CN109943655A - 定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物、试剂盒和方法，属于基因工程技术领域。本发明所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述特异性引物能够实现对鼠李糖乳杆菌M9快速准确地定性、定量检测，特异性好、灵敏度高、稳定性好、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物、试剂盒和方法。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)属于乳杆菌属，为革兰氏阳性菌，无质粒，是人体正常菌群之一。其肠道黏着率高，定植能力强，能促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长，且有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。随着技术的发展，越来越多的乳杆菌被发现，使得乳酸菌领域逐渐扩大。鼠李糖乳杆菌M9(Lactobacillus rhamnosusM9，M9)于2017年分离自健康妇女母乳，实验室研究表明，M9对胃肠消化液具有良好的耐受性，且能够以活的状态进入人体肠道，对人体产生有益作用。但目前并没有一种高效的检测方法，实现不同样品中M9的相对含量及其变化。
发明内容
本发明的目的在于提供定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的引物。本发明所述特异性引物能够实现对鼠李糖乳杆菌M9快速准确地定性、定量检测，能够以粪便样品为样本快速定性、定量检测粪便中是否含有鼠李糖乳杆菌M9及其含量，特异性好、灵敏度高、稳定性好、重复性好。
本发明提供了用于定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物的定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的特异性引物。
优选的是，所述试剂盒还包括：标准品和PCR体系。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物或上述技术方案所述试剂盒的定性检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
2)利用所述特异性引物对步骤1)得到的模板DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)对步骤2)得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，263bp处出现单一条带，说明待检测样品中含鼠李糖乳杆菌M9。
优选的是，步骤2)所述PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃变性1min，54℃退火53s，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸7min。
优选的是，步骤3)所述凝胶电泳检测的条件为：电压为5V/cm，电泳时间为20～30min。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物或上述技术方案所述试剂盒的定量检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
(2)利用所述特异性引物对步骤(1)得到的模板DNA进行微滴生成，得到微滴；
(3)对步骤(2)得到的微滴进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)得到的PCR扩增产物进行定量检测。
优选的是，步骤(2)所述微滴生成为利用ddPCR系统使模板DNA形成油包水结构。
优选的是，步骤(3)所述PCR扩增的条件为95℃变性10min；94℃变性30s，54℃退火1min，循环30次；4℃延伸5min，90℃延伸5min。
优选的是，步骤(4)所述定量检测为采用微滴分析仪进行检测，所述微滴分析仪的检测条件包括染料法或探针法。
本发明提供了定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。本申请提供的引物特异性好、灵敏度高、稳定性好、重复性好，使用所述特异性引物对目的菌株鼠李糖乳杆菌M9进行PCR分析，能够实现对鼠李糖乳杆菌M9快速准确地定性、定量检测，特别是对食用M9益生菌者的人体肠道代谢物检测。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9特异性引物检验结果图；
图2为本发明实施例2提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9引物在种水平下特异性检验结果图；
图3为本发明实施例3提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9特异性引物定量检测结果图。
生物保藏说明
鼠李糖乳杆菌M9(Lactobacillus rhamnosus M9)。本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16002，保藏时间：2018年06月22日。
具体实施方式
本发明提供了用于定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌的微生物保藏编号为CGMCC No.16002。本申请所述鼠李糖乳杆菌M9(Lactobacillus rhamnosus M9)分离自我国健康妇女母乳中，具体地，是通过如下方法分离筛选得到的：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9分离自我国健康妇女母乳，通过TPY选择性培养基分离，通过挑取单个菌株扩配得到。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.16002；本申请所分离的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9具有如下生物学特性：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)属于乳杆菌属，为革兰氏阳性菌，无质粒，是人体正常菌群之一。
本发明根据鼠李糖乳杆菌M9的基因序列特性(SEQ ID NO.3)，特异性设计对鼠李糖乳杆菌M9具有特异扩增作用的一对PCR引物，即，特异性分子检测引物，所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R，或者为所述上游引物M9F/下游引物M9R的互补链或反向互补链序列，其中，上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ IDNO.2所示，具体地，
上游引物M9F：5’-GTAATGTAAATGGGGTTCCTGTG-3’；
下游引物M9R：5’-TGGTTTCCCTATAATCGTTGTCC-3’。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物的定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的特异性引物。
在本发明中，所述试剂盒还包括：标准品和PCR体系。在本发明中，所述标准品为阳性对照，所述标准品包括含有目的扩增片段的鼠李糖乳杆菌M9菌株DNA。本发明对所述PCR体系没有特殊限定，采用常规PCR检测体系即可。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物或上述技术方案所述试剂盒的定性检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
2)利用所述特异性引物对步骤1)得到的模板DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)对步骤2)得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，263bp处出现单一条带，说明待检测样品中含鼠李糖乳杆菌M9。
本发明提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA。即本发明提取待测样品中所有细菌的DNA作为模板DNA。本发明对所述模板DNA的提取方法和试剂没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规方法或试剂即可，如采用CTAB法或试剂盒等来提取DNA作为模板DNA；其中，所述试剂盒可以为任意一种细菌DNA提取试剂盒。
得到模板DNA后，本发明利用所述特异性引物对模板DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃变性1min，54℃退火53s，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸7min。PCR扩增完成后，PCR扩增产物4℃保存。
得到PCR产物后，本发明对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，263bp处出现单一条带，说明待检测样品中含鼠李糖乳杆菌M9。在本发明中，所述凝胶电泳检测的条件为：电压为5V/cm，电泳时间为20～30min。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性引物或上述技术方案所述试剂盒的定量检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
(2)利用所述特异性引物对步骤(1)得到的模板DNA进行微滴生成，得到微滴；
(3)对步骤(2)得到的微滴进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)得到的PCR扩增产物进行定量检测。
本发明提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA。本发明对所述提取方法没有特殊限定，采用常规细菌DNA提取方法即可，如利用CTAB法或者试剂盒法提取。
得到模板DNA后，本发明利用所述特异性引物对模板DNA进行微滴生成，得到微滴。在本发明中，所述微滴生成优选为利用ddPCR系统使模板DNA形成油包水结构。在本发明中，所述微滴生成优选采用微滴生成器进行。
得到微滴后，本发明对微滴进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的条件为95℃变性10min；94℃变性30s，54℃退火1min，循环30次；4℃延伸5min，90℃延伸5min。
得到PCR扩增产物后，本发明对PCR扩增产物进行定量检测。在本发明中，所述定量检测为采用微滴分析仪进行检测，所述微滴分析仪的检测条件包括染料法或探针法，阳性与阴性微滴应明显分开。
下面结合具体实施例对本发明所述的定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物、试剂盒和方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
粪便样品中的宏基因组DNA提取
取0.5g样品置于2mL离心管中，加1000μL Inhibit EX裂解酶，震荡10min；震荡后放入80℃水浴10min，涡旋振荡15s，室温下12000×g离心5min；收集上清液转移至另一离心管中并加入25μLproK,70℃预热AL buffer 300μL，震荡5min；70℃水浴10min；加300μL无水乙醇，震荡后吸取全部液体到离心柱，12000×g离心2min；加500μLAW1，静置1min，12000×g离心2min；加500μLAW2，静置1min，12000×g离心2min；空转2min，换收集管回溶备用。DNA提取试剂盒为QIAamp FastDNA Stool Mini Kit(50)，货号Cat.No.51604。
实施例2
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9特异性引物定性检测
以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9的全基因组序列中一段特异性的片段(SEQ ID NO.3)为依据，设计如下引物序列：
上游引物M9F：5’-GTAATGTAAATGGGGTTCCTGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物M9R：5’-TGGTTTCCCTATAATCGTTGTCC-3’(SEQ ID NO.2)。
在设计鼠李糖乳杆菌M9特异性引物后，对该引物的特异性进行了验证，挑选分类学地位上与鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9同源性较高的4株鼠李糖乳杆菌进行了PCR扩增，作为对照。
本试验共采用12株乳酸菌，其中包括M9在内的5种鼠李糖乳杆菌，1株干酪乳杆菌及6株植物乳杆菌。以上菌株均由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库(LACBB)。具体为(Lactobacillus rhamnosus)M9，(Lactobacillus rhamnosus，IMAU10642)NM86-1，(Lactobacillus rhamnosus，IMAU10640)NM85-1，(Lactobacillus rhamnosus，IMAU10666)NM93-4，(Lactobacillus rhamnosus，IMAU10673)NM94-5，(Lactobacillus casei Zhang)LcZhang，(Lactobacillus acidophilus，ATCC4356)LA，(Lactobacillus casei，ATCC334)LC，(Lactobacillusfermenturn，ATCC3314931T)LF，(Lactobacillus helveticus，1.2278)LH，(Lactobacillus kefiri，DSM20587)LK，(Lactobacillus salivarius，DSM 20555)LS。
扩增体系：
反应体系50μL：10×PCR mix 10μL，10mol/L上下游引物各1.2μL，DNA模板10ng，ddH2O补充至50μL；
扩增条件：
95℃变性5min；95℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃延伸7min，4℃保存。
将PCR产物与1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20～30min，紫外拍照，检测扩增效果；其中，以含有目的扩增片段的鼠李糖乳杆菌M9菌株DNA作为模板的阳性对照，以4株鼠李糖乳杆菌作为模板的阴性对照，根据在263bp处是否出现预期特征条带，定性确定样品中是否含有鼠李糖乳杆菌M9，结果如图1所示，其中，M：2000maker，1：鼠李糖乳杆菌M9，2：鼠李糖乳杆菌NM86-1，3：鼠李糖乳杆菌NM85-1，4：鼠李糖乳杆菌NM93-4，5：鼠李糖乳杆菌NM93-5。由图1可知，本引物可扩增出鼠李糖乳杆菌M9。
而对其它4株鼠李糖乳杆菌无扩增，证明该引物对M9具有特异性。
以上述同样方法，以含有目的扩增片段的鼠李糖乳杆菌M9菌株DNA作为模板的阳性对照，以6株植物乳杆菌作为模板的阴性对照，根据在263bp处是否出现预期特征条带，定性确定鼠李糖乳杆菌M9引物特异性。结果由图2所示，其中，M:2000maker，1.鼠李糖乳杆菌M9，2.Lactobacillus acidophilus，3.Lactobacillus casei，4.Lactobacillusfermenturn，5.Lactobacillus helveticus，6.Lactobacillus kefiri，7.Lactobacillus salivarius。由图2可知，该引物可扩增出M9，对其它6株植物乳杆菌无特异性，证明该引物可在乳杆菌属中特异性扩增出M9。
分析结果表明，该引物只能扩增鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9，不能扩增出其余4株鼠李糖乳杆菌及6株植物乳杆菌。
上述比对扩增实验表明，本发明设计的引物具有良好的特异性。
实施例3
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)M9特异性引物定量检测
扩增体系：20μL：10×PCR supermix 10μL，10mol/L上下游引物各0.2μL，DNA模板10ng 2μL，ddH2O补充至20μL；
扩增条件为：95℃变性10min；94℃变性30s，54℃退火1min，循环30次；4℃延伸5min，90℃延伸5min，4℃保存。
将PCR扩增后的微滴放入微滴分析仪中，微滴分析仪吸取全部微滴后，根据荧光强度不同分成阳性微滴与阴性微滴；其中，阳性微滴为鼠李糖乳杆菌M9菌株DNA的扩增片段，阴性微滴为非M9DNA片段，根据阳性微滴占总微滴的百分含量，以公式(拷贝数×20)÷2×回溶液×稀释倍数÷原始克数)计算出M9的具体含量。结果由图3所示，其中，B07.鼠李糖乳杆菌NM86-1 C07.鼠李糖乳杆菌NM85-1 D07.鼠李糖乳杆菌NM93-4 E07.鼠李糖乳杆菌NM94-5 F07.M9 G07.干酪乳杆菌-Zhang H07.干酪乳杆菌模式菌株。由图3可知，本引物对M9特异性较强，扩增拷贝数为83.4copys/μL，即每毫升培养液内含有2.5×104个细胞数；对其它鼠李糖乳杆菌及干酪乳杆菌几乎无特异性，证明该引物可作为鼠李糖乳杆菌M9特异性引物使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物、试剂盒和方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaatgtaaa tggggttcct gtg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtttccct ataatcgttg tcc 23
<210> 3
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaatttct ggggttctag ctaccgatat cataaaaaag caaaaaaaat aattaagttg 60
caagagacgt atcgtgcaat gggcgatgag gaacttcgac agcaaactga attatttcgc 120
caacgacttg caaaaggcga atctttgcga tcgttactcg ttgaagcgta tgctgttgtg 180
tgtgaagcag actttagagt tctccatatg cgaccatttc ctgttcaagt tttgggcgcc 240
gttgcaatgg aatacaataa catcgttgaa atgaagaccg gtgaaggaaa gactttgacg 300
gcgaccatgc cgatgtatct tcacggattg acaggtgctg ggaatttctt aattacagca 360
aatgggtatt tagctaatcg tgatgcggaa cagatgggtc aggtctaccg ttggcttggc 420
ctaacagttg cttccggtgt tgcgcagccc gggcatgaaa gcgaaaaacg cgatcggcag 480
agaatctatc aagcagatat tgtttacacg acaaattcgg cgctcggatt tgactatttg 540
tttgacaacc ttgcggccaa tccagaagaa cagtatatca atcatttgaa ttatgcgttg 600
cttgatgaag ccgatgcaat tctactcgac agtgcgcaaa caccattgat tatcgctggt 660
attcctagag tccagtcaaa ttattatcag tcggcagatc gcatgattaa catgctcaag 720
gaaaaggtcg actataagcg tagtgatgat cgtaagtctg tttggtttac gcctgatggc 780
attaaacgta tgcagcattt ctttggtgtt gatgatcttc taggcgatga atggcatgag 840
ctatatcgtc atttagtttt ggctttaaaa gcacacttca tttacaaacg ggatcgtgat 900
tatgttgtgg atgatgacat ggtcgtttta gttgatcgcg ataatggtcg tgaattgatc 960
ggtatgaaga tgcaaagtgg gcaacatcaa gcaattgaag ctaaggaaca cgttaagttg 1020
actgatgaaa tgcgtacgat ggcttccgta acctatcaga atctatttcg aatgttcggc 1080
cagcttgcag ggatgacagg aacagctgcc actgatgccg cggagtttat ggaggtttat 1140
cgcttggcag tataccgtgt gccgaccaat gaaccgatga ttcgcaagga tttacctgat 1200
cagctataca tcagtcaaac agccaaatta ttggcatctt tgaagactgt tcataaagca 1260
tacgatgaga aacgtcctat tttgattgaa accggttcac tctcgctttc gaatctctat 1320
tcacgtttat tattaagaga aaaaattcca catagtttac tgaatgcgcg cagtgccgca 1380
aaagaagcaa aaatcgtggc tgaagctggt caactagggg ctgtaactgt tgcaacctca 1440
atggcaggtc gtggcacgga tattaagctt ggaaagggag ttaaagaaaa agggggctgc 1500
ttgttttag 1509
Claims (10)
1.用于定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物M9F和下游引物M9R；所述上游引物M9F的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物M9R的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.基于权利要求1所述特异性引物的定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌M9的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：标准品和PCR体系。
4.基于权利要求1所述特异性引物或权利要求2或3所述试剂盒的定性检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
2)利用所述特异性引物对步骤1)得到的模板DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)对步骤2)得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，263bp处出现单一条带，说明待检测样品中含鼠李糖乳杆菌M9。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃变性1min，54℃退火53s，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸7min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述凝胶电泳检测的条件为：电压为5V/cm，电泳时间为20～30min。
7.基于权利要求1所述特异性引物或权利要求2或3所述试剂盒的定量检测鼠李糖乳杆菌M9的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的DNA片段，作为模板DNA；
(2)利用所述特异性引物对步骤(1)得到的模板DNA进行微滴生成，得到微滴；
(3)对步骤(2)得到的微滴进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)得到的PCR扩增产物进行定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述微滴生成为利用ddPCR系统使模板DNA形成油包水结构。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的条件为95℃变性10min；94℃变性30s，54℃退火1min，循环30次；4℃延伸5min，90℃延伸5min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述定量检测为采用微滴分析仪进行检测，所述微滴分析仪的检测条件包括染料法或探针法。
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| Title |
|---|
| ANU TILSALA-TIMISJARVI等: "Strain-Specific Identification of Probiotic Lactobacillus rhamnosus with Randomly Amplified Polymorphic DNA-Derived PCR Primers", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| GUILLAUME GOBERT等: "Droplet digital PCR improves absolute quantification of viable lactic acid bacteria in faecal samples", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110106119A (zh) * | 2019-05-28 | 2019-08-09 | 北京科拓恒通生物技术股份有限公司 | 一株分离自母乳的鼠李糖乳杆菌m9及其应用 |
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