CN110106165A - 一种硫代修饰引物氨解纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，包括如下步骤：第一步、预纯化：将DNA片段粗品经泵抽吸，流过纯化柱，对DNA片段粗品进行预纯化，得到DNA片段预纯物；第二步、前处理：将第一步的DNA片段预纯物滴加到96微孔板上，接着滴加乙腈，之后放入离心机中离心，离心完成后取出96微孔板，人工滴加灭菌水，之后再放入离心机中离心；第三步、氨解纯化。本发明通过氨解反应使含有各种保护官能团的单体在氨气的作用下脱保护生成游离引物，同时采用反相净化滤芯对引物进行纯化，操作简便，纯化效果优异，是一种有效且更加经济的纯化方式，且纯度能够达到98％以上。

Description

一种硫代修饰引物氨解纯化的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种硫代修饰引物氨解纯化的方法。

背景技术

引物(primer)是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3'-0H上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-0H，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5→3方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3'→5磷酸二酯键连接。

反义寡核苷酸是人工合成的DNA或RNA单链片段，其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA杂交，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA使其丧失功能，从而发挥治疗作用。反义核酸药物可用于病毒性疾病、心血管系统疾病、感染性疾病以及癌症等许多疾病的治疗，与传统药物相比，反义药物具有更高的特异性、更优的疗效和更低的毒性。为了增加天然反义寡核苷酸的稳定性、提高其生物利用度，必须对反义核酸进行适当的化学修饰。硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰(许多人选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰)。

氨解反应是指含有各种保护官能团的单体在氨气的作用下脱保护生成游离引物的过程，主要原理是将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来，用冰氨水来裂解CPG连接化合物与初始核苷间的酯键，断裂下来的寡核苷酸带有自由的3羟基。脱保护基一用冰氨水处理较长时间以脱掉碱基环上的氰乙基、苯甲酰基、异丙基等保护基团。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，包括预纯化、氨解前处理和氨解纯化等步骤，通过氨解反应使含有各种保护官能团的单体在氨气的作用下脱保护生成游离引物，同时采用反相净化滤芯对引物进行纯化，操作简便，纯化效果优异，是一种有效且更加经济的纯化方式，且纯度能够达到98％以上。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，包括如下步骤：

第一步、氨解：

使用气相氨解仪，同时添加气相氨解液，在高纯氨气水蒸汽混合物的气相氨解环境下氨解3.5个小时，将连接在CPG载体上的引物切割洗脱下来，能有效地去除盐分，得到DNA片段粗品；

第二步、预纯化：

将DNA片段粗品经泵抽吸，流过纯化柱，流速控制为2-4mL/min，对DNA片段粗品进行预纯化，得到DNA片段预纯物；

其中，纯化柱内有上下两层滤膜，两层滤膜之间装有HAP树脂；

第三步、进一步处理：

将第二步的DNA片段预纯物滴加到96微孔板上，接着人工滴加乙腈，之后放入离心机中离心，以去除合成中产生的杂质；

离心完成后取出96微孔板，人工滴加灭菌水，之后再放入离心机中离心，进一步纯化合成产物；

第四步、纯化：

将上个步骤中进一步处理后的产物经过有机溶剂的梯度洗脱，得到纯化后的硫代修饰引物。

进一步地，第二步中所述缓冲液为60％的甲醇水溶液。

进一步地，第二步中所述滤膜为过滤复合纤维膜，由如下方法制成：

(1)将N,N-二甲基甲酰胺与丙酮按照质量之比为7:3混合，常温100r/min搅拌30min，得到混合溶剂；

(2)称取聚偏二氟乙烯粉末、氧化石墨烯，其中，氧化石墨烯的加入量为聚偏二氟乙烯量的5％，先于75℃烘箱中干燥3-4h，再按照固液比1g：5-6mL加入混合溶剂中，常温150r/min搅拌40-50min，制备得到静电纺丝液；

(3)通过静电纺丝技术将静电纺丝液纺制成纤维膜，并于60℃烘箱中干燥3-4h，制备得到过滤复合纤维膜。

本发明的有益效果：

本发明在氨解后对引物粗产物进行了预纯化过程，通过纯化柱对粗产物进行预纯化，纯化柱内有上下两层滤膜，两层滤膜之间装有HAP树脂，DNA片段物流过纯化柱，杂质颗粒过滤在滤膜外，盐液经过HAP树脂层时，HAP树脂将5′端带有DMT保护基的DNA片段吸附上去，而一些盐类物质直接通过滤膜流入废液中，然后再用相应的缓冲液将DNA片段预纯物洗脱下来，经测试，通常50D的DNA片段粗品只需7-8分钟便可以完成预纯化；其中，采用的滤膜为过滤复合纤维膜，聚偏二氟乙烯(PVDF)纳米纤维膜具有高过滤效率，但是存在高的过滤阻力；通过在聚偏二氟乙烯中掺入氧化石墨烯，能够在PVDF纳米纤维膜高过滤效率的基础上，一方面利用氧化石墨烯的导电性降低PVDF纳米纤维直径，提高过滤效率，降低过滤阻力；另一方面利用氧化石墨烯的吸附性能提升复合纳米纤维膜的过滤性能，制备得到高过滤效率、低过滤阻力复合纤维过滤膜，经测试，过滤效率高达99.99％,过滤阻力仅为11.53Pa/μm；DNA片段粗品经过该过滤复合纤维膜，能够去除掉杂质颗粒(包括大粒径和小粒径)，有益于后续的氨解纯化过程；

本发明通过氨解反应使含有各种保护官能团的单体在氨气的作用下脱保护生成游离引物，同时采用反相净化滤芯对引物进行纯化，操作简便，纯化效果优异，是一种有效且更加经济的纯化方式，且纯度能够达到98％以上。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，包括如下步骤：

第一步、氨解：

使用气相氨解仪，同时添加气相氨解液，在高纯氨气水蒸汽混合物的气相氨解环境下氨解3.5个小时，将连接在CPG载体(96微孔板)上的引物切割洗脱下来，能有效地去除盐分，得到DNA片段粗品；

第二步、预纯化：

将DNA片段粗品经泵抽吸，流过纯化柱，流速控制为2-4mL/min，对DNA片段粗品进行预纯化，得到DNA片段预纯物；

其中，纯化柱内有上下两层滤膜，两层滤膜之间装有HAP树脂，DNA片段物流过纯化柱，杂质颗粒过滤在滤膜外，盐液经过HAP树脂层时，HAP树脂将5′端带有DMT保护基的DNA片段吸附上去，而一些盐类物质直接通过滤膜流入废液中，然后再用相应的缓冲液将DNA片段预纯物洗脱下来，经测试，通常50D的DNA片段粗品只需7-8分钟便可以完成预纯化；

所述缓冲液为60％的甲醇水溶液；

所述滤膜为过滤复合纤维膜，由如下方法制成：

(1)将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与丙酮按照质量之比为7:3混合，常温100r/min搅拌30min，得到混合溶剂；

(2)称取聚偏二氟乙烯(PVDF)粉末、氧化石墨烯，其中，氧化石墨烯的加入量为聚偏二氟乙烯量的5％，先于75℃烘箱中干燥3-4h，再按照固液比1g：5-6mL加入混合溶剂中，常温150r/min搅拌40-50min，制备得到静电纺丝液；

(3)通过静电纺丝技术将静电纺丝液纺制成纤维膜，并于60℃烘箱中干燥3-4h，制备得到过滤复合纤维膜；

聚偏二氟乙烯(PVDF)纳米纤维膜具有高过滤效率，但是存在高的过滤阻力；通过在聚偏二氟乙烯中掺入氧化石墨烯，能够在PVDF纳米纤维膜高过滤效率的基础上，一方面利用氧化石墨烯的导电性降低PVDF纳米纤维直径，提高过滤效率，降低过滤阻力；另一方面利用氧化石墨烯的吸附性能提升复合纳米纤维膜的过滤性能，制备得到高过滤效率、低过滤阻力复合纤维过滤膜，经测试，过滤效率高达99.99％,过滤阻力仅为11.53Pa/μm；DNA片段粗品经过该过滤复合纤维膜，能够去除掉杂质颗粒(包括大粒径和小粒径)，有益于后续的氨解纯化过程；

第三步、进一步处理：

将第二步的DNA片段预纯物滴加到96微孔板上，接着人工滴加乙腈，之后放入离心机中离心，以去除合成中产生的杂质(如腈乙基、钠盐)；

离心完成后取出96微孔板，人工滴加灭菌水，之后再放入离心机中离心，进一步纯化合成产物，其中，乙腈和灭菌水的具体参数如下所示：

第四步、纯化：

将上个步骤中进一步处理后的产物经过有机溶剂的梯度洗脱，得到纯化后的硫代修饰引物；

在本实施例中，选择Biolytic气相氨解仪；

实施例1

0226H1-TEST(逗点载体)

A1-F1:气相氨解3.5小时

G1-D2:气相氨解+气相氨解液氨解3.5小时。

E2-B3:正丁胺氨解3.5小时。

Thermo LTQ-XL质谱仪检测结果显示:气相氨解+气相氨解液效果较好，质谱检测主峰单一，无杂质峰或杂质峰占比极小。

实施例2

0224H3(迪纳载体)

气相氨解3小时，出现氨解不充分现象，质谱检测主峰明确，但是主峰后面的杂质峰较多。

0227H1H2(迪纳载体)

气相氨解3.5小时，未出现氨解不充分现象，质谱检测主峰单一，无杂质峰或杂质峰占比极小。

实施例3

0304H1H2/O1O2(迪纳载体)

加氨解液气相氨解3.5小时，出现氨解不充分现象，质谱检测主峰明确，但是主峰后面的杂质峰较多。

0305H1H2/O9O10(迪纳载体)

不加氨解液，气相氨解3.5小时，未出现氨解不充分现象，质谱检测主峰单一，无杂质峰或杂质峰占比极小。

备注：0305H1H2/O9O10是0304H1H2/O1O2的重合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (3)

1.一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、氨解：

使用气相氨解仪，同时添加气相氨解液，在高纯氨气水蒸汽混合物的气相氨解环境下氨解3.5个小时，将连接在CPG载体上的引物切割洗脱下来，能有效地去除盐分，得到DNA片段粗品；

第二步、预纯化：

将DNA片段粗品经泵抽吸，流过纯化柱，流速控制为2-4mL/min，对DNA片段粗品进行预纯化，得到DNA片段预纯物；

其中，纯化柱内有上下两层滤膜，两层滤膜之间装有HAP树脂；

第三步、进一步处理：

将第二步的DNA片段预纯物滴加到96微孔板上，接着人工滴加乙腈，之后放入离心机中离心，以去除合成中产生的杂质；

离心完成后取出96微孔板，人工滴加灭菌水，之后再放入离心机中离心，进一步纯化合成产物；

第四步、纯化：

将上个步骤中进一步处理后的产物经过有机溶剂的梯度洗脱，得到纯化后的硫代修饰引物。

2.根据权利要求1所述的一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，其特征在于，第二步中所述缓冲液为60％的甲醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种硫代修饰引物氨解纯化的方法，其特征在于，第二步中所述滤膜为过滤复合纤维膜，由如下方法制成：

(1)将N,N-二甲基甲酰胺与丙酮按照质量之比为7:3混合，常温100r/min搅拌30min，得到混合溶剂；

(2)称取聚偏二氟乙烯粉末、氧化石墨烯，其中，氧化石墨烯的加入量为聚偏二氟乙烯量的5％，先于75℃烘箱中干燥3-4h，再按照固液比1g：5-6mL加入混合溶剂中，常温150r/min搅拌40-50min，制备得到静电纺丝液；

(3)通过静电纺丝技术将静电纺丝液纺制成纤维膜，并于60℃烘箱中干燥3-4h，制备得到过滤复合纤维膜。