CN113004342B - 高gc含量的核酸引物的后处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高GC含量的核酸引物的后处理方法，通过将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，往合成板装置的每孔内加入二乙胺、乙腈混合液，静置后负压抽干，配平离心，再加入清洗乙腈，静置后负压抽干，配平离心，在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中氨解，配平离心后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上加入氨解液，于氨解盒中氨解，在抽滤装置上放入合成板装置，加入乙腈溶剂静置后负压抽干，配平离心，加入三乙胺溶剂，静置后离心；该方法快速、高效地纯化高GC含量的核酸引物,相较传统洗脱法，该方法在得率方面提高了近2倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高GC含量的核酸引物的后处理方法。
背景技术
引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3'-0H上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3'-0H，必须是游离的。目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法,该方法具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
合成引物是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
氨解反应是指含各种不同官能团的有机化合物在胺化剂的作用下生成胺类化合物的过程。氨解反应包括卤素的氨解、羰基化合物的氨解、磺基及硝基的氨解和直接氨解(其中胺化剂包括但不限于，液氨、氨水、尿素、铵盐)，主要原理是将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来，用胺化剂来裂解CPG连接化合物与初始核苷间的酯键，断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'-羟基。脱保护基是用胺化剂处理较长时间以脱掉碱基环上的保护基团(其中包括氰乙基、苯甲酰基、异丙基)。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供了高GC含量的核酸引物的后处理方法：通过将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s，然后往合成板装置的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次，然后再往合成板装置的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次，然后在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为40℃的条件下氨解1小时，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为90℃的条件下氨解1小时，然后在抽滤装置上放入合成板装置，往合成板装置的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min，然后往合成板装置的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s，解决了传统洗脱法的收率低的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
高GC含量的核酸引物的后处理方法，包括以下步骤：
步骤一：氨解前处理；
步骤二、氨解；
步骤三、清洗；
步骤四、洗脱。
作为本发明进一步的方案：氨解前处理的具体步骤如下：
S21、将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s；
S22、往合成板装置的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次；
S23、再往合成板装置的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次。
作为本发明进一步的方案：所述氨解的具体步骤如下：
S31、切割：在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为40℃的条件下氨解1小时；
S32、脱保护：配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为90℃的条件下氨解1小时。
作为本发明进一步的方案：所述清洗的具体步骤如下：
S41、在抽滤装置上放入合成板装置，往合成板装置的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次；
S42、配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min；
作为本发明进一步的方案：所述洗脱的具体步骤如下：
往合成板装置的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s。
本发明的有益效果：
本发明的高GC含量的核酸引物的后处理方法，通过将装有核酸引物的合成板装置配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s，然后往合成板装置的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次，然后再往合成板装置的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次，然后在合成板装置底部放置一块新的96微孔板，往合成板装置的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为40℃的条件下氨解1小时，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置，保留底部96微孔板，并在96微孔板的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具放于氨解盒中，在温度为90℃的条件下氨解1小时，然后在抽滤装置上放入合成板装置，往合成板装置的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次，然后配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min，然后往合成板装置的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s；
该高GC含量的核酸引物的后处理方法快速、高效地纯化高GC含量的核酸引物,相较传统洗脱法，该方法在得率方面提高了近2倍。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中合成板装置、96微孔板、氨解盒夹具、氨解盒的位置关系图；
图2是本发明中实施例2的分析板检测结果；
图3是本发明中实施例2的Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果；
图4是本发明中实施例2的测试数据表；
图5是本发明中实施例3的分析板检测结果；
图6是本发明中实施例3的Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果；
图7是本发明中实施例3的测试数据表；
图8是本发明中实施例4的分析板检测结果；
图9是本发明中实施例4的Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果；
图10是本发明中实施例4的测试数据表。
图中：1、合成板装置；2、96微孔板；3、氨解盒夹具；4、氨解盒。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
请参阅图1所示，本实施例为高GC含量的核酸引物的后处理方法，包括以下步骤：
步骤一：氨解前处理；
步骤二、氨解；
步骤三、清洗；
步骤四、洗脱。
氨解前处理的具体步骤如下：
S21、将装有核酸引物的合成板装置1配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s；
S22、往合成板装置1的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次；
S23、再往合成板装置1的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次。
所述氨解的具体步骤如下：
S31、切割：在合成板装置1底部放置一块新的96微孔板2，往合成板装置1的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具3放于氨解盒4中，在温度为40℃的条件下氨解1小时；
S32、脱保护：配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置1，保留底部96微孔板2，并在96微孔板2的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具3放于氨解盒4中，在温度为90℃的条件下氨解1小时。
所述清洗的具体步骤如下：
S41、在抽滤装置上放入合成板装置1，往合成板装置1的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次；
S42、配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min；
所述洗脱的具体步骤如下：
往合成板装置1的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s。
实施例2:
使用轮次为200828H5H6，A1-H5为超纯水溶剂洗脱，A6-H12为3wt％三乙胺溶剂洗脱的检测方法对实施例1中的核酸引物进行检测，分析板检测结果如图2所示：碱基位置正确，条带清晰，无双带、拖带；Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果如图3所示:主峰单一，无杂质峰或杂质峰占比极小；200828H5H6(E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7&E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7)(48-48-51-43-48-48-48&48-42-45-48-48-47-48)的测试数据如图4所示。
该检测方法显示为3wt％三乙胺溶剂洗脱的结果较好。
实施例3：
使用轮次为200828A3，A1-H8为3wt％三乙胺溶剂洗脱，A9-H12为超纯水溶剂洗脱的检测方法对实施例1中的核酸引物进行检测，分析板检测结果如图5所示：碱基位置正确，条带清晰，无双带、拖带；Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果如图6所示:主峰单一，杂质峰占比极小；200828A3(C7-E2-A8-D8-B2-G3-C2-F8-G2-A11-E12-G6-C11)(27-26-22-24-25-23-22-22-22-22-22-22-22)的测试数据如图7所示。
该检测方法显示为3wt％三乙胺溶剂洗脱的结果较好。
实施例4：
使用轮次为200723A3A4，A1-H9为3wt％三乙胺溶剂洗脱，A10-H12为超纯水溶剂洗脱的检测方法对实施例1中的核酸引物进行检测，分析板检测结果如图8所示：碱基位置正确，条带清晰，无双带、拖带；Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果如图9所示:主峰单一，无杂质峰；200723A3A4(A1-D2-E3-G5-C10-H12&D1-A3-E1-E11-C4-D9-F11)(49-49-49-49-49-49&49-49-47-47-49-49-49)的测试数据如图10所示。
该检测方法显示为3wt％三乙胺溶剂洗脱的结果较好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.高GC含量的核酸引物的后处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：氨解前处理；
步骤二、氨解；
步骤三、清洗；
步骤四、洗脱；
氨解前处理的具体步骤如下：
S21、将装有核酸引物的合成板装置(1)配平后放入离心机离心，在转速为2600r/min的条件下高速离心5s；
S22、往合成板装置(1)的每孔内加入140μL的二乙胺、乙腈混合液，静置5min后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min,重复2次；
S23、再往合成板装置(1)的每孔内加入200μL清洗乙腈，静置10s后负压抽干，配平高速离心，在转速为3200r/min的条件下离心1min，重复4次；
所述氨解的具体步骤如下：
S31、切割：在合成板装置(1)底部放置一块新的96微孔板(2)，往合成板装置(1)的每孔内加入40μL氨解液，通过氨解盒夹具(3)放于氨解盒(4)中，在温度为40℃的条件下氨解1小时；
S32、脱保护：配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min后弃去合成板装置(1)，保留底部96微孔板(2)，并在96微孔板(2)的基础上，加入50μL氨解液，通过氨解盒夹具(3)放于氨解盒(4)中，在温度为90℃的条件下氨解1小时；
所述清洗的具体步骤如下：
S41、在抽滤装置上放入合成板装置(1)，往合成板装置(1)的每孔内加入200μL乙腈溶剂静置5s后负压抽干，重复2次；
S42、配平，在转速为2400r/min的条件下高速离心1min；
所述洗脱的具体步骤如下：
往合成板装置(1)的每孔内加入150μL的3wt％三乙胺溶剂，静置30s后，在转速为300r/min的条件下离心1min，之后在转速为600r/min的条件下离心1min，之后在转速为1000r/min的条件下离心30s，之后在转速为1500r/min的条件下离心30s，之后在转速为2000r/min的条件下离心30s，之后在转速为2400r/min的条件下离心30s。
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| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 239000 No.69, qifushi West Road, Chuzhou economic and Technological Development Zone, Anhui Province Applicant after: General Biology (Anhui) Co.,Ltd. Address before: 239000 No.69, qifushi West Road, Chuzhou economic and Technological Development Zone, Anhui Province Applicant before: GENERAL BIOSYSTEMS (ANHUI), Inc. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |