JPH099956A - 変異微生物及び該微生物を用いた２，６− ナフタレンジカルボン酸の製造法 - Google Patents
変異微生物及び該微生物を用いた２，６− ナフタレンジカルボン酸の製造法Info
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- JPH099956A JPH099956A JP18326095A JP18326095A JPH099956A JP H099956 A JPH099956 A JP H099956A JP 18326095 A JP18326095 A JP 18326095A JP 18326095 A JP18326095 A JP 18326095A JP H099956 A JPH099956 A JP H099956A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 スフィンゴモナス属菌由来の変異微生物（例
えば、Sphingomonas paucimobilis M200-9）を用い、
２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と培地
からなる二相系培養液において培養し、あるいはまた、
２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と培地
および／又は緩衝液からなる二相系反応液において反応
させ、２，６−ナフタレンジカルボン酸を生成もしくは
変換させる。 【効果】 本変異微生物は、変換能が大幅に向上してい
るため、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産を効率
よく行うことができる。
えば、Sphingomonas paucimobilis M200-9）を用い、
２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と培地
からなる二相系培養液において培養し、あるいはまた、
２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と培地
および／又は緩衝液からなる二相系反応液において反応
させ、２，６−ナフタレンジカルボン酸を生成もしくは
変換させる。 【効果】 本変異微生物は、変換能が大幅に向上してい
るため、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産を効率
よく行うことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸生産菌由来の変異微生物、及び該微生物の休止
菌体または菌体由来の酵素を用いて２，６−ジメチルナ
フタレンを酸化し、２，６−ナフタレンジカルボン酸を
製造する方法に関する。
ルボン酸生産菌由来の変異微生物、及び該微生物の休止
菌体または菌体由来の酵素を用いて２，６−ジメチルナ
フタレンを酸化し、２，６−ナフタレンジカルボン酸を
製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】２，６−ナフタレンジカルボン酸あるい
は、そのエステル誘導体は高機能性樹脂原料、液晶原
料、ポリアミド系医薬品原料、染料顔料用として有用な
化合物であり、現在数種の化学合成法により生産されて
いる。特にポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）樹脂と
しての用途は、８０〜９０％とも言われており、現在の
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂に比べ、耐
熱温度で約３５℃、破断強度も２５％高い他、二次転移
点、結晶化速度、軟化点、溶融粘度等に対し、優れた性
能を有するものとして大量生産化が期待されている。し
かしながら、２，６−ジメチルナフタレンを原料とした
化学合成法は、高温反応であるため官能基の転移が起こ
り易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸が
得られにくい上、高温高圧条件を必要とし、大量のエネ
ルギーを消費することや環境汚染等の問題もあった。
は、そのエステル誘導体は高機能性樹脂原料、液晶原
料、ポリアミド系医薬品原料、染料顔料用として有用な
化合物であり、現在数種の化学合成法により生産されて
いる。特にポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）樹脂と
しての用途は、８０〜９０％とも言われており、現在の
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂に比べ、耐
熱温度で約３５℃、破断強度も２５％高い他、二次転移
点、結晶化速度、軟化点、溶融粘度等に対し、優れた性
能を有するものとして大量生産化が期待されている。し
かしながら、２，６−ジメチルナフタレンを原料とした
化学合成法は、高温反応であるため官能基の転移が起こ
り易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸が
得られにくい上、高温高圧条件を必要とし、大量のエネ
ルギーを消費することや環境汚染等の問題もあった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの問題を解決す
る方法として、近年、微生物を用いた微生物酸化法の研
究が進められている。微生物を触媒とする酸化法は、常
温常圧で反応させることができる上、官能基の転移が起
こらないため、副産物の生成がほとんどないという優れ
た特徴を有している。
る方法として、近年、微生物を用いた微生物酸化法の研
究が進められている。微生物を触媒とする酸化法は、常
温常圧で反応させることができる上、官能基の転移が起
こらないため、副産物の生成がほとんどないという優れ
た特徴を有している。
【０００４】そこで、２，６−ジメチルナフタレンの両
メチル基末端酸化能を有し、２，６−ナフタレンジカル
ボン酸への大量変換が可能となるバイオリアクターが構
築できれば、省エネルギーや環境調和型の化学品製造プ
ロセスとして、石油産業および石油化学産業にとって有
用性は極めて大きくなることから、そしてさらに最近で
は、 シュードモナス属細菌を用いた発酵法による２，６−
ナフタレンジカルボン酸の製造方法（特開平３−８００
９１号公報）や、 アルキルナフタレン化合物のアルキル基に対して酸化
力を有する微生物を利用した、ナフタレンジカルボン酸
の製造方法（特開平５−１５３６５号公報）、及び、 ２，６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と水
性培地からなる有機溶媒介在型二相系培地で培養し、
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法が提案
されている。
メチル基末端酸化能を有し、２，６−ナフタレンジカル
ボン酸への大量変換が可能となるバイオリアクターが構
築できれば、省エネルギーや環境調和型の化学品製造プ
ロセスとして、石油産業および石油化学産業にとって有
用性は極めて大きくなることから、そしてさらに最近で
は、 シュードモナス属細菌を用いた発酵法による２，６−
ナフタレンジカルボン酸の製造方法（特開平３−８００
９１号公報）や、 アルキルナフタレン化合物のアルキル基に対して酸化
力を有する微生物を利用した、ナフタレンジカルボン酸
の製造方法（特開平５−１５３６５号公報）、及び、 ２，６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と水
性培地からなる有機溶媒介在型二相系培地で培養し、
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法が提案
されている。
【０００５】しかし、前記、の方法では省エネルギ
ー、環境保全型の生産法としては好ましいものである
が、生産を行う反応条件は水系であり、しかも変換基質
としての２，６−ジメチルナフタレンは水に不溶性で、
いわゆる固−液反応系であるため変換基質の供給量に限
界が生じ、かつ供給量の制御も困難で効率的な連続的生
産化の点において、未だ問題を内包している。また一
方、前記の方法は、上記、の問題点を解決しうる
発明であるが、唯一、２，６−ジメチルナフタレンから
２，６−ナフタレンジカルボン酸への変換率が乏しく、
この点に課題が残っている。
ー、環境保全型の生産法としては好ましいものである
が、生産を行う反応条件は水系であり、しかも変換基質
としての２，６−ジメチルナフタレンは水に不溶性で、
いわゆる固−液反応系であるため変換基質の供給量に限
界が生じ、かつ供給量の制御も困難で効率的な連続的生
産化の点において、未だ問題を内包している。また一
方、前記の方法は、上記、の問題点を解決しうる
発明であるが、唯一、２，６−ジメチルナフタレンから
２，６−ナフタレンジカルボン酸への変換率が乏しく、
この点に課題が残っている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】係る状況に鑑み、本発明
者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討を重ね有効な変
換菌の育種を実施した結果、変換能の向上した変異微生
物の取得に成功し、加えて、該微生物を用いた有機溶媒
介在型二相系における、効果的な２，６−ナフタレンジ
カルボン酸の製造法を確立し、本発明を成すに至った。
者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討を重ね有効な変
換菌の育種を実施した結果、変換能の向上した変異微生
物の取得に成功し、加えて、該微生物を用いた有機溶媒
介在型二相系における、効果的な２，６−ナフタレンジ
カルボン酸の製造法を確立し、本発明を成すに至った。
【０００７】本発明は、２，６−ジメチルナフタレンの
両メチル基末端酸化能を有し、かつ有機溶媒介在型二相
系において生育もしくは反応可能な微生物を、変異誘発
処理し選抜して得た変換能の向上した微生物を用いるこ
とにより、従来の有機溶媒介在型二相系による製造法と
比べ、更に効率的な、２，６−ジメチルナフタレンから
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法を提供
するものである。
両メチル基末端酸化能を有し、かつ有機溶媒介在型二相
系において生育もしくは反応可能な微生物を、変異誘発
処理し選抜して得た変換能の向上した微生物を用いるこ
とにより、従来の有機溶媒介在型二相系による製造法と
比べ、更に効率的な、２，６−ジメチルナフタレンから
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法を提供
するものである。
【０００８】即ち、本発明の変異微生物は、スフィンゴ
モナス・パウチモビリス（Sphingomonas paucimobili
s）Ａ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６３２）株に、ニトロ
ソグアニジン（１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１
−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，以下、ＮＴＧと
称す。）を突然変異誘発剤として用い、フルクトースを
生育炭素源として無機塩寒天培地上において、２，６−
ジメチルナフタレンの資化能低下株、２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸様蛍光色検出あるいは２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸様固形物蓄積株を選抜することで取得す
ることができる。
モナス・パウチモビリス（Sphingomonas paucimobili
s）Ａ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６３２）株に、ニトロ
ソグアニジン（１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１
−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，以下、ＮＴＧと
称す。）を突然変異誘発剤として用い、フルクトースを
生育炭素源として無機塩寒天培地上において、２，６−
ジメチルナフタレンの資化能低下株、２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸様蛍光色検出あるいは２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸様固形物蓄積株を選抜することで取得す
ることができる。
【０００９】更に詳しくは、スフィンゴモナス・パウチ
モビリス Ａ−７株をＮＴＧ溶液（400,200,100,50,μ
ｇ／ｍｌ ０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０））と
０．０５Ｍ燐酸緩衝液を１：１（ｍｌ）に混合した溶液
で変異誘発処理する。変異誘発処理した菌は、遠心分離
により回収し、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄した
後、ＫＦ寒天培地に播く。これを３０℃で３〜５日間培
養した後、以下のスクリーニングに供する。
モビリス Ａ−７株をＮＴＧ溶液（400,200,100,50,μ
ｇ／ｍｌ ０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０））と
０．０５Ｍ燐酸緩衝液を１：１（ｍｌ）に混合した溶液
で変異誘発処理する。変異誘発処理した菌は、遠心分離
により回収し、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄した
後、ＫＦ寒天培地に播く。これを３０℃で３〜５日間培
養した後、以下のスクリーニングに供する。
【００１０】１）２，６−ジメチルナフタレン資化欠損
株選抜のネガティブスクリーニング：コロニーを形成し
ている菌株をＫＦ及びＫ寒天培地にレプリカし、２，６
−ジメチルナフタレンを噴霧し培養する。Ｋ寒天培地で
未生育な株、およびＫＦ寒天培地で生育する株を選択。
株選抜のネガティブスクリーニング：コロニーを形成し
ている菌株をＫＦ及びＫ寒天培地にレプリカし、２，６
−ジメチルナフタレンを噴霧し培養する。Ｋ寒天培地で
未生育な株、およびＫＦ寒天培地で生育する株を選択。
【００１１】２）蛍光及び目視によるポジティブスクリ
ーニング：コロニーを形成している菌株をＫＦ寒天培地
にレプリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培
養する。トランスイルミネーターでＵＶを当て蛍光色を
観察するか、または直接蓄積物の目視観察をし、陽性で
ある株を選択する。得られたコロニーを単離し、それぞ
れの菌株について２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産能力を確認することにより、２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸生産微生物を選抜する。
ーニング：コロニーを形成している菌株をＫＦ寒天培地
にレプリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培
養する。トランスイルミネーターでＵＶを当て蛍光色を
観察するか、または直接蓄積物の目視観察をし、陽性で
ある株を選択する。得られたコロニーを単離し、それぞ
れの菌株について２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産能力を確認することにより、２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸生産微生物を選抜する。
【００１２】上記分離用培地として、炭素源以外は一般
的な培地成分を使用することができる。即ち、蒸留水ま
たはイオン交換水１リットルに対し、窒素源としては、
例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素等を、無機塩類としては、例えば、カリウム、ナトリ
ウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅等
の各塩類を使用できる。又、培養条件は、一般に生物が
死滅しない培養条件であれば良く、例えばｐＨ約３〜
９、温度約１５〜４０℃で好気的に行われる。
的な培地成分を使用することができる。即ち、蒸留水ま
たはイオン交換水１リットルに対し、窒素源としては、
例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素等を、無機塩類としては、例えば、カリウム、ナトリ
ウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅等
の各塩類を使用できる。又、培養条件は、一般に生物が
死滅しない培養条件であれば良く、例えばｐＨ約３〜
９、温度約１５〜４０℃で好気的に行われる。
【００１３】得られた微生物の２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸の生産能力の確認は、それぞれの微生物を、変
換基質（原料）として２，６−ジメチルナフタレンを添
加した液体培地中で上記と同様の条件で培養し、培養液
の上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマトグラ
フ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、核磁気
共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線吸収スペクトル（Ｉ
Ｒ）、紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）等を用いて分析・
同定すれば良い。
ルボン酸の生産能力の確認は、それぞれの微生物を、変
換基質（原料）として２，６−ジメチルナフタレンを添
加した液体培地中で上記と同様の条件で培養し、培養液
の上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマトグラ
フ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、核磁気
共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線吸収スペクトル（Ｉ
Ｒ）、紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）等を用いて分析・
同定すれば良い。
【００１４】本発明では、以上のスクリーニングによっ
て得られた微生物の内の一株を、スフィンゴモナス・パ
ウチモビリス Ｍ２００−９（Sphingomonas paucimobi
lisM200-9）株と命名し、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した（ＦＥＲＭＰ−１４９８０）。
て得られた微生物の内の一株を、スフィンゴモナス・パ
ウチモビリス Ｍ２００−９（Sphingomonas paucimobi
lisM200-9）株と命名し、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した（ＦＥＲＭＰ−１４９８０）。
【００１５】次に本発明の変異微生物を用いた２，６−
ナフタレンジカルボン酸の製造方法について説明する。
ナフタレンジカルボン酸の製造方法について説明する。
【００１６】本発明の二相系培養液および二相系反応液
に用いる有機溶媒は、本微生物が生育可能で２，６−ジ
メチルナフタレンを溶解し資化されないものであれば、
特に制限するものではない。
に用いる有機溶媒は、本微生物が生育可能で２，６−ジ
メチルナフタレンを溶解し資化されないものであれば、
特に制限するものではない。
【００１７】培地成分としては、炭素源及び変換基質と
して２，６−ジメチルナフタレンを含有すること以外
は、本微生物の生育が良好であれば他の培地成分は特に
制限されない。即ち、生育基質としての窒素源では、例
えばアンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を、無機塩類として
は、例えば、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウ
ム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類が
使用できる。又、炭素源としては、２，６−ジメチルナ
フタレン以外に、サリチル酸、２−メチルナフタレン、
アントラセン、グルコース、フラクトース、デンプン等
を補助基質として添加することも可能である。
して２，６−ジメチルナフタレンを含有すること以外
は、本微生物の生育が良好であれば他の培地成分は特に
制限されない。即ち、生育基質としての窒素源では、例
えばアンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を、無機塩類として
は、例えば、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウ
ム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類が
使用できる。又、炭素源としては、２，６−ジメチルナ
フタレン以外に、サリチル酸、２−メチルナフタレン、
アントラセン、グルコース、フラクトース、デンプン等
を補助基質として添加することも可能である。
【００１８】培養条件は、本微生物が死滅せず増殖可能
であれば良く、例えば培養温度は、約１０〜４０℃、よ
り好ましくは２０〜３５℃、培地のｐＨは約３〜９、よ
り好ましくはｐＨ４〜７の範囲で、約１〜３０日間好気
的に培養すれば良い。
であれば良く、例えば培養温度は、約１０〜４０℃、よ
り好ましくは２０〜３５℃、培地のｐＨは約３〜９、よ
り好ましくはｐＨ４〜７の範囲で、約１〜３０日間好気
的に培養すれば良い。
【００１９】得られた培養菌体は、そのまま酵素源とし
て使用することができるが、遠心分離等の操作により固
液分離して得た菌体を用いることが好ましい。さらに菌
体をｐＨが適正な範囲に調整された燐酸緩衝液等の緩衝
液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用することもできる。
又、菌体由来の酵素は、常法により精製することがで
き、これらの休止菌体、菌体処理物あるいは酵素を用い
て生産する場合は、基質を含有した有機溶媒と培地およ
び／または緩衝液からなる反応液により、前記と同様の
培養条件下で反応を行うことができる。更に、本発明の
変異微生物による、休止菌体、菌体処理物あるいは酵素
を用いて反応に供する場合は、活性の優れた菌体、例え
ば前培養処理において対数増殖期にあるような菌体を用
いることでも、より生産性を上げることができる。
て使用することができるが、遠心分離等の操作により固
液分離して得た菌体を用いることが好ましい。さらに菌
体をｐＨが適正な範囲に調整された燐酸緩衝液等の緩衝
液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用することもできる。
又、菌体由来の酵素は、常法により精製することがで
き、これらの休止菌体、菌体処理物あるいは酵素を用い
て生産する場合は、基質を含有した有機溶媒と培地およ
び／または緩衝液からなる反応液により、前記と同様の
培養条件下で反応を行うことができる。更に、本発明の
変異微生物による、休止菌体、菌体処理物あるいは酵素
を用いて反応に供する場合は、活性の優れた菌体、例え
ば前培養処理において対数増殖期にあるような菌体を用
いることでも、より生産性を上げることができる。
【００２０】本発明の変異微生物は、２，６−ジメチル
ナフタレンによって大きな阻害を受け難いため、これを
多量に添加することが可能であるが、その代謝産物であ
る２，６−ナフタレンジカルボン酸が増加してくると、
培養系もしくは反応系が阻害を受け変換能が低下するた
め、培養液又は反応液を交換する等の、阻害を解除する
操作を加えることがより好ましい。
ナフタレンによって大きな阻害を受け難いため、これを
多量に添加することが可能であるが、その代謝産物であ
る２，６−ナフタレンジカルボン酸が増加してくると、
培養系もしくは反応系が阻害を受け変換能が低下するた
め、培養液又は反応液を交換する等の、阻害を解除する
操作を加えることがより好ましい。
【００２１】本発明では、前培養処理菌体を集菌後、燐
酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4）に懸濁し、基質
を含有する有機溶媒と培地および／または同燐酸緩衝液
からなる反応液中で反応させるか、又は反応後に菌体を
再度集菌して、交換された同反応液中にて反応させるこ
とで、より優れた効率的な２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸の生産を達成することができる。
酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4）に懸濁し、基質
を含有する有機溶媒と培地および／または同燐酸緩衝液
からなる反応液中で反応させるか、又は反応後に菌体を
再度集菌して、交換された同反応液中にて反応させるこ
とで、より優れた効率的な２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸の生産を達成することができる。
【００２２】又、２，６−ジメチルナフタレンから２，
６−ナフタレンジカルボン酸を生産する工程はバッチ式
でも良いが、適当なろ過材を利用した反応液の連続抜き
出し及び供給システムを備えた、バイオリアクター等を
用いればより効率的に行うことができる。さらに、本菌
体、その処理物又は酵素を、例えばアルギン酸カルシウ
ム、ポリアクリルアミド法、ポリウレタン樹脂法、光架
橋性樹脂法等を用いて通常の固定化法に従って固定化し
反応させることもできる。
６−ナフタレンジカルボン酸を生産する工程はバッチ式
でも良いが、適当なろ過材を利用した反応液の連続抜き
出し及び供給システムを備えた、バイオリアクター等を
用いればより効率的に行うことができる。さらに、本菌
体、その処理物又は酵素を、例えばアルギン酸カルシウ
ム、ポリアクリルアミド法、ポリウレタン樹脂法、光架
橋性樹脂法等を用いて通常の固定化法に従って固定化し
反応させることもできる。
【００２３】培養液又は反応液中の２，６−ナフタレン
ジカルボン酸は、常法に従い精製すれば良い。即ち、培
養液又は反応液を加えて酸性化することにより、２，６
−ナフタレンジカルボン酸を回収することができる。さ
らに溶剤抽出等の方法により回収することも可能であ
り、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用す
ることができる。
ジカルボン酸は、常法に従い精製すれば良い。即ち、培
養液又は反応液を加えて酸性化することにより、２，６
−ナフタレンジカルボン酸を回収することができる。さ
らに溶剤抽出等の方法により回収することも可能であ
り、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用す
ることができる。
【００２４】本発明の製造方法は、２，６−ジメチルナ
フタレンの両メチル基を酸化することのできる、２，６
−ナフタレンジカルボン酸生産菌由来で、かつ２，６−
ジメチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン
酸への変換能を向上させた、生産速度の極めて高い２，
６−ナフタレンジカルボン酸生産菌を育種したことで、
初めて達成することができたものである。
フタレンの両メチル基を酸化することのできる、２，６
−ナフタレンジカルボン酸生産菌由来で、かつ２，６−
ジメチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン
酸への変換能を向上させた、生産速度の極めて高い２，
６−ナフタレンジカルボン酸生産菌を育種したことで、
初めて達成することができたものである。
【００２５】
【実施例】以下に本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例に限定されるものではない。
はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例１】 変異微生物の創製・分離 スフィンゴモナス・パウチモビリスＡ−７株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６３２）を１０ｍｌのＬ培地（表１）が入っ
たＬ字管に植菌し、３０℃で一晩前培養を行う。次に、
４本用意した１０ｍｌのＬ培地が入ったＬ字管に前培養
液を０．１ｍｌ（培地に対し１％）ずつ植菌し、３０℃
で４時間培養する。培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、これを０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄する。
Ｐ−１３６３２）を１０ｍｌのＬ培地（表１）が入っ
たＬ字管に植菌し、３０℃で一晩前培養を行う。次に、
４本用意した１０ｍｌのＬ培地が入ったＬ字管に前培養
液を０．１ｍｌ（培地に対し１％）ずつ植菌し、３０℃
で４時間培養する。培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、これを０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄する。
【００２７】
【表１】
【００２８】ＮＴＧ溶液（400,200,100,50,μｇ／ｍｌ
０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０））と菌液を１：
１（ｍｌ）で混合して菌懸濁液とし、３０℃で２０時
間、穏やかに振とうする。次いで氷浴中で冷却し、再び
遠心分離して菌体を０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄す
る。Ｌ字管に入った１０ｍｌのＬ培地に菌体を加え、３
０℃で２．５時間振とう培養する。再び氷浴中で冷却し
ながら、３．３ｍｌの５０％グリセロール含有Ｌ培地を
適当量菌懸濁液へ添加し、これを１０本の試験管に分注
して、−８０℃の冷凍庫で保存する。
０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０））と菌液を１：
１（ｍｌ）で混合して菌懸濁液とし、３０℃で２０時
間、穏やかに振とうする。次いで氷浴中で冷却し、再び
遠心分離して菌体を０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄す
る。Ｌ字管に入った１０ｍｌのＬ培地に菌体を加え、３
０℃で２．５時間振とう培養する。再び氷浴中で冷却し
ながら、３．３ｍｌの５０％グリセロール含有Ｌ培地を
適当量菌懸濁液へ添加し、これを１０本の試験管に分注
して、−８０℃の冷凍庫で保存する。
【００２９】翌日この内の１本について、３０℃で融解
し、同温度で４時間培養する。培養後、遠心分離により
菌体を集菌し、これを０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄
する。０．０１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジメチルナフタレ
ン（固体状）を１０ｍｌのＫ培地に懸濁し、３０℃で３
〜６時間培養する。ペニシリンＧ（４０００Ｕ／ｍｌ保
存液）を培養液中の濃度で２００Ｕ／ｍｌとなるように
添加し、２５℃で一晩、振とう培養する。培養後、遠心
分離により菌体を集菌し、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回
洗浄する。次に洗浄後の菌体を同燐酸緩衝液で希釈しＫ
Ｆ寒天培地（表２）に播く。３０℃で３日間培養し、出
現したコロニーについて以下のスクリーニング操作を行
う。
し、同温度で４時間培養する。培養後、遠心分離により
菌体を集菌し、これを０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄
する。０．０１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジメチルナフタレ
ン（固体状）を１０ｍｌのＫ培地に懸濁し、３０℃で３
〜６時間培養する。ペニシリンＧ（４０００Ｕ／ｍｌ保
存液）を培養液中の濃度で２００Ｕ／ｍｌとなるように
添加し、２５℃で一晩、振とう培養する。培養後、遠心
分離により菌体を集菌し、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で２回
洗浄する。次に洗浄後の菌体を同燐酸緩衝液で希釈しＫ
Ｆ寒天培地（表２）に播く。３０℃で３日間培養し、出
現したコロニーについて以下のスクリーニング操作を行
う。
【００３０】
【表２】
【００３１】１）２，６−ジメチルナフタレン資化欠損
株選抜のネガティブスクリーニング：コロニーを形成し
ている菌株をＫＦ及びＫ（表２）寒天培地にそれぞれレ
プリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培養す
る。そしてＫ寒天培地で未生育な株、およびＫＦ寒天培
地で生育した株を選択する。
株選抜のネガティブスクリーニング：コロニーを形成し
ている菌株をＫＦ及びＫ（表２）寒天培地にそれぞれレ
プリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培養す
る。そしてＫ寒天培地で未生育な株、およびＫＦ寒天培
地で生育した株を選択する。
【００３２】２）蛍光及び目視によるポジティブスクリ
ーニング：コロニーを形成している菌株をＫＦ寒天培地
にレプリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培
養する。トランスイルミネーターでＵＶを当て蛍光色を
観察するか、または直接蓄積物の目視観察をし、陽性で
ある株を選択する。
ーニング：コロニーを形成している菌株をＫＦ寒天培地
にレプリカし、２，６−ジメチルナフタレンを噴霧し培
養する。トランスイルミネーターでＵＶを当て蛍光色を
観察するか、または直接蓄積物の目視観察をし、陽性で
ある株を選択する。
【００３３】上記の方法により、１）法から６株、２）
法から７株の菌株を生産候補株として選抜し、さらに、
これらの生産候補株について選抜を重ねた結果、生産能
力、交換能において特に優れた菌株として、スフィンゴ
モナス・パウチモビリス Ｍ２００−９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４９８０）株を取得するに至った。
法から７株の菌株を生産候補株として選抜し、さらに、
これらの生産候補株について選抜を重ねた結果、生産能
力、交換能において特に優れた菌株として、スフィンゴ
モナス・パウチモビリス Ｍ２００−９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４９８０）株を取得するに至った。
【００３４】次に、取得した本発明の変異微生物、スフ
ィンゴモナス・パウチモビリス Ｍ２００−９株（以
下、Ｍ２００−９株と称す。）を一例に実施例を示す。
ィンゴモナス・パウチモビリス Ｍ２００−９株（以
下、Ｍ２００−９株と称す。）を一例に実施例を示す。
【００３５】
【実施例２】 増殖菌体生産法による２，６−ナフタレンジカルボン酸
生産試験 表２に示すＫＦ培地にＭ２００−９株、および比較のた
め親株であるスフィンゴモナス・パウチモビリスＡ−７
株を植菌し、３０℃、３００ｒｐｍにて一晩、前培養を
行う。培養後、デカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，
６−ジメチルナフタレン溶液５ｍｌとＫＦ培地５ｍｌの
二相系培養液が入ったＬ字管に前培養液を０．１ｍｌ
（培地に対し１％）植菌し、３０℃、３００ｒｐｍにて
７日間の本培養を行った。培養後、本培養液中の２，６
−ナフタレンジカルボン酸の生産量を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）で測定すると共に、変換率を評
価するためデカリン中の２，６−ジメチルナフタレン残
量を、ガスクロマトグラフィーで測定した。結果を表３
に示した。尚、実施例における変換率は、数１に示す式
によって求めた。
生産試験 表２に示すＫＦ培地にＭ２００−９株、および比較のた
め親株であるスフィンゴモナス・パウチモビリスＡ−７
株を植菌し、３０℃、３００ｒｐｍにて一晩、前培養を
行う。培養後、デカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，
６−ジメチルナフタレン溶液５ｍｌとＫＦ培地５ｍｌの
二相系培養液が入ったＬ字管に前培養液を０．１ｍｌ
（培地に対し１％）植菌し、３０℃、３００ｒｐｍにて
７日間の本培養を行った。培養後、本培養液中の２，６
−ナフタレンジカルボン酸の生産量を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）で測定すると共に、変換率を評
価するためデカリン中の２，６−ジメチルナフタレン残
量を、ガスクロマトグラフィーで測定した。結果を表３
に示した。尚、実施例における変換率は、数１に示す式
によって求めた。
【００３６】
【表３】
【００３７】
【数１】
【００３８】
【実施例３】 休止菌体反応生産法による２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸生産試験 Ｌ培地にＭ２００−９株、および比較のためスフィンゴ
モナス・パウチモビリスＡ−７株を植菌し、３０℃、３
００ｒｐｍにて一晩、前培養を行う。培養後、．遠心分
離により集菌し、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
１回洗浄した後、同燐酸緩衝液５ｍｌに懸濁する。この
懸濁液とデカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジ
メチルナフタレン溶液５ｍｌとを混合し、Ｌ字管にて３
０℃、３００ｒｐｍで７日間の休止菌体反応を行った。
実施例２と同様に２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産量及びデカリン中の２，６−ジメチルナフタレン残量
を測定した。得られた結果を表４に示した。
ン酸生産試験 Ｌ培地にＭ２００−９株、および比較のためスフィンゴ
モナス・パウチモビリスＡ−７株を植菌し、３０℃、３
００ｒｐｍにて一晩、前培養を行う。培養後、．遠心分
離により集菌し、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
１回洗浄した後、同燐酸緩衝液５ｍｌに懸濁する。この
懸濁液とデカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジ
メチルナフタレン溶液５ｍｌとを混合し、Ｌ字管にて３
０℃、３００ｒｐｍで７日間の休止菌体反応を行った。
実施例２と同様に２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産量及びデカリン中の２，６−ジメチルナフタレン残量
を測定した。得られた結果を表４に示した。
【００３９】
【表４】
【００４０】上記結果から明らかなように、Ａ−７株と
比較して、生産量及び変換率のいずれもが顕著に向上し
ていることが判った。
比較して、生産量及び変換率のいずれもが顕著に向上し
ていることが判った。
【００４１】
【実施例４】 反応液の交換を行った休止菌体反応生産法による２，６
−ナフタレンジカルボン酸生産試験 ＫＦ培地を用いて、Ｍ２００−９株凍結保存菌体から１
０ｍｌ、１００ｍｌ、３リットルと植え継いで、４Ｋ２
Ｆ培地（表２）２０リットルを仕込んだ３０リットル容
量のジャーファーメンターに２リットル植菌した。培地
は全て培養前に蒸気滅菌して。温度３０℃、通気量２０
リットル／分、攪拌速度１５０ｒｐｍの条件で９時間培
養した後、遠心分離機にて菌体を低温（氷温）環境下で
集菌した。
−ナフタレンジカルボン酸生産試験 ＫＦ培地を用いて、Ｍ２００−９株凍結保存菌体から１
０ｍｌ、１００ｍｌ、３リットルと植え継いで、４Ｋ２
Ｆ培地（表２）２０リットルを仕込んだ３０リットル容
量のジャーファーメンターに２リットル植菌した。培地
は全て培養前に蒸気滅菌して。温度３０℃、通気量２０
リットル／分、攪拌速度１５０ｒｐｍの条件で９時間培
養した後、遠心分離機にて菌体を低温（氷温）環境下で
集菌した。
【００４２】菌体を０．１Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６．
６）に懸濁し、同緩衝液で２リットルにメスアップし
た。次にこれを、５リットル容量のミニジャーファーメ
ンターに、全量導入し、デカリンに溶解した１％（Ｗ／
Ｖ）２，６−ジメチルナフタレン溶液１リットルを加
え、温度２０℃、通気量２リットル／分、攪拌速度３０
０ｒｐｍの条件で休止菌体反応を行った。
６）に懸濁し、同緩衝液で２リットルにメスアップし
た。次にこれを、５リットル容量のミニジャーファーメ
ンターに、全量導入し、デカリンに溶解した１％（Ｗ／
Ｖ）２，６−ジメチルナフタレン溶液１リットルを加
え、温度２０℃、通気量２リットル／分、攪拌速度３０
０ｒｐｍの条件で休止菌体反応を行った。
【００４３】以降２４時間後および４８時間後に、菌体
を集菌して、新たな０．１Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６．
６）とデカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジメ
チルナフタレン溶液を用い、上記と同様な操作および条
件で反応を繰り返し、９６時間後に反応を終了した。
尚、反応液中の２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産
量及び２，６−ジメチルナフタレン残量は反応液交換時
および反応終了時に評価し、９６時間後における２，６
−ナフタレンジカルボン酸の総生産量を求めた。一方、
反応液の交換効果を比較するため、反応液を交換するこ
と以外は他の条件と同一にして、無交換における生産試
験を９６時間実施した。得られた結果を表５に示した。
を集菌して、新たな０．１Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６．
６）とデカリンに溶解した１％（Ｗ／Ｖ）２，６−ジメ
チルナフタレン溶液を用い、上記と同様な操作および条
件で反応を繰り返し、９６時間後に反応を終了した。
尚、反応液中の２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産
量及び２，６−ジメチルナフタレン残量は反応液交換時
および反応終了時に評価し、９６時間後における２，６
−ナフタレンジカルボン酸の総生産量を求めた。一方、
反応液の交換効果を比較するため、反応液を交換するこ
と以外は他の条件と同一にして、無交換における生産試
験を９６時間実施した。得られた結果を表５に示した。
【００４４】
【表５】
【００４５】上記結果から、反応液を交換した生産方法
は、交換しない生産方法に比べて、生産性にすぐれてい
ることが明らかとなった。
は、交換しない生産方法に比べて、生産性にすぐれてい
ることが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】本発明によれば、基質を含有した有機溶
媒と培地および／または緩衝液からなる二相系におい
て、２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌由来の変換
能を向上させた変異微生物、及び該微生物の休止菌体ま
たは菌体由来の酵素を利用することで、２，６−ジメチ
ルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産を効率よく行うことができ、特に工業的見地からすぐ
れている。
媒と培地および／または緩衝液からなる二相系におい
て、２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌由来の変換
能を向上させた変異微生物、及び該微生物の休止菌体ま
たは菌体由来の酵素を利用することで、２，６−ジメチ
ルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸の生
産を効率よく行うことができ、特に工業的見地からすぐ
れている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (6)
- 【請求項１】 スフィンゴモナス属に属し、有機溶媒介
在型二相系において２，６−ジメチルナフタレンの両メ
チル基末端酸化能を有する２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸生産菌由来で、かつ２，６−ナフタレンジカルボン
酸への変換能を向上させたことを特徴とする変異微生
物。 - 【請求項２】 請求項１記載の変異微生物がスフィンゴ
モナス・パウチモビリス Ｍ２００−９（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４９８０）株であることを特徴とする変異微生物。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の変異微生物を用
い、２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と
培地からなる二相系培養液において培養し、２，６−ナ
フタレンジカルボン酸を生成させることを特徴とする
２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の変異微生物を用
い、２，６−ジメチルナフタレンを含有する有機溶媒と
培地からなる二相系培養液において培養し、集菌後、そ
の菌体もしくは休止菌体、又はその処理物もしくは菌体
由来の酵素を用いて、２，６−ジメチルナフタレンを含
有する有機溶媒と培地および／または緩衝液からなる二
相系反応液において反応させ、２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸を生成もしくは変換させることを特徴とする
２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法。 - 【請求項５】 請求項３記載の製造法において、二相系
培養液を供給および／または交換して培養することを特
徴とする２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法。 - 【請求項６】 請求項４記載の製造法において、二相系
培養液を供給および／または交換して培養し、および／
または、二相系反応液を供給および／または交換して反
応させることを特徴とする２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18326095A JPH099956A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 変異微生物及び該微生物を用いた２，６− ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18326095A JPH099956A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 変異微生物及び該微生物を用いた２，６− ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH099956A true JPH099956A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=16132560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18326095A Pending JPH099956A (ja) | 1995-06-28 | 1995-06-28 | 変異微生物及び該微生物を用いた２，６− ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH099956A (ja) |
-
1995
- 1995-06-28 JP JP18326095A patent/JPH099956A/ja active Pending
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