发明内容
本发明的目的在于提供一种β地中海贫血突变检测试剂盒,利用本试剂盒可以检测27种β-地中海贫血突变。
为了解决上述任务,本发明的具体技术路线为:
1)根据β-Globin基因序列设计PCR引物,设计的引物能够包括β-地中海贫血全部突变位点。设计的引物可由专业的合成公司合成,如:上海生工等。对上述引物的下游部分或上游和下游进行生物素或其它基团的标记,使得扩增的产物中含有相应的标记,以便在杂交后对杂交结果进行分析。
2)在包含所述引物的PCR试剂中,使用三重不对称PCR进行扩增,不对称PCR的一个突出优势为PCR完成后可直接用于杂交而不需要通过热变性或者碱变性,扩增产物中具有可与β-Globin基因突变探针特异性结合的DNA序列,可直接用于杂交实验。PCR反应试剂涉及的组分可以使用市售的产品,如:NEB公司生产的Taq 5×MasterMix,Fermentas公司生产的热启动酶等。
3)根据β-Globin基因公开文献报道的位点和基因多态性的突变类型设计检测探针,设计的探针可以在正义链和/或反义链。设计的探针可由专业的合成公司合成,如:上海生工等。
4)将上述探针点在经过活化的杂交膜上,并加入扩增产物,在杂交体系中,通过高浓度的盐离子溶液非选择性的结合靶基因,然后通过低浓度的盐离子浓度进行选择性的洗脱,随后交联特性性结合的酶,最后加入酶的底物显色。
为了达到上述检测步骤,本发明提供的β地中海贫血突变检测试剂盒由PCR试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成。
根据本发明一个优选的实施方案,PCR试剂可使用两种反应体系,分别为热启动酶反应体系或Taq酶反应体系,其中热启动酶反应体系由扩增待检样品中DNA的三对PCR引物、热启动酶及PCR反应的其它常规组分组成,Taq酶反应体系由扩增待检样品中DNA的三对PCR引物、Taq酶及PCR反应的其它常规组分组成,其特征在于PCR试剂的三对PCR引物分别为1F-β(SEQ ID NO:1)&1R-β(SEQ ID NO:2),2F-β(SEQ ID NO:3)&2R-β(SEQ ID NO:4)和3F-β(SEQ ID NO:5)&3R-β(SEQ ID NO:6),序列如下:
引物名称 |
序列编号 |
序列(5′→3′) |
1F-β |
SEQ ID NO:1 |
AGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGG |
1R-β |
SEQ ID NO:2 |
CCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACC |
2F-β |
SEQ ID NO:3 |
GATAGGCACTGACTCTCTCTGC |
2R-β |
SEQ ID NO:4 |
GAACTTAACCATAGAAAAGAAGG |
3F-β |
SEQ ID NO:5 |
GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC |
3R-β |
SEQ ID NO:6 |
CACACAGACCAGCACGTTGCCCAGGAGC |
热启动酶反应体系中的热启动酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品,如NEB公司生产的产品,并参照市售产品的说明书配制。
Taq酶反应体系中Taq酶和PCR反应的其它常规组分均可以使用市售产品,如Fermentas公司生产的产品,并参照市售产品的说明书配制。
根据本发明的实施方案,PCR试剂中三对PCR引物的终浓度分别为0.5μM~40μM,其中优选的方案是上游引物(SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5)终浓度为1μM,下游引物(SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6)终浓度为10μM。
根据本发明一个优选的实施方案,低密度芯片由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜、点在膜上的检测β-Globin基因突变位点的特异性探针组成,其特征在于特异性探针的序列如下:
探针名称 |
序列编号 |
序列(5′→3′) |
TATA 32-N |
SEQ ID NO:7 |
TGGGCATAAAAGTCAGTG |
TATA32-M |
SEQ ID NO:8 |
TGGGAATAAAAGTCAGGTG |
TATA30-N |
SEQ ID NO:9 |
GGCATAAAAGTCAGGGCTA |
TATA30-M |
SEQ ID NO:10 |
GGCACAAAAGTCAGGGCTA |
TATA29-N |
SEQ ID NO:11 |
GCATAAAAGTCAGGGCATG |
TATA29-M |
SEQ ID NO:12 |
GCATGAAAGTCAGGGCATG |
TATA28-N |
SEQ ID NO:13 |
GCATAAAAGTCAGGGCAGATG |
TATA28-M |
SEQ ID NO:14 |
GCATAGAAGTCAGGGCAGATG |
Cap+1-N |
SEQ ID NO:15 |
CTATCTATTGCTTACATTTG |
Cap+1-M |
SEQ ID NO:16 |
CTATCTATTGCTTCCATTTG |
Cap40-43-N |
SEQ ID NO:17 |
GCAACCTCAAACAGACA |
Cap40-43-M |
SEQ ID NO:18 |
GCAACCTCAGACACCAT |
Innitiation-N |
SEQ ID NO:19 |
CTAAACAGACACCATGGTG |
Innitiation-M |
SEQ ID NO:20 |
CTAAACAGACACCAGGGTG |
CD8-N |
SEQ ID NO:21 |
CTGAGGAGAAGTCTGC |
CD8-M |
SEQ ID NO:22 |
CTGAGGAGGTCTGCCG |
CD8/9-N |
SEQ ID NO:23 |
CTGAGGAGAAGTCTGC |
CD8/9-M |
SEQ ID NO:24 |
TGAGGAGAAGGTCTGC |
CD14/15-N |
SEQ ID NO:25 |
TTACTGCCCTGTGGG |
CD14/15-M |
SEQ ID NO:26 |
TTACTGCCCTGGTGG |
CD17-N |
SEQ ID NO:27 |
CTCCTGTGGGGCAAGGTGA |
CD17-M |
SEQ ID NO:28 |
CTCCTGTGGGGCTAGGTGA |
CD19-N |
SEQ ID NO:29 |
GGTGAACGTGGATGAAGTTAG |
CD19-M |
SEQ ID NO:30 |
GGTGGACGTGGATGAAGTTAG |
CD26-N |
SEQ ID NO:31 |
GTAAGTTGGTGGTGAGGC |
CD26-M |
SEQ ID NO:32 |
GTAAGTTGGTGGTAAGGC |
CD27/28-N |
SEQ ID NO:33 |
TGGTGAGGCCCTGG |
CD27/28-M |
SEQ ID NO:34 |
TGGTGAGGCCCCTG |
CD30-N |
SEQ ID NO:35 |
CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC |
CD30-M |
SEQ ID NO:36 |
CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC |
CD31-N |
SEQ ID NO:37 |
CTTAGGCTGCTGGTGGTC |
CD31-M |
SEQ ID NO:38 |
CCTTAGGTGCTGGTGGTC |
CD37-N |
SEQ ID NO:39 |
CCTTGGACCCAGAGGTTAC |
CD37-M |
SEQ ID NO:40 |
CCTTAGACCCAGAGGTTAC |
CD41-N |
SEQ ID NO:41 |
TGGACCCAGAGGTTCTTTG |
CD41-M |
SEQ ID NO:42 |
TGGACCCAGAGGTTTCTTTG |
CD41/42-N |
SEQ ID NO:43 |
GGTTCTTTGAGTCCTTTG |
CD41/42-M |
SEQ ID NO:44 |
GGTTGAGTCCTTTGGGGA |
CD43-N |
SEQ ID NO:45 |
CTTTGAGTCCTTTGGGGACT |
CD43-M |
SEQ ID NO:46 |
CTTTTAGTCCTTTGGGGACT |
71/72-N |
SEQ ID NO:47 |
GGTGCCTTTAGTGATGG |
71/72-M |
SEQ ID NO:48 |
TCGGTGCCTTTTAGTGATG |
CD95-N |
SEQ ID NO:49 |
ACTGTGACAAGCTGCAC |
CD95-M |
SEQ ID NO:50 |
ACTGTGACAAAGCTGCAC |
IVSI-1-N |
SEQ ID NO:51 |
GGCAGGTTGGTATCAAGT |
IVSI-1-M |
SEQ ID NO:52 |
GGCAGTTTGGTATCAAGT |
IVSII-1-N |
SEQ ID NO:53 |
GTTGGTATCAAGGTTACTA |
IVSII-1-M |
SEQ ID NO:54 |
GTTGCTATCAAGGTTACAA |
IVSII-5-N |
SEQ ID NO:55 |
GTAACTTCAGGGTGAGTCT |
IVSII-5-M |
SEQ ID NO:56 |
GTAACTTCAGGGTGACTCT |
IVSII-nt654-N |
SEQ ID NO:57 |
TAAGGCAATAGCAATATAC |
IVSII-nt654-M |
SEQ ID NO:58 |
TAAGGTAATAGCAATATAC |
显色控制点 |
SEQ ID NO:59 |
GCCGTAACCGTCACAATCCGT |
特异性探针中用于检测没有发生突变的位点为正常探针(用N表示),用于检测发生突变的位点为突变探针(用M表示),检测位点包括TATA 32,TATA 30,TATA29,TATA28,Cap+1,Cap40-43,Inititaion,CD8,CD8/9,CD14/15,CD17,CD19,CD26,CD27/28,CD30,CD31,CD37,CD41/42,CD41,CD43,CD71/72(+A),CD71/72(+T),CD95,IVSI-1,IVSI-5,IVSII-5,IVSII-654的一个或一个以上的组合。
根据本发明的实施方案,低密度芯片中特异性探针的终浓度分别为1μM~10μM,其中优选的方案是5μM。
根据本发明的实施方案,杂交试剂由杂交液I、杂交液II、酶、显色液组成,其中杂交液I的组成为1~6×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是2×SSC,0.5%SDS;杂交液II的组成为0.1~1×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是0.5×SSC,0.5%SDS。
根据本发明另一个优选的实施方案,其中酶为辣根过氧化物酶,用量为0.005U~1U/ml,优选的用量为0.1U。使用不同的酶需要使用与之相匹配的显色系统,辣根过氧化物酶的显色底物可以是3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine(简称TMB),显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH4.9),0.42mM TMB,0.004%H2O2(v/v);也可以使用1,2-phenylenediamine(简称OPD),显色液优选的方案为50mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,pH5.0,4mM OPD,0.004%H2O2(v/v);或其它能与辣根过氧化物酶结合的底物。
本试剂盒将靶基因分为三个片段,分别设计β-Globin扩增引物,并结合β-Globin基因突变位点的特异性探针,同时也覆盖了多达27个β-Globin基因突变检测位点,避免常规检测产品可能造成的β地中海贫血患者漏检。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的本质,通过对本发明实施方式的描述,详细说明但不限制本发明。实施例中使用的组分,除特殊说明外,均选用发明内容中的优选方案。
实施例1样品靶核酸的制备
1)6例临床收集的EDTA抗凝全血,轻轻颠倒玻璃管混合5~10次。
2)取一个1.5ml洁净离心管,用Mark笔在管盖做好标记。将300μl混匀抗凝血加入离心管中,加入1ml灭菌双蒸水充分混匀,室温放置3分钟。
3)室温下3000rpm离心5分钟。弃上清,保留褐红色沉淀。
4)重复以上步骤1次。尽可能吸除残存液体。
5)加入DNA提取液(5%Chelex-100)充分混匀。100℃水浴10分钟,10000rpm离心5分钟,-20℃保存备用。
实施例2靶核酸的PCR扩增
PCR试剂使用了热启动酶或者Taq酶反应体系,分别为热启动酶反应体系和Taq酶反应体系,其中Taq酶由NEB公司生产,热启动酶由Fermentas生产,10×热启动PCR缓冲液和Taq 5×Master Mix也均为市售,反应体系的制备如下:
PCR反应体系,直接加入2μl提取的DNA模板,瞬时(3秒)离心后,将各反应管放人PCR仪中。
热启动酶反应体系扩增条件:95℃15min,然后94℃30s,56℃45s,72℃60s,运行45个循环,最后72℃7min。
Taq酶反应体系扩增条件:94℃5min,然后94℃30s,56℃45s,72℃60s,运行45个循环,最后72℃7min。
扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图1),从电泳结果可以得出结论:热启动酶反应体系和Taq酶反应体系均可成功扩增出目的条带,其中1F-β&1R-β扩增条带为427bp,2F-β&2R-β扩增条带为327bp,3F-β&3R-β扩增条带为281bp。
实施例3低密度基因芯片的制备
低密度基因芯片载体为尼龙膜,膜条使用前需用10%的EDC-HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,Sigma公司)溶液充分浸泡活化60分钟纯水洗涤2次每次3分钟,然后室温晾干。探针冻干粉12000rpm离心5分钟,然后用灭菌的纯水溶解成10μM后,按每孔1.0μl直接在膜条的适当位置上以固定格式点样,如下:
低密度基因芯片探针阵列
点样后室温放置2小时,用0.1M NaOH溶液处理膜条10分钟并用蒸馏水充分洗涤,室温晾干后保存于4℃备用。
实施例4反向斑点杂交检测(Streptavidin-POD/TMB显色系统)
经测序验证的核酸,包括正常人、IVS II-nt654杂合子、CD41/42杂合子、CD17杂合子、TATA28纯合子、CD26纯合子、CD41/42纯合子,另外还包括以下型别的核酸:TATA 32、TATA 30、TATA 29、Cap+1、Cap40-43、Initiation、CD8、CD8/9、CD14/15、CD19、CD27/28、CD30、CD31、CD37、CD41、CD43、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、CD95、IVSI-1、IVSI-5、IVSII-5,核酸扩增使用Taq酶反应体系及相应扩增条件进行,其扩增产物用于反向斑点杂交。反向斑点杂交过程包括以下几个步骤:核酸杂交、结合的核酸与酶交联及非特异性结合核酸的洗脱、与酶底物结合显色、杂交结果分析。下面详细说明各步骤的操作。
(1)核酸杂交
待检测DNA经多重不对称PCR扩增后的产物,与标记对应编号的低密度基因芯片一并放入15ml离心管,加入6-9ml杂交液I,42℃杂交4小时。其中,膜条编号对应的核酸测序型别是:1为β-Globin正常,2为IVS II-nt654杂合子,3为CD41/42杂合子,4为CD17杂合子,5为TATA28纯合子,6为CD26纯合子,7为CD41/42纯合子,8同时加入TATA 32,TATA30,TATA29,TATA28,Cap+1,Cap40-43,Initiation,CD8,CD8/9,CD14/15,CD17,CD19,CD26,CD27/28,CD30,CD31,CD37,CD41/42,CD41,CD43,CD71/72(+A),CD71/72(+T),CD95,IVSI-1,IVSI-5,IVSII-5,IVSII-654型别核酸扩增产物的混合物。
(2)结合的核酸与酶交联及非特异性结合核酸的洗脱
预热至42℃的杂交液II加入0.1U Streptavidin-POD,42℃轻摇15分钟。
(3)与酶底物结合显色
弃去含Streptavidin-POD的杂交液II,加入显色液,显色10分钟。
(4)杂交结果分析
弃去显色液,用蒸馏水洗涤两次,每次2-3分钟。吸水纸吸干低密度基因芯片表面的水,在扫描仪上扫描,实验结果显示,本发明试剂盒的判读结果与测序结果完全一致(详见附图2)。
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120>β地中海贫血突变检测试剂盒
<140>
<141>
<160>59
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>1
agtagcaatttgtactgatggtatgg
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>2
cccagtttctattggtctccttaaacc
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>3
gataggcactgactctctctgc
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>4
gaacttaaccatagaaaagaagg
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>5
gtatcatgcctctttgcaccattc
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作PCR引物。
<400>26
cacacagaccagcacgttgcccaggagc
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>7
tgggcataaaagtcagtg
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>8
tgggaataaaagtcaggtg
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>9
ggcataaaagtcagggcta
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>10
ggcacaaaagtcagggcta
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>11
gcataaaagtcagggcatg
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>12
gcatgaaagtcagggcatg
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>13
gcataaaagtcagggcagatg
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>14
gcatagaagtcagggcagatg
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>15
ctatctattgcttacatttg
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>16
ctatctattgcttccatttg
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>17
gcaacctcaaacagaca
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>18
gcaacctcagacaccat
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>19
Ctaaacagacaccatggtg
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>20
ctaaacagacaccagggtg
<210>21
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>21
ctgaggagaagtctgc
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>22
ctgaggaggtctgccg
<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>23
ctgaggagaagtctgc
<210>24
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>24
tgaggagaaggtctgc
<210>25
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>25
ttactgccctgtggg
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>26
ttactgccctggtgg
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>27
ctcctgtggggcaaggtga
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>28
ctcctgtggggctaggtga
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>29
ggtgaacgtggatgaagttag
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>30
ggtggacgtggatgaagttag
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>31
gtaagttggtggtgaggc
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>32
gtaagttggtggtaaggc
<210>33
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>33
tggtgaggccctgg
<210>34
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>34
tggtgaggcccctg
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>35
cttaggctgctggtggtctac
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>36
cttaggctgctggtggtctac
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>37
cttaggctgctggtggtc
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>38
ccttaggtgctggtggtc
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>39
ccttggacccagaggttac
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>40
ccttagacccagaggttac
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>41
tggacccagaggttctttg
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>42
tggacccagaggtttctttg
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>43
ggttctttgagtcctttg
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>44
ggttgagtcctttgggga
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>45
ctttgagtcctttggggact
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>46
cttttagtcctttggggact
<210>47
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>47
ggtgcctttagtgatgg
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>48
tcggtgccttttagtgatg
<210>49
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>49
actgtgacaagctgcac
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>50
actgtgacaaagctgcac
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>51
ggcaggttggtatcaagt
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>52
ggcagtttggtatcaagt
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>53
gttggtatcaaggttacta
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>54
gttgctatcaaggttacaa
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>55
gtaacttcagggtgagtct
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>56
gtaacttcagggtgactct
<210>57
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>57
taaggcaatagcaatatac
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
<400>58
taaggtaatagcaatatac
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计,以用作低密度基因芯片杂交反应探针。
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gccgtaaccgtcacaatccgt