CN101597642A - 一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及应用此方法制备的体外诊断试剂盒，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR－SSP(Sequence specific primer，序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法；在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒。本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和说明中有描述。通过阅读附图、详细描述和权利要求可以清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及应用此方法制备的体外诊断试剂盒，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
技术背景
在本文中，术语“Rh”是恒河猴(Rhesus Macacus)外文名称的头两个字母。RhD抗原自1939年被发现以来，因导致新生儿溶血病、发生血管外迟发性溶血性输血反应而成为红细胞中仅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很强，尤其以D抗原最强，仅次于ABO系统的A和B抗原。凡是人红细胞上有RhD抗原者，为Rh阳性，反之为阴性。RhD阴性血型在中国人中所占比例约为3～5‰，属于稀有血型。50％～75％的Rh阴性个体通过输血和妊娠，可受D抗原红细胞免疫而产生抗D；随着对Rh血型的不断研究，认为Rh血型系统可能是红细胞血型中最为复杂的一个血型系。世界各国的卫生组织都严格规定，个体在输血时，只能输用Rh阴性血液。Rh血型的发现，对更加科学地指导输血工作和进一步提高新生儿溶血病的实验诊断和维护母婴健康，都有非常重要的意义。Rh抗原是由位于1号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RhD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成；RhD基因编码D抗原，RhCE基因编码Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外显子与内含子有93.8％的同源性，外显子1～7编码50～60个氨基酸，外显子8～10编码最后58个残基。两者最显著的区别是内含子4，RhD的内含子4少了约600bp。RhD和RhCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98.6％同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes)；RhD阴性的RhD基因缺失，两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rhbox-hybrid)，成为RhD阴性基因的特征。见附图1。
近年来，研究发现一些血清学初检RhD阴性的个体经过进一步敏感的血清学检验，如吸收放散试验，可以能检出D抗原的存在，即部分RhD阴性个体拥有难以检测出的D抗原。进一步的研究显示，此类D抗原又可以分为部分D(partrial-D)和弱表现型D(weak-D)两种类型；部分D个体制表达部分而非完整的D抗原，在数量和本质上都与RhD阳性的D抗原有区别，而弱D表达的D抗原是完整的与RhD阳性相比，只有在D抗原数量上有显著区别。这两类特殊血型中都可以检出D基因，这就有两个方面值得探讨：一是这些个体的基因属于沉默基因或无效基因；二是这些个体并非真实RhD阴性，而是D抗原较弱，一般检测方法未检测到RhD抗原。现已发现RhD阴性的个体中存在着一种重要的RhD的弱表现型：DEL(D-elution，elution中文意为洗脱)，DEL在所占比例在不同文献报告中所占的比例也不同，国外报告在黑人和日本人中DEL比例较高，约30～50％，中国人初筛RhD阴性的人群中香港报告DEL占30％，内地占20～30％。
目前已证实DEL基因外显子均无缺失，RhD基因表达调控的差异可能是DEL的产生原因，已有的研究显示在中国大陆、中国台湾和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外显子的1227位发生G＞A的突变引起的，导致mRNA产生变异，使蛋白质的表达量减少，但抗原性质未变；而1227位的G＞A突变也成为东亚人群的特异的很重要的基因标记。
DEL血型引起了日益增加的关注主要源于两个方面：一是目前国内外对DEL血型作为RhD阴性血型对待，DEL血液仍用于供给RhD阴性患者使用，但国内外都有越来越多的报道证实RhD阴性患者输用DEL血液后，产生了抗-D抗体或体内抗-D抗体效价升高，可能引起输血反应，成为临床输血中的不安全因素；二是DEL表达的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能够输用D阳性血液，从而节约宝贵的RhD阴性血液资源？以上的研究都必须对DEL血型进行准确的鉴定，同时大规模的检测也需要采用可靠、简便和经济的方法才能够进行。
用免疫血清学的方法对DEL血型的检出有赖于使用的抗-D试剂和操作方法，可靠性较低，而且由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，可靠的方法是应用基因检测的方法来检出DEL血型。目前，国外已有多种根据1227位发生G＞A的突变而设计的检测试剂盒问世，可用于DEL血型的检出，但存在以下缺点：
1、价格昂贵：产自德国的BAG和INNO-TRAIN公司的D基因检测试剂虽然可靠性好，但每人份约需1200～1300人民币元，非常昂贵；产自美国G&T公司试剂，虽然每人份约需100人民币元，但可靠性较差，而且这个价格仍然是大规模检测难以承受的；
2、操作繁琐：德国的BAG和IVIN公司的D基因检测试剂每人份需要4～8个反应管，而美国G&T公司试剂每人份需要12个反应管，样本DNA和耗材的消耗量很大，而且加样繁琐，容易出错，同时判读困难，不适于大规模的检测工作；
3、内对照均为人类生长激素基因，但我们实际使用中发现有内对照有扩增条带，但检测带无扩增产物，不能判断有些阴性结果是否是由于Rh基因降解所致。
发明内容
本发明的目的是为了克服前述试剂的缺点，提供一种经济、简便和直观的分子生物学方法以及实施该方法的试剂盒。本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及为实施该方法制备的体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer，序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。在本文中，术语“多重PCR”是指通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增的筛选检测方法。研究表明，对于成功进行多重PCR尤为重要的因素是：用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和dNTP浓度间的平衡。
在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤：
(1)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μlPCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl TaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；
(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94℃、40秒，56℃、40秒和72℃、2分钟)，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；
(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照
其中，所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.0μl 25mMMgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μl DDW。
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ ID NO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在1921bp，其设计原理见附图2，序列见表1。所有引物的浓度均为25pmol/μl，其混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5，可选比例：EQ ID NO1∶SEQ IDNO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝3.5∶3.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶7∶7。
在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤：
(1)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl TaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；
(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94℃、40秒，56℃、40秒和72℃、2分钟)，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；以及
(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照；
其中，所述PCR引物缓冲液包含.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
所有引物的浓度均为25pmol/μl，所述引物混合物混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ IDNO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5
在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：
(1)引物混合物1管；
(2)PCR引物缓冲液1管；
(3)Taq聚合酶1管；
(4)dNTP混合物1管；
(5)阳性对照2管，阴性对照1管；以及
(6)使用说明书；
其中，所述的PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.0μl 25mMMgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μl DDW；
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ ID NO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在1921bp，其设计原理见附图2，序列见表1。所有引物的浓度均为25pmol/μl，其混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5，可选比例：EQ ID NO1∶SEQ IDNO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝3.5∶3.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶7∶7。
在本发明的另一实施方式中，本发明一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：
(1)引物混合物1管；
(2)PCR引物缓冲液1管；
(3)Taq聚合酶1管；
(4)dNTP混合物1管；
(5)阳性对照2管，阴性对照1管；以及
(6)使用说明书；
其中，所述PCR引物缓冲液包含.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。
在本发明另一实施方式中，本发明还涉及所述试剂盒在检测人类RhD血型基因型中的用途。试剂盒为体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和下面的说明中有描述。通过阅读附图、详细描述和权利要求可以清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。
附图说明
附图1描述的是Rh血型基因组结构图。RhD和RhCE基因尾对尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98.6％同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes)；从图中可以看到RhD阴性的RhD基因缺失，两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rh box-hybrid)，成为RhD阴性基因的特征。
附图2是RhD血型基因型检测试剂盒引物设计原理图，描述的是设计的引物所针对的D基因位置及特异性示意图。本发明引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，SEQ ID NO1最末碱基针对1227位发生G＞A的突变而设计，SEQ ID NO2位于第9、10外显子之间的内含子中，引物扩增片断长度为102bp；SEQ ID NO3和SEQ IDNO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，其中SEQ IDNO52位于第9、10外显子之间的内含子中，无序列特异性，SEQ ID NO6位于RhD基因第10外显子中，与同位置RhCE基因有11个碱基差异，具有序列特异性，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ IDNO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQ ID NO7位于上游Rh盒子基因内，在下游Rh盒子基因无相同序列，SEQ ID NO8位于下游Rh盒子基因内，在上游Rh盒子基因无相同序列，扩增片断长度为在1921bp。图中红色为3’端位点不符，不能进行相应的扩增，显示出本发明所设计的引物具有很好的特异性。
附图3为单对引物的PCR反应电泳图，通过单对引物的PCR反应结果，A为SEQ ID NO1和SEQ IDNO2扩增结果，产物大小为102bp，与目标产物相符；B为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6扩增结果，都获得了目的片断；C为SEQ ID NO7和SEQ ID NO8扩增结果，比对DL2000的标尺，产物大小为2000bp左右，与目的片断的大小相符，说明设计的引物合适。
附图4为引物不同比例混合PCR电泳图，其中，模板为DEL/d型，Marker为DL2000，描述的引物在不同比例的混合后PCR反应电泳的结果，样本为DEL/d，目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和1921bp，从图中可见，混合组分3和4可以将样本DEL/d的所有4个条带扩增出来，适用于本发明的多重PCR方法，其中组分3各产物的量较组分4更为均衡，为最佳混合比例，组分4为可选混合比例，其他混合比例都不能扩增出全部条带。
附图5显示的是不同配方缓冲液对混合PCR的影响，模板DNA为已知的DEL/d型，目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和1921bp，从图中可见只有7号配方能够是PCR反应扩增出所有目标条带，而其他配方都有条带丢失，说明不适于本发明。虽然在多重反应中，有报道5％-10％的DMSO和甘油可以改善扩增的效率(提高产物量)和特异性(没有非特异性产物)，但在本发明中，5％的DMSO是反应的最佳浓度，增加和减少都对反应不利。而甘油的添加对反应会产生抑制作用。同样有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR扩增的效率，但在本发明中也没有作用。
附图6显示的是不同的退火温度对PCR反应的影响。样本DNA为4例DEL，目的条带3条，分别为102bp、206bp和261bp；2例DEL/d，目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和1921bp；1例d/d，目标条带为2条，分别为206bp和1921bp；1例D/D型，目标条带为2条，分别为206bp和261bp。图中可见，5℃和5℃的退火温度是反应出现了非特异性的条带，而5℃的退火温度使部分条带未被扩增出来，而5℃退火温度条件下，已知基因型的样本都被正确检出。
附图7为本试剂盒检测RhD基因型电泳图，其中，M：Marker，Takara，DL2000。1、2为INNO-TRAIN公司的标准质控对照，1为D/d型，2为d/d型，3～8为待测样本，3为D/D，4为D/d，5为del/d，6为d/d，7为del/d，8为d/d。描述的是检测本试剂盒灵敏度和特异性的试验结果，判定格局为D/d型，目标条带为3条，分别为206bp、261bp和1921bp；d/d型，目标条带为2条，分别为206bp和1921bp；D/D型，目标条带为2条，分别为206bp和261bp。DEL/d，目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和1921bp；根据不同的条带可以判断出检测结果，INNO-TRAIN公司的标准质控对照D/d型和d/d型也被准确检出。
附图8为INNO-TRAIN公司试剂盒RhD基因分型电泳图。描述的是用本发明试剂检出的D/d型、DEL/d型和d/d型用INNO-TRAIN公司的D基因检测试剂盒进行复检，根据表5的格局判断结果，两种试剂盒结果相符。
附图9为对西安市Rh阴性无偿献血者RhD基因型检测图，根据扩增条带判断结果，D/d型，目标条带为3条，分别为206bp、261bp和1921bp；d/d型，目标条带为2条，分别为206bp和1921bp；D/D型，目标条带为2条，分别为206bp和261bp。DEL/d，目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和1921bp；从反应结果可以看出，样本中有D/d型、DEL/d型、D/D型和d/d型，本发明只要一个反应孔就可以鉴定出RhD血型的基因型，操作简便，成本低，结果易于判定，适于大样本量筛选和检测。已采用本试剂盒筛选了437例西安市Rh阴性无偿献血者的基因型，检出del/d基因型88例，占Rh阴性无偿献血者20％，无效D基因型(D/D和D/d)33例，占7.5％。
具体实施方式
本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法以及用于实施该方法的体外诊断试剂盒。本发明的方法和试剂盒可用于检出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer，序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。本发明的基础部分在于对Rh血型基因的认识。Rh抗原是由位于1号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RhD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成；RhD基因编码D抗原，RhCE基因编码Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外显子与内含子有93.8％的同源性。RhD和RhCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98.6％同源性的区域被称为Rh盒子(Rhboxes)；RhD阴性的RhD基因缺失，两端的Rhboxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rhbox-hybrid)，成为RhD阴性基因的特征。中国大陆、中国台湾和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外显子的1227位发生G＞A的突变引起的，导致mRNA产生变异，使蛋白质的表达量减少，但抗原性质未变；而1227位的G＞A突变也成为东亚人群的特异的很重要的基因标记。因此，设计出的引物必须能够特异性地扩增出RhD基因而非RhCE基因，同时还能够对不同的D基因型加以区分。原理见附图2。
在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，基于对PCR-SSP以及由此发展出的多重PCR原理的应用。成功进行多重PCR尤为重要的因素是：用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和dNTP浓度间的平衡。该方法包括步骤：
(1)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl TaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；
(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；
(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。
其中，缓冲液基于普通PCR缓冲液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐剂而配制，在实施方式中，试验过不同浓度的甘油、DMSO、(NH4)2SO4和BSA等佐剂。虽然在多重反应中，有报道5％-10％的DMSO和甘油可以改善扩增的效率(提高产物量)和特异性(没有非特异性产物)。本发明所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.0μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μl DDW。
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ IDNO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在1921bp，其设计原理见附图2，序列见表1。所有引物的浓度均为25pmol/μl，在实施方式中，试验了多种不同引物对之间的相对浓度，采用同一模板(已知D基因型)和反应条件下，对比产物的均衡性，最终确定了引物的的最佳比例。其混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5，可选比例：EQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ IDNO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝3.5∶3.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶7∶7。
反应条件如下：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。可选反应条件为：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、35秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；
在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤：
(1)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μlPCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl TaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；
(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；
(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；
在本发明中，5％的DMSO是反应的最佳浓度，增加和减少都对反应不利。而甘油的添加对反应会产生抑制作用。同样有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR扩增的效率，但在本发明中没有作用。本发明所述PCR引物缓冲液包含.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
所有引物的浓度均为25pmol/μl，所述引物混合物混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ IDNO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。
在另一个实施方式中提供了本发明不同退火温度下的反应结果，尽管许多基因能在退火温度为5℃～6℃被特异的扩增，我们的经验表明，，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。将退火温度降低4℃～6℃对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。过低的退火温度会出现非特异性的扩增条带，高的退火温度会导致扩增缺失。最终确定的反应条件如下：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：
(1)引物混合物1管；
(2)PCR引物缓冲液1管；
(3)Taq聚合酶1管；
(4)dNTP混合物1管；
(5)阳性对照2管，阴性对照1管；以及
(6)使用说明书；
其中，所述的PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.0μl 25mMMgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μl DDW；
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ ID NO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在1921bp，其设计原理见附图2，序列见表1。所有引物的浓度均为25pmol/μl，其混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5，可选比例：EQ ID NO1∶SEQ IDNO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝3.5∶3.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶7∶7。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：
(1)引物混合物1管；
(2)PCR引物缓冲液1管；
(3)Taq聚合酶1管；
(4)dNTP混合物1管；
(5)阳性对照2管，阴性对照1管；以及
(6)使用说明书；
其中，所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mMMgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。
反应条件如下：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；
在本发明另一实施方式中，本发明还涉及所述试剂盒在检测人类RhD血型基因型中的用途。试剂盒为体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
包含本发明所使用的多种其他试剂，如dNTP-Mix和Taq酶为非限制性的。
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考下面的实施例可以更容易地理解本发明，下面的实施例是通过说明的方式提供的，并不意味着对本发明的限制，除非特别说明。
实施例
实施例1引物序列的设计
根据特异性的位点设计的引物序列，所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。其中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，SEQ ID NO1最末碱基针对1227位发生G＞A的突变而设计，SEQ ID NO2位于第9、10外显子之间的内含子中，引物扩增片断长度为102bp；SEQID NO3和SEQ ID NO4分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp；SEQ ID NO5和SEQ ID NO6分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，其中SEQ ID NO52位于第9、10外显子之间的内含子中，无序列特异性，SEQ ID NO6位于RhD基因第10外显子中，与同位置RhCE基因有11个碱基差异，具有序列特异性，扩增片断长度为261bp；SEQ ID NO7和SEQ ID NO8分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQ ID NO7位于上游Rh盒子基因内，在下游Rh盒子基因无相同序列，SEQ ID NO8位于下游Rh盒子基因内，在上游Rh盒子基因无相同序列，扩增片断长度为在1921bp，其设计原理见附图2，序列见表1
表1本发明引物序列表
实施例2单对引物的PCR反应
通过单对引物的PCR反应米验证引物设计的合理性，以最终确定能够用于多重PCR反应的引物组分。试验材料为d/d、D/d和DEL型DNA，反应缓冲液为普通PCR缓冲液，Taq酶购自上海Promega公司，dNTP购自北京鼎国生物科技公司。反应体系为20μl：在0.5mL的Ependoff管内加入1.0μl引物、2.0μlPCR缓冲液、2.0μl 25mM MgCl2、1.0μldNTP混合物、0.2μl Taq DNA聚合酶、3.0μl模板DNA和11.8μl双蒸水，充分混合；
根据引物的Tm值确定退火温度，反应条件分别如下：
SEQ ID NO1和SEQ ID NO2：9℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(9℃、30秒，6℃、30秒和7℃、30秒)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
SEQ ID NO3和SEQ ID NO4：9℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(9℃、30秒，5℃、30秒和7℃、30秒)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
SEQ ID NO5和SEQ ID NO6：9℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(9℃、30秒，5℃、30秒和7℃、30秒)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
SEQ ID NO7和SEQ ID NO8：9℃变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(9℃、30秒，5℃、30秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
取出PCR产物，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照；
反应结果见附图3，可见都有目的条带，说明引物设计合理，可以扩增出目的条带。
实施例3引物混合比例的优化
由于不同引物在同一个发应条件下的序列亲和性和扩增效率有很大的不同，从而导致反应产物量的不同，因此通过本实施例的优化挑选，确定能够实现各对引物都有较为明显的扩增产物。引物同PH8.0的TE缓冲液溶解为浓度25pmol/μl，按照表2所示为其中一次混合比例的试验，按照表中所示比例分组配制混合引物。根据多重PCR退火温度设定原则，退火温度为5℃，模板DNA为DEL/d型，反应体系为20μl：在0.5mL的Ependoff管内加入2.0μl引物混合液、2.0μlPCR缓冲液、2.0μl 25mM MgCl2、2.0μldNTP混合物、0.2μl TaqDNA聚合酶、1.0μl DMSO，3.0μl模板DNA和7.8μl双蒸水，充分混合；
反应条件分别如下：℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、30秒，5℃、30秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；
试验结果见附图4，从图中可见，混合组分3和4可以将样本DEL/d的所有条带扩增出来，适用于本发明的多重PCR方法，其中组分3各产物的量较组分4更为均衡，为最佳混合比例，组分4为可选混合比例，其他混合比例都不能扩增出全部条带，不适于本发明。
表2引物混合比例表
| 组别 | SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ ID NO7∶SEQ ID NO8 |
| 1 | 1∶1∶1∶1∶1∶1∶4∶4 |
| 2 | 1∶1∶1∶1∶2∶2∶4∶4 |
| 3 | 4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5 |
| 4 | 3.5∶3.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶7∶7 |
| 5 | 1∶1∶2∶2∶2∶2∶3∶3 |
| 6 | 1∶1∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶4∶4 |
| 7 | 3∶3∶1∶1∶2∶2∶4∶4 |
| 8 | 1∶1∶1∶1∶0.5∶0.5∶5∶5 |
实施例4PCR缓冲液的配制
缓冲液基于普通PCR缓冲液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐剂而配制，在实施方式中，试验过不同浓度的甘油、DMSO和BSA等佐剂以及Mg2+浓度等。表3为其中一组配方，以不断增加甘油、DMSO和Mg2+浓度，以对比反应产物特异性和量。根据多重PCR退火温度设定原则，退火温度为5℃，模板DNA为DEL/d型，反应体系为20μl：在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl Taq DNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；将Ependoff管放入PCR扩增仪中，9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；反应结果见附图5。从图中可见，根据配方7的扩增产物可以判断出待检DNA为DEL/d型，其他配方不能完全扩增出所有的条带，不适于本发明。在另一组反应中，BSA被证明对本发明无明显作用，而10mM(NH4)2SO4的终浓度被认为是一个合适的佐剂浓度。
虽然在多重反应中，有报道5％～10％的DMSO和甘油可以改善扩增的效率(提高产物量)和特异性(没有非特异性产物)，但在本发明中，5％的DMSO是反应的最佳浓度，增加和减少都对反应不利。而甘油的添加对反应会产生抑制作用。同样有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR扩增的效率，但在本发明中没有作用。因此，本发明提供的PCR反应缓冲液配方比例如下：2.0μl 500mMKCl、2.0μl 100mMTris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
表3PCR缓冲液配方表
| 1.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.0μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；DMSO，0.5μl；DDW，6.1μl | 2.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.0μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；甘油，0.5μl；DDW，6.1μl |
| 3.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.3μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；DMSO，0.5μl；DDW，5.8μl | 4.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，23μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；甘油.，0.5μl；DDW，5.8μl |
| 5.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.6μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；甘油，0.5μl；DDW，5.5μl | 6.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.6μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；DMSO，2.0μl：DDW，4.0μl |
| 7.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.6μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；DMSO，1.0μl；DDW，5.0μl | 8.500mM KCl，2.0μl；100mM Tris-HCl(PH 9.0)，2.0μl；25mM MgCl2，2.6μl；1.0M(NH4)2SO4，0.2μl；甘油，1.0μl；DDW，5.0μl |
实施例5不同退火温度对PCR反应的影响
在确定了引物混合比例和缓冲液配制组分后，通过不同退火温度对PCR反应的影响，以确定最佳反应温度。样本为4例DEL，2例DEL/d，1例d/d和1例D/D型DNA。在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl Taq DNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；将Ependoff管放入PCR扩增仪中，9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，X℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；X为不同的退火温度，按照表4所示设置，1、2、3、4为4组不同退火温度的反应组。
表4设置的不同退火温度
| 1℃ | 3℃ |
| 2℃ | 4℃ |
反应结果见附图6，从图中可见，5℃和5℃的退火温度是反应出现了非特异性的条带，而5℃的退火温度使部分条带未被扩增出来，而5℃退火温度条件下，已知基因型的样本都被正确检出。本发明提供的最终反应条件为：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。
实施例6本发明与其他试剂盒对比
在本发明的另一实施方式中，本发明一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：引物混合物1管；PCR引物缓冲液1管；Taq聚合酶1管；dNTP混合物1管；阳性对照2管，阴性对照1管；以及使用说明书；其中，所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM Tris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mMMgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。待检DNA包括有INNO-TRAIN公司的标准质控对照，D/d型和d/d型；按照使用说明书，在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl Taq DNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；反应条件如下：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。
INNO-TRAIN公司的检测试剂盒可以检出RhD基因型，，其使用方法如下：取1.5ml离心管1支，按照样本的多少(设为X个样本)加双蒸水42Xμl、试剂盒的红色反应液(redPCR)21Xμl、Taq酶(5U/μl)0.56Xμl，混匀备用；PCR反应液配制：根据样本数的多少，取X支1.5ml离心管，并标记好样本编号，每管加入63μl前述配制的混合液，在加入7μlDNA，混匀。将样本加入试剂盒的反应管中，10μl/孔，共6孔。反应条件如下：9℃变性2分钟，然后进行10个循环的PCR反应(9℃、20秒和6℃、1分钟)，20个循环的PCR反应(9℃、20秒，6℃、1分钟和7℃、30秒)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。根据其反应格局判断检测结果，其反应格局见表5
表5INNO-TRAIN试剂盒反应格局
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| D/D | - | + | - | - | - | - |
| D/d | + | - | - | - | - | - |
| d/d | + | - | - | - | - | - |
| DEL | - | + | - | - | + | - |
| DEL/d | + | + | - | - | + | - |
附图7为本发明试剂盒对样本DNA的检出结果，试剂盒可以于检出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。将检出的D/d、DEL/d和d/d基因型采用INNO-TRAIN公司的检测试剂盒进行相符性的检测，结果完全相符，见附图8；在其他的实施方式中，随机抽取20份样本DNA，分别采用德国INNO-TRAIN公司和美国G&T公司D基因检测试剂检测，其结果与本发明检测结果相符，说明本发明试剂盒有很好的可靠性。
实施例7本发明试剂盒检测RhD基因性
本发明提供的一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：引物混合物1管；PCR引物缓冲液1管；Taq聚合酶1管；dNTP混合物1管；阳性对照2管，阴性对照1管；以及使用说明书；采用本试剂盒检测西安市Rh阴性无偿献血者的RhD基因型，按照使用说明书，在0.5mL的Ependoff管内加入12.8μl PCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl Taq DNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；反应条件如下：9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟)，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。反应结果见附图9，结果判断参见附图7，本发明只要一个反应孔就可以鉴定出RhD血型的基因型，包括纯合子和杂合子，如D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，操作简便，成本低，结果易于判定，适于大样本量筛选和检测。已采用本试剂盒筛选了437例西安市Rh阴性无偿献血者的基因型，检出del/d基因型88例，占Rh阴性无偿献血者20％，无效D基因型(D/D和D/d)33例，占7.5％。
引物序列表
<110>陕西省血液中心
<120>一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法及试剂盒
<140>
<141>
<160>8
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ATGACCAAGTTTTCTGGAAA
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
CAGCAAGTCAACATATATACT
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ACTGACACCGACAGTCCTT
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
GCTGTGTCCTGGCAATGGT
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
GTAATGAGACATTTAGGCT
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
CAACTCCATTTTCTCTGACT
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
AAGGTTTCCAAACCCCAA
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
CTCTTTTCTGGCCTTAACAT
Claims (11)
1、一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤：
(1)在0.5mL的Ependoff内加入12.8μlPCR引物缓冲液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μlTaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；
(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，9℃变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应，包括9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分钟，随后7℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；
(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳，200V20分钟，紫外灯下观察结果并拍照。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物缓冲液包含2.0μl500mM KCl、2.0μl 100mMPH 9.0Tris-HCl、2.0μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μlDDW。
3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mMTris-HCl(PH 9.0)、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物本发明引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，其序列见说明书中表1。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，本发明提供的最佳混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ IDNO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。
6、一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含：
(1)引物混合物1管；
(2)PCR引物缓冲液1管；
(3)Taq聚合酶1管；
(4)dNTP混合物1管；
(5)阳性对照2管，阴性对照1管；以及
(6)使用说明书。
7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中所述的PCR引物缓冲液包含2.0μl500mM KCl、2.0μl 100mM PH 9.0 Tris-HCl、2.0μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、0～2.0μl DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μlDDW。
8、如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其中所述PCR引物缓冲液包含2.0μl 500mM KCl、2.0μl 100mM PH 9.0Tris-HCl、2.6μl 25mM MgCl2、0.2μl 1.0M(NH4)2SO4、1.0μl DMSO和5.0μl DDW。
9、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，其序列见说明书中表1。
10、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，本发明提供的最佳混合比例为：SEQ ID NO1∶SEQ ID NO2∶SEQ ID NO3∶SEQ ID NO4∶SEQ ID NO5∶SEQ ID NO6∶SEQ IDNO7∶SEQ ID NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。
11、如权利要求6-10中任一权利要求所述的试剂盒用于检测人类RhD血型基因型，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
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