのエステル誘導体は高機能性樹脂原料、液晶原
料、ポリアミド系医薬品原料、染料顔料用として有用な
化合物であり、現在数種の化学合成法により生産されて
いる。特にポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）樹脂と
しての用途は、８０〜９０％とも言われており、現在の
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂に比べ、耐
熱温度で約３５℃、破断強度も約２５℃高い他、二次転
移点、結晶化速度、軟化点、溶融粘度等に対し、優れた
性能を有するものとして大量生産化が期待されている。
しかしながら、２，６−ジメチルナフタレンを原料とし
た化学合成法は、高温反応であるため官能基の転移が起
こり易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸
が得られにくい上、高温高圧条件を必要とし、大量のエ
ネルギーを消費することや環境汚染等の問題点もあっ
た。

【０００３】これらの問題点を解決する方法として、近
年、微生物を用いた微生物酸化法の研究が進められてい
る。微生物を触媒とする酸化法は、常温常圧で反応させ
ることができる上、官能基の転移が起こらないため、副
産物の生成がほとんどないという優れた特徴を有してい
る。

【０００４】しかし、これまでの報告では、フラボバ
クテリウム属等の微生物を用いて、２，６−ジメチルナ
フタレンを酸化しても、一方のメチル基しか酸化され
ず、２，６−ナフタレンジカルボン酸は検出されなかっ
た。（Ｅ．Ａ．ＢＡＲＮＳＬＥＹ，ＡＰＰＬＩＥＤ Ａ
ＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯ
ＬＯＧＹ ５４，４２８〜４３３，１９８８）。又、
ノカルディア属細菌による、糖質との共酸化による２，
６−ナフタレンジカルボン酸の確認の報告（Ｇ．Ｋ．Ｓ
ＫＲＹＡＢＩＮ，ｅｔ ａｌ．，ＤＯＫＬ．ＡＫＡＤ．
ＮＡＵＫ．ＵＳＳＲ ２０２，９７３〜９７４，１９７
２）があるが、収量が低く定性的な研究にとどまってい
るというものであった。

【０００５】さらに最近では、シュードモナス属細菌
を用いて発酵法による２，６−ナフタレンジカルボン酸
の製造方法（特開平３−８００９１号公報）や、アル
キルナフタレン化合物のアルキル基に対して酸化力を有
する微生物を利用した、ナフタレンジカルボン酸の製造
方法（特開平５−１５３６５号公報）が提案されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】微生物を触媒とする酸
化法は、常温常圧で反応させることができる上、副産物
の生成がほとんどないという優れた特徴を有している。
しかし、通常の微生物反応による生産は、生産を行う培
養条件が水系主体であり、しかも変換基質としての２，
６−ジメチルナフタレンは常温で固体、かつ水に不溶性
の、いわゆる固−液反応系であるため、変換基質の供給
量に限界が生じ、かつ供給量の制御も困難で、効率的な
連続的大量生産化の点において問題が残っているといえ
る。さらに、水系の発酵法は、通気攪拌動作において、
微生物の作用による発泡の問題が必ず生じ、それが常に
溶存酸素濃度の低下や通気量及び攪拌速度に制限をもた
らすという問題がつきまとっていた。その対策として、
シリコーンや大豆油などのいわゆる消泡剤を用いている
が、効果が長続きすることはなく、したがって、プロセ
スを必要以上に複雑にしたり、それ自身が生産性向上の
阻害要因となることもあった。

【０００７】本発明の目的は、上記従来技術に基づく水
系発酵法を利用した場合の２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸の製造法の問題点に鑑み、不均一系すなわち大量の
有機溶媒と水性液からなる反応環境を設定し、その反応
系において、出発物質としての２，６−ジメチルナフタ
レンから目的物質としての２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸を直接的に生産することにより、上記課題を克服
し、生産能率が良好な製造方法を提供せんとするもので
ある。

【０００８】そこで、２，６−ジメチルナフタレンの両
メチル基末端酸化能を有し、かつ有機溶媒介在系におい
ても生育もしくは反応可能であり、かつ酸化反応が阻害
されることのない微生物を見出し、このような微生物へ
有機溶媒に溶解した２，６−ジメチルナフタレンを供給
すれば、有機溶媒介在型液−液反応系により、連続的に
２，６−ナフタレンジカルボン酸への大量変換も可能と
なり、石油産業および石油化学産業にとって有用性大で
あることは明らかである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】かかる状況において、本
発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討を重ね、有
効な微生物のスクリーニング法の開発とそれによる効率
的な微生物の探索を実施した結果、有機溶媒に溶解した
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な新規微生物を見出し、有機溶媒介在型液−
液反応系による製造法を可能にし、本発明を成すに至っ
た。

【００１０】すなわち、本発明は、フザリウム属（Fusa
rium）又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属し、
有機溶媒に溶解した２，６−ジメチルナフタレンからの
２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌を、２，６−ジ
メチルナフタレンを溶解した有機溶媒と水性培地からな
る有機溶媒介在型二相系（液−液系）で培養または変換
することを特徴とする２，６−ナフタレンジカルボン酸
の製造方法を提供するものである。

【００１１】本発明の新規微生物は、炭素源として２，
６−ジメチルナフタレンのみを添加した培地にて生育
し、かつ２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産する能
力の有無をもって、あるいは有機溶媒に２，６−ジメチ
ルナフタレンのみを溶解したものと培地からなる有機溶
媒介在型培養により生育し、かつ２，６−ナフタレンジ
カルボン酸生産能の有無をもって、スクリーニングする
ことにより分離することができる。

【００１２】例えば、全国各地から集めた土壌につい
て、微生物の増殖に必要な成分のうち、炭素源を含まな
い培地（以下、培地という）を試験管に分注し、これを
滅菌したのち土壌を添加し、さらに２，６−ジメチルナ
フタレンあるいは２，６−ジメチルナフタレンを溶解し
た有機溶媒、例えばデカリンを加え培養を行うか、もし
くはスクリーニングの効率上から、不要なバクテリアの
増殖を抑制するため、さらにクロラムフェニコールを添
加して、試験管振とう機等により培養を行う。この培養
液を、別の試験管に予め分注しておいた同様の培地に植
え継ぎした後、２，６−ジメチルナフタレンを添加し、
試験管振とう機等によりさらに培養する。培養後の培養
液を、上記培地もしくは滅菌水等で希釈し、炭素源を含
まない寒天培地等に塗布した後、２，６−ジメチルナフ
タレンを供給してさらに培養する。培養によって得られ
たコロニーを単離し、それぞれの菌株について２，６−
ナフタレンジカルボン酸の生産能力を確認することによ
り、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産微生物を選
抜することができる。

【００１３】これら微生物の分離用培地としては、炭素
源以外は一般的な培地成分を使用することができる。す
なわち、蒸留水またはイオン交換水１リットルに対し、
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカ
リウム、ナトリウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、
マンガン、銅等の各塩類等を使用できる。また、前記培
養条件は、一般に微生物が死滅しない培養条件であれば
良く、例えばｐＨ約３〜９，温度約１５〜４０℃で好気
的に行われる。

【００１４】得られた微生物の２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸の生産能力の確認は、それぞれの微生物を、炭
素源として２，６−ジメチルナフタレンを添加した培地
中で、上記と同様の条件で培養した培養液の上清を、適
当な分析手法、例えば高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ），ガスクロマトグラフィー（ＧＣ），核磁気共
鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線吸収スペクトル（Ｉ
Ｒ），紫外吸収スペクトル（ＵＶ）等を用いて分析すれ
ば良い。得られた微生物は同定のための試験を行い、以
下の表１および表２に示す性質を有するものであった。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】本微生物は２，６−ジメチルナフタレンを
単一炭素源として、有機溶媒系でも生育可能であり、か
つ培地中に２，６−ナフタレンジカルボン酸を蓄積する
糸状菌である。このような特性を有した２，６−ナフタ
レンジカルボン酸を生産する糸状菌は、未だ報告されて
いない。

【００１８】以上の菌学的性質より、本発明者らは、Ｙ
ＩＩ３１−３株はフザリウム・ソラニ（Fusarium solan
i）、ＹＩＩ１５−２株はアスペルギルス・フラバス（A
spergillus flavus）に属する新菌株であると判定し、
本菌をフザリウム・ソラニＹＩＩ３１−３株、およびア
スペルギルス・フラバスＹＩＩ１５−２株と命名し、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４２９５、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２９６）。

【００１９】本発明の微生物は、フザリウム・ソラニお
よびアスペルギルス・フラバスに属する、２，６−位の
メチル基の酸化能を有する微生物及びこれらの自然並び
に人工的変異株も包含するものである。

【００２０】次に、本発明による２，６−ナフタレンジ
カルボン酸の製造方法を、フザリウム・ソラニＹＩＩ３
１−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２９５）株およびアスペル
ギルス・フラバスＹＩＩ１５−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
２９６）株を用いた場合を一例に説明する。

【００２１】これらの糸状菌を培養する場合の培地成分
としては、炭素源及び変換基質として２，６−ジメチル
ナフタレンを含有すること以外は、本菌の生育が良好で
あれば他の培地成分は特に制限されない。すなわち、生
育基質として、窒素源では、例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカリウム、ナ
トリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウ
ム、コバルト等の各塩類が使用できる。又、炭素源とし
ては２，６−ジメチルナフタレン以外に、サリチル酸、
２−メチルナフタレン、アントラセン、グルコース、フ
ラクトース、デンプン等を補助基質として添加すること
も可能である。又、糸状菌の場合は、上記生育基質の窒
素源の種類によって、反応性が大きく変わることが有る
ので、より良好な反応性を得るためには、菌種に応じて
窒素源の種類を適切に選択することが好ましい。

【００２２】有機溶媒介在系培養で用いる２，６−ジメ
チルナフタレンを溶解する溶媒としては、例えば、ヘプ
タン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、
ドデカン、テトラリン、ヘキシルエーテル、等が使用で
きるが、数日間の培養で揮発減少せず、又、雑菌の繁殖
を抑制する意味から微生物毒性が強すぎず、また弱すぎ
ないもので、かつ、２，６−ジメチルナフタレンを溶解
し資化されないものであれば、上記以外の溶媒も使用す
ることができる。そして、これらの内のいずれか１種以
上を任意に混合し使用しても良い。

【００２３】本発明のように、溶媒に２，６−ジメチル
ナフタレンを溶解して供給する方法は、従来の水系培地
に直接２，６−ジメチルナフタレンを供給する、固−液
反応方法に比べ、変換基質の分散性を極めて良好にする
ため菌体との接触が容易になり、溶媒中の変換基質は均
一状態にし易いことから、その供給量を容易に制御する
ことができ、培地のみならず溶媒中の変換基質を効率良
く連続的に、又は間欠的に、自在に供給できるので、連
続式反応が可能となり、２，６−ナフタレンジカルボン
酸の生産効率をより高めることができる。又、本菌では
従来法のように２，６−ジメチルナフタレンを溶媒に溶
解せずに、直接供給しても２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸を製造することができる。

【００２４】培養条件は、本菌が死滅せず増殖可能であ
れば良く、例えば培養温度は約１０〜４０℃、より好ま
しくは約２０〜３５℃、培地のｐＨは約３〜９、より好
ましくは４〜７の範囲で、約１〜３０日間好気的に培養
又は反応させるのが良い。

【００２５】２，６−ジメチルナフタレンを単一炭素源
もしくは変換基質として、これら糸状菌を培養し、目的
とする２，６−ナフタレンジカルボン酸を効率よく生産
するためには、２，６−ジメチルナフタレンを、少なく
ともこれら糸状菌が生育するのに必要な量以上を添加す
ることが必要である。本菌は、２，６−ジメチルナフタ
レンによって阻害を大きく受け難いため、これを多量に
添加することが可能であるが、生成する２，６−ナフタ
レンジカルボン酸の量が増加してくると培地のｐＨが低
下するので、水酸化ナトリウム、アンモニア水、水酸化
カリウム等のアルカリ溶液を供給したり、緩衝能を有す
る成分を供給するか、あるいは予め培地に用いる等して
ｐＨを適正な範囲に調整すれば、より効率良い生産がで
きる。更に上記の条件で菌体を予め培養増殖して集菌
後、これを以下に述べる方法に供しても良い。

【００２６】得られた菌体培養物は、そのまま酵素源と
して使用することができるが、遠心分離等の操作により
固液分離して得た微生物菌体を用いることが好ましい。
さらに微生物菌体を燐酸緩衝液等の溶液で洗浄し、該溶
液に懸濁して使用することもできる。又、菌体由来の酵
素は、常法により精製することができ、これらの休止菌
体、菌体処理物あるいは酵素を用いて生産する場合は、
前記培養条件下で行うことができる。これら糸状菌を用
いて、２，６−ジメチルナフタレンから２，６−ナフタ
レンジカルボン酸を生産する工程はバッチ式でも良く、
バイオリアクター等を用いても可能である。また、本菌
の菌体、その処理物または酵素を、例えばアルギン酸カ
ルシウム、ポリアクリルアミド法、ポリウレタン樹脂
法、光架橋性樹脂法等を用いて通常の固定化法に従って
固定化することもできる。培養液又は反応液中の２，６
−ナフタレンジカルボン酸は常法に従い精製すれば良
い。すなわち、培養液又は反応液を加えて酸性化するこ
とにより、２，６−ナフタレンジカルボン酸を回収する
ことができる。また、溶剤抽出等の方法により回収する
ことも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方
法を適宜併用することができる。

【００２７】本発明の製造方法は、有機溶媒に溶解した
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な微生物を、見出したことで可能となったも
のである。

【００２８】

【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００２９】

【実施例１】 有機溶媒耐性２，６−ジメチルナフタレン資化性菌の分
離

【００３０】クロラムフェニコールを５０μｇ／ｍｌに
なるように添加したＹＭ培地（酵母エキス３ｇ、ペプト
ン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、グルコース１０ｇ、ｐＨ５．
５）を、内径２１ｍｍの試験管に８ｍｌ入れ、全国各地
から集めた土壌について、薬さじ一杯の土壌を試験管に
添加し、試験管振とう機を用いて３０℃、２７０ｒｐｍ
で１晩振とう培養を行う。

【００３１】次に、微生物の増殖に必要な成分のうち炭
素源を含まない培地（BACTO YEASTNITROGENBASE（Difco
社製）：以下、ＹＮＢという）を、内径２１ｍｍの試
験管に４ｍｌ入れ、さらに２，６−ジメチルナフタレン
を溶解した有機溶媒、すなわち２，６−ジメチルナフタ
レンを１（ｗ／ｖ）％含有したデカリンを４ｍｌ加え、
１２１℃で２０分間滅菌する。

【００３２】冷却後、試験管の培地にクロラムフェニコ
ールを５０μｇ／ｍｌになるように添加し、上記のＹＭ
培地培養液をマイクロピペットを用いて４００μｌ植え
継ぎし、試験管振とう機により更に振とう培養する。

【００３３】この培養液を、再度同様のクロラムフェニ
コールを５０μｇ／ｍｌになるように添加した、２，６
−ジメチルナフタレンを含有するデカリンと培地を混合
分注しておいた別の試験管に、マイクロピペットを用い
て４０μｌ植え継ぎし、再び試験管振とう機により振と
う培養する。

【００３４】この培養液もしくは滅菌水等で希釈した培
養液を、同様のＹＮＢ寒天培地に塗布し、２，６−ジメ
チルナフタレンを直接供給してさらに培養した。

【００３５】２，６−ジメチルナフタレンを資化し平板
培地上に出現した３６９株のバクテリアと８６株の真菌
類を分離し、さらに、これらの中から糸状菌を選抜し
て、フザリウム・ソラニＹＩＩ３１−３株およびアスペ
ルギルス・フラバスＹＩＩ１５−２株を得た。

【００３６】

【実施例２】 有機溶媒耐性資化性菌による２，６−ナフタレンジカル
ボン酸の生産

【００３７】微生物の増殖に必要な成分のうち窒素源を
含まない培地（BACTO YEAST CORBONBASE（Difco 社
製）：以下、ＹＣＢという）に硝酸アンモニウム０．５
ｍｇ／ｌまたは硫酸アンモニウム０．５ｍｇ／ｌとなる
ように添加した２種類の培地を調製した。窒素源の種類
を変えて調製した培地各々を、内径２１ｍｍの試験管に
４ｍｌ入れ、さらに２，６−ジメチルナフタレンを１
（ｗ／ｖ）％含有したデカリンを４ｍｌ加え、１２１℃
で２０分間滅菌し、これを有機溶媒介在型培地とした。
別に、有機溶媒介在型培養との効果を比較するために、
有機溶媒を介在させない培養も同時に行った。すなわ
ち、ＹＣＢ培地に硝酸アンモニウム０．５ｍｇ／ｌとな
るように調製した培地４ｍｌを試験管に採り、これにフ
ィルター滅菌した５（ｗ／ｖ）％ ２，６−ジメチルナ
フタレンを含有したジエチルエーテルを０．８ｍｌ入
れ、放置してジエチルエーテルを蒸発させ、結晶状の
２，６−ジメチルナフタレンを析出させて、これを有機
溶媒無添加培地（固−液系）とした。

【００３８】実施例１で分離したＹＩＩ３１−３株およ
びＹＩＩ１５−２株について、上記３種の培地にて増殖
生産を試験した。すなわち、予め菌体を培養しておいた
ＹＭ培地の培養液から、上記３種の培地２本づつに４０
μｌ植菌し、３０℃、２７０ｒｐｍで振とう培養した。
結果を下記表３に示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】上記した表３の結果から、本発明のこれら
２菌種は、有機溶媒介在型二相系において、２，６−ジ
メチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸
の生産能を有していることは明らかで、特に、フザリウ
ム属の糸状菌は従来的な固−液系よりも有機溶媒介在型
二相系において生産性に優れ、二相系培養に、より適し
た菌種であることも確認された。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、２，６−ジメチルナフ
タレンを唯一炭素源もしくは変換基質として溶解した有
機溶媒と、炭素源を含まない培地との有機溶媒介在型培
養系において、生育可能で、または２，６−ジメチルナ
フタレンを唯一炭素源もしくは変換基質として溶解した
有機溶媒と、炭素源を含む培地との有機溶媒介在型培養
系において、２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産す
ることができる生産菌、もしくはその休止菌体又は菌体
由来の酵素を用い、２，６−ジメチルナフタレンから
２，６−ナフタレンジカルボン酸を効率よく生産するこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:67） (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:67） (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:77） (56)参考文献 特開 平３−80091（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−15365（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−103659（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−184669（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−194368（ＪＰ，Ａ) 米国特許3361546（ＵＳ，Ａ) 米国特許5030568（ＵＳ，Ａ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２，６−ジメチルナフタレンから２，６
   −ナフタレンジカルボン酸を生産することのできる２，
   ６−ナフタレンジカルボン酸生産菌、フザリウム ソラ
   ニ又はアスペルギルス フラバス。
2. 【請求項２】 有機溶媒介在系において２，６−ジメチ
   ルナフタレンの両メチル基末端酸化能を有する２，６−
   ナフタレンジカルボン酸生産菌、フザリウムソラニ又は
   アスペルギルス フラバス。
3. 【請求項３】 請求項１〜２に記載の生産菌が、フザリ
   ウム ソラニＹＩＩ３１−３又はアスペルギルス フラ
   バスＹＩＩ１５−２である２，６−ナフタレンジカルボ
   ン酸生産菌。
4. 【請求項４】 フザリウム属又はアスペルギルス属に属
   する２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌を、２，６
   −ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と、培地から
   なる有機溶媒介在型培地において培養し、２，６−ナフ
   タレンジカルボン酸を生産させることを特徴とする２，
   ６−ナフタレンジカルボン酸あるいはその塩の製造法。