CN103484538B - 检测肠球菌耐药性的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测肠球菌耐药性的组合物和方法，其特征在于利用一对或多对特异性引物和多重PCR方法对肠球菌耐药性进行检测，其中组合物包含以下寡核苷酸引物对：肠球菌16s RNA特异性引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；以及以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对：aac-aph特异性引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，tetM特异性引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，ermB特异性引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，TEM特异性引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10以及aad特异性引物对：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。使用本发明，能够简便、快速、灵敏度高且特异性强地测定食品中肠球菌的耐药性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用于检测肠球菌耐药性的组合物，使用所述组合物进行的PCR检测方法以及该组合物在实际样品检测中的应用。
背景技术
肠球菌(Enterococcus)属链球菌科，是人类和动物肠道正常菌群的一部分。肠球菌是圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。该菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。在血平板上经37℃培养18小时后，可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径0.5～1mm大小的圆形菌落，不同的菌株表现为不同的溶血现象。
根据其利用糖类的特征可将肠球菌分为3组：第一组以鸟肠球菌(E.avium)为代表，包括灰黄色肠球菌(E.givusl)、病臭肠球菌(E.malodoratus)、淡黄色肠球菌(E.paenlls)等；第二组以粪肠球菌(E.faecalis)为代表，包括尿肠球菌(E.faecium)、血过氧化物肠球菌(E.haemoperoxidus)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)等；第三组以坚韧肠球菌(E.durans)为代表，包括小肠肠球菌(E.dispar)、鼠肠球菌(E.ratti)、绒毛肠球菌(E.villorum)、殊异肠球菌(E.dispar)等，其中对人类致病的主要为粪肠球菌和尿肠球菌。
肠球菌存在于人类和动物的口腔、阴道，是肠道的正常菌群之一，且广泛分布于自然界，通常不引起发病，是一种重要的条件致病菌。近些年，随着存在于食品中的肠球菌成为人们食物中毒的主要原因，才引起广泛关注。随着肠球菌耐药菌株的日益增加，感染后治疗也越来越困难。不同的肠球菌耐药性不同所用的抗生素也随之不同，故耐药基因的检测就显得尤为重要。
面对日趋严重的细菌耐药问题，为了维护人们的正常生活及控制肠球菌病，国内外许多学者采用了多种手段对肠球菌耐药基因进行研究，常用的方法有药敏试验、PCR、荧光PCR、K-B法等。由于肠球菌中含有的耐药基因易受种及来源等因素的影响，成分相对复杂；尤其是近年来随着抗菌药物的广泛应用，使许多单一检测耐药基因的传统方法不再快速、有效。
现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析菌株的耐药性和耐药机制，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明菌株的耐药性提供了真实、可靠的依据，给菌种鉴别、菌种耐药性研究等菌株相关研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力的研究方向。
聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。
多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR反应相同。其特点有：①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体；②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测；③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。
目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测肠球菌对抗生素耐药性的方法。
因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的肠球菌耐药性检测方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供检测肠球菌耐药性的组合物。
本发明的另一目的在于，提供检测肠球菌特耐药性的多重PCR检测方法。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
一方面，本发明提供了利用多重PCR方法检测肠球菌耐药性的组合物，所述组合物包含针对肠球菌特异性16S rRNA的特异性引物对以及针对以下五种耐药基因中一种或多种的寡核苷酸引物对，所述引物对针对通过GenBank获得的肠球菌五种耐药基因：氨基糖苷类耐药基因aac-aph(aminoglycoside acetyltransferases-aminoglycosidephosphotransferases)、四环素耐药基因（tetM）、氨基糖苷类耐药基因aad(alcoholacetaldehyde dehydrogenase)、β内酰胺类耐药基因(TEM)、红霉素耐药基因ermB。
在一个实施方式中，针对肠球菌特异性16S rRNA的特异性引物对为：
16S rRNA-F：GTGTCGCTGATGGATGG(SEQ ID No.1)
16S rRNA-R：GCAAGCCGAACTGAGAGA(SEQ ID No.2)，
扩增产物为1096bp；
氨基糖苷类耐药基因aac-aph的特异性引物对为：
aac-aph-F：ACAGAGCCTTGGGAAGATGA(SEQ ID No.3)
aac-aph-R：CTCCAATAATTTGGCTCTCCT(SEQ ID No.4)，
扩增产物为176bp；
四环素耐药基因tetM的特异性引物对为：
tetM-F：TGAAAATCCGCACCCTCTAC(SEQ ID No.5)
tetM-R：ACTGCATTCCACTTCCCAAC(SEQ ID No.6)，
扩增产物为362bp；
红霉素耐药基因ermB的特异性引物对为：
ermB-F：AAAGGGCATTTAACGACGAA(SEQ ID No.7)
ermB-R：CTGTGGTATGGCGGGTAAGT(SEQ ID No.8)，
扩增产物为424bp；
β内酰胺类耐药基因TEM的特异性引物对为：
TEM-F：TTTGCCTTCCTGTTTTTGCT(SEQ ID No.9)
TEM-R：TTGCCGGGAAGCTAGAGTAA(SEQ ID No.10)，
扩增产物为560bp；
氨基糖苷类耐药基因aad的特异性引物对为：
aad-F：TGACCCTGGTATGGTCCAAT(SEQ ID No.11)
aad-R：ATCCCGGTATCTGCTGTGAC(SEQ ID No.12)，
扩增产物为501bp。
一方面，本发明提供了检测肠球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于检测肠球菌耐药性的组合物。
另一方面，本发明提供了检测肠球菌耐药性的方法，所述方法包括使用本发明用于检测肠球菌耐药性的组合物或试剂盒进行多重PCR扩增的步骤。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。因此可以同时检测整个多重PCR反应过程中所有引物和DNA的结合情况，并最终检测出待测样品的耐药基因，从而可检测待测肠球菌的耐药性。
在一个实施方式中，多重PCR反应体系（25μL）包含：10×PCR缓冲液（含Mg2+），2.5μL；dNTPs（2.5mol/μL），2μL；Taq DNA聚合酶（5U/μL），0.2μL；SEQ ID Nos.1-12(10μM)均为3μL；混合模板DNA，3μL；余量为去离子水。
在一个实施方式中，多重PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
本发明的多重PCR检测方法采用一管同时检测，无需多步PCR处理，节省了时间。本发明的方法巧妙地运用了多重PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和多重检测技术的快速和简便性，具有操作简单、省时省力和结果可靠等优点。使用本发明的多重PCR检测方法，其简单、快速且特异的特点适合用于肠球菌耐药性的检测。
附图说明
图1是肠球菌属16s rRNA特异性引物对检测，其中1-27为27株肠球菌属菌株显示为阳性，28-42为2株气球菌属菌株、10株链球菌属菌株、3株明串珠菌属菌株共计15株阴性对照菌株均未见条带出现，43为空白对照。
图2是所示多重PCR检测肠球菌特异性及耐药基因的结果，其中1是aph基因扩增产物、2是tetM基因扩增产物、3是ermB基因扩增产物、4是aad基因扩增产物、5是TEM基因扩增产物、6是16S rRNA基因扩增产物、7是6重PCR扩增产物、8是空白对照。
图3是检测肠球菌特异性及耐药基因组合的灵敏度结果，其中1-5中进行多重PCR扩增的DNA溶液的浓度依次为20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL，6是空白对照。
图4是21株食品分离菌株的检测结果，其中1是阳性对照，C为空白对照，2-22号样品分别为食品分离株。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：不同菌株DNA提取
待测链球菌科菌株均来自中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心，具体为：27株肠球菌属菌株、2株气球菌属菌株、10株链球菌属菌株、3株明串珠菌属菌株。菌株目录见下表1。
表1：待提取DNA的菌株
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)；PCR仪(ABI VERITI96Well Applied Biosystems，USA)；高速台式离心机(Pico17Thermo)；分子成像系统(4000MP伯乐)。
所使用的主要检测试剂：
MRS培养基、脑心浸液培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；无水乙醇购于北京六合通公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；PCR反应用的10×缓冲液(含Mg2+)、dNTPs、Ex taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司。
按照天根生化科技的DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取。具体地，将菌液在液体培养基(明串珠菌属菌株用MRS培养基，其余用脑心浸液培养基)中37℃(嗜热链球菌42℃)过夜培养。取细菌培养液1-5mL，10,000rmp离心1分钟，吸净上清。向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。加入220μL缓冲液GB，震荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心去除管盖内壁的水珠。加220μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，已彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。
实施例2：验证针对16S rRNA的引物序列的特异性
根据肠球菌16S rRNA序列在不同肠球菌属菌株中的保守性特点，设计了上下游引物扩增肠球菌。其中，引物序列为：16S rRNA-F：GTGTCGCTGATGGATGG(SEQ ID No.1)，16S rRNA-R：GCAAGCCGAACTGAGAGA(SEQ ID No.2)。引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。预期扩增产物片段为1096bp。
PCR扩增体系为：10×Buffer（含Mg2+）2.5μL、dNTPs（2.5mol/μL）1μL、SEQ ID Nos.1和2(10μM)各0.5μL、Taq酶（5U/μL）0.2μL，实施例1中提取的菌株DNA模板2μL，加去离子水补至25μL。
所述PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
将扩增产物进行凝胶电泳，结果如图1所示。
如图1所示，27株肠球菌属菌株均出现典型的扩增条带，而其它样品：2株气球菌属菌株、10株链球菌属菌株、3株明串珠菌属菌株及空白对照(ddH2O)均未出现扩增条带，充分说明本实验设计的引物SEQ ID Nos.1和2对肠球菌属菌株表现较好的特异性。
实施例3：肠球菌耐药基因的检测
1）混合DNA模板的制备
按照实施例2的PCR扩增体系和PCR条件扩增各耐药基因和肠球菌的16s RNA基因。
具体地，利用IQCC42201菌株和引物SEQ ID Nos.7和8扩增ermB基因，利用IQCC22233菌株和引物SEQ ID Nos.5和6扩增tetM基因，利用IQCC22298菌株和引物SEQ ID Nos.3和4扩增aac-aph基因，利用菌株IQCC22231和引物SEQ ID Nos.9和10扩增TEM基因，利用菌株IQCC22231和引物SEQ ID Nos.11和12扩增aad基因，利用菌株IQCC22237和引物SEQID Nos.1和2扩增16s RNA基因。
然后，按照Wizard Gel Extraction试剂盒(Promega，美国)的操作说明对PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19-T Vector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将纯化产物与pMD19-T Vector连接，连接体系10μL，组成为：pMD19-T Vector1μL、PCR产物2μL、ddH2O2μL、Solution I5μL，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温(22-37℃)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物10μL于100μL TOP感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃准确热激45s，立即置于冰上1min，然后加入890μL已灭过菌的脑心浸液，37℃、200r/min振荡培养1h。5000r/min低速离心1min，弃800μL上清，将沉淀混匀，取200μL混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37℃过夜培养后置于4℃冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200μg/mL的Amp的脑心浸液中在37℃、200r/min振荡过夜培养。
阳性克隆鉴定：挑取单个白色克隆，进行菌落PCR反应，反应体系和条件同实施例2。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。质粒DNA提取：将鉴定为阳性的菌液用天根生化科技的质粒DNA提取试剂盒进行质粒DNA的提取，获得分别含有16S rRNA、aac-aph、tetM、ermB、TEM和aad扩增片段的阳性质粒。
将上述获得的6种阳性质粒DNA按1:1:1:1:1:1:1制备成混合模板备用。
2）多重PCR
表2：6重PCR反应体系：
| 组分 | 体积(μL) |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5 |
| dNTP（2.5mol/μL） | 2 |
| Taq DNA聚合酶（5U/μL） | 0.2 |
| SEQ ID Nos.5,6(10μM) | 各1 |
| SEQ ID Nos.7,8(10μM) | 各0.5 |
| SEQ ID Nos.3,4(10μM) | 各1.3 |
| SEQ ID Nos.11,12(10μM) | 各0.5 |
| SEQ ID Nos.9,10(10μM) | 各0.3 |
| SEQ ID Nos.1,2(10μM) | 各3 |
| 混合模板(步骤1中制备的) | 3 |
| 加ddH2O | 至总体积为25μL |
注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)
PCR反应参数:
95℃10min；
95℃30s；
57℃ 45s；
72℃45s；
35个循环；
72℃10min。
结果如图2所示，其中1是aph基因、2是tetM基因、3是ermB基因、4是aad基因、5是TEM基因、6是16S rRNA基因、7是6重PCR及8是空白对照，充分说明本实验设计的引物能同时检测肠球菌特异性及五种耐药基因。
实施例4：灵敏度
本实施例为通过如下试验对肠球菌多重PCR引物进行了灵敏度验证。
为确定肠球菌特异性及耐药基因引物组合的绝对检测限，将该混合模板用无菌水分别稀释为20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL的浓度作为PCR模板，分别按实施例2中的多重PCR体系和反应条件进行扩增，结果如图3所示。肠球菌DNA浓度为20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL时有6条特异性扩增条带，而浓度降至2pg/μL以下时，少于6条特异性扩增条带。实验结果表明建立的多重PCR检测方法能够检出肠球菌特异性及耐药基因的含量为2pg/μL。
实施例5
本发明的发明人通过如下试验对分离菌株进行了检测验证。
选取21株食品分离菌株，按照上述多重PCR体系和条件进行多重PCR检测，以确定所建立的多重PCR方法是否具有可行性。
结果如图4所示，21株分离菌株中，3,5,6,7,8.9,10,12,13,14,15,16,17,18为肠球菌均能检出肠球菌16s rRNA基因，5号菌株检出aac-aph、tetM、ermB、TEM四种耐药基因，14号菌株检出tetM耐药基因，2,4,11,19,20,21,22菌株不是肠球菌，未能检出肠球菌16s rRNA基因，但可以检出1-3种耐药基因，表明该方法能有效检测出肠球菌的特异基因，并且可用于其耐药基因的检测。
Claims (3)
1.利用多重PCR方法检测肠球菌耐药性的组合物，所述组合物包含以下寡核苷酸引物对：
肠球菌16s RNA特异性引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；以及
以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对：
aac-aph特异性引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
tetM特异性引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
ermB特异性引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；
TEM特异性引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；和
aad特异性引物对：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
2.用于通过多重PCR方法检测肠球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的组合物。
3.权利要求1所述的组合物在制备用于检测肠球菌耐药性的多重PCR检测的试剂盒中的用途。
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| 多重耐药肠球菌耐药基因筛选及传播机制研究;瞿婷婷;《中国博士学位论文全文数据库》;20070815(第2期);第4页第1段 * |
| 肠球菌属耐药基因检测及耐药性分析;张姝等;《中华医院感染学杂志》;20121231;第22卷(第3期);457-460 * |
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