CN103833797A - 一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法 - Google Patents
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Abstract
一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法,包括自动液相层析仪和离子交换纯化柱,流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器;纯化层析体系选择;步骤包括:原料液处理,在线监测,上样、分离、洗脱,目的组分收集,纯化柱为直径100mm,装填层析填料1000ml;流动相组成:A:20mM氢氧化钠水溶液;B:20mM氢氧化钠+2.5M氯化钠水溶液;步骤(2)选择紫外波长为290nm;步骤(3)上样量为上样原料液150ml;其分步骤为:①A液平衡层析柱;②用80%-60%A液、20%-40%的B液洗脱;③用60%-20%A液、40%-80%的B液进行洗脱;④用20%A液、80%的B液洗脱;步骤(4)纯度>95%以上的样品组分进入后续脱盐工序,产率达70%,纯度大于95%。
Description
技术领域:
本发明涉及寡核苷酸加工方法,特别是一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法。
背景技术:
现有纯化硫代寡核苷酸方法多处于实验室生产或小规模生产,其方法为:
1、本工艺采用中低压离子交换层析法纯化目的物。纯化系统由自动液相层析仪和离子交换纯化柱组成。自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器;纯化柱是体积1ml的预装阴离子交换柱,柱填料为强阴离子交换材料季铵化的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物。
原理:在离子交换层析中,溶质依据所带电荷的不同及其与离子交换填料静电作用力的差异而获得分离。硫代寡核苷酸分子骨架上的硫代磷酸基团带有负电荷,链长度不同则所带电荷数不同。基于这种特点,可以使用阴离子交换色谱柱将不同长度的硫代寡核苷酸分离。
2、对上道合成硫代寡核苷酸工序的中间产品需要进行纯化,中间产品作为原料液进行过滤,去除固体基质,取清液作为上样原料液;
3、纯化层析体系选择:硫代寡核苷酸将使用10%乙腈—氯化钠溶液进行浓度梯度洗脱。
原理:随着氯离子浓度的增大,不同电荷数的硫代寡核苷酸从强阴离子交换树脂上依次洗脱,得到分离纯化。本方法的主要不足在于整个洗脱过程溶液的pH值偏低,过程中会产生核酸链自身互补形成二级结构的可能,并有核酸聚集成团,从而造成目的组分损失。
4、上样和分离、洗脱:起动纯化仪,开始在线监测。每次纯化上样量1ml,含目的物约1mg。具体层析纯化操作如下:10%乙腈水溶液—10%乙腈+2mol氯化钠溶液作为流动相,线性梯度洗脱,流速:0.5ml/min。
5、在线监测260nm处紫外吸收峰。收集最大吸收峰处的组分。洗脱时,当主组分峰上升到90%时开始收集,下降到80%时停止收集,可以得到纯度较高的产物。
原理:寡核苷酸在260nm处有最大吸收峰。
6、完成一次纯化过程,可得到ug量级的目的物,纯度>90%,得率约30%。
上述生产方法的缺陷在于:不能大规模工业化生产,目的物纯度低,得率低。
发明内容:
本发明的目的在于克服上述缺陷,提供一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法。
本发明的方案是:生产设备包括自动液相层析仪和离子交换纯化柱,自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器;包括纯化层析体系选择;生产步骤包括:⑴原料液处理,⑵在线监测,⑶上样、分离、洗脱,⑷目的组分收集,其特征在于:自动液相层析仪器的纯化柱为直径100mm的不锈钢柱,装填层析填料1000ml;流动相组成:A:20mM氢氧化钠水溶液、B:20mM氢氧化钠+2.5M氯化钠水溶液;
生产步骤(2)起动纯化仪,开始在线监测,选择紫外监测器的紫外波长为290nm;
步骤(3)上样、分离、洗脱:每次纯化上样量为上样原料液150ml;
其分步骤为:
分步骤①用液量为1个层析柱体积的流动相A液平衡层析柱,然后以100ml/min快速上样;
分步骤②用80%-60%流动相A液、20%-40%的流动相B液进行洗脱,液量为6个层析柱体积,洗脱过程流速为120ml/min;
分步骤③用60%-20%流动相A液、40%-80%的流动相B液进行洗脱,液量为4个层析柱体积,同时开始分段收集紫外最大吸收峰处的洗脱液,洗脱过程流速为120ml/min;
分步骤④用20%流动相A液、80%的流动相B液进行洗脱,液量为1个层析柱体积,洗脱过程流速为120ml/min;
步骤(4)生产中分段收集的各组分,经高效液相色谱测定,纯度>95%以上的样品组分可混合进入后续脱盐工序,最终得到目的产物。
本发明的优点在于:
1、现有纯化条件下,一次可以完成约10克目的产物的纯化,产率可达理论量的70%。
2、多批纯化脱盐样品,经反相高效液相色谱法检测,纯度均大于95%。
3、经核磁共振法测定磷谱,样品未全硫代物均未检出(表明产物全硫代率高,未全硫代的失败物被完全分离去除)。
具体实施方式:
本工艺采用中低压离子交换层析法纯化目的物。纯化系统由自动液相层析仪和离子交换纯化柱组成。自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器;纯化柱为大不锈钢柱,直径100mm,装填层析填料1000ml;层析分离用柱填料为强阴离子交换材料聚苯乙烯二乙烯基苯的季铵盐化合物。
原理:在离子交换层析中,溶质依据所带电荷的不同及其与离子交换填料静电作用力的差异而获得分离。硫代寡核苷酸分子骨架上的硫代磷酸基团带有负电荷,链长度不同则所带电荷数不同。基于这种特点,可以使用阴离子交换色谱柱将不同长度的硫代寡核苷酸分离。
纯化层析液体系选择:合成粗产物进行过滤,去除固体基质,溶液旋转蒸发浓缩,加入少量氢氧化钠溶液溶解。选择氢氧化钠—氯化钠水溶液体系作为纯化层析的流动相。缓冲液是20mM的氢氧化钠溶液,硫代寡核苷酸使用氯化钠溶液进行浓度梯度洗脱。
原理:选用氢氧化钠作为缓冲液,是因为它可以层析液系统的pH控制在≥12,使核酸链变性,从而减小了核酸链自身互补形成二级结构的可能,并防止核酸聚集成团,大大改善分离效果。对某些寡核苷酸,在缓冲液系统中加入适当有机溶剂似乎可以提高产物的回收率,但对纯度无任何改变。加入有机溶剂可能出现较大问题,例如:导致缓冲液粘稠度加大,盐溶解困难。特别是大规模纯化样品需要大量的流动相,加入大量有机溶剂还需要额外的溶液处理,并且还带来环保的问题。基于以上原因,我们不在缓冲液中加入任何有机溶剂。
上样和分离、洗脱:每次纯化上样量约150ml,含目的物约8-10克。
流动相组成:
A:20mM氢氧化钠水溶液
B:20mM氢氧化钠+2.5M氯化钠水溶液
具体层析纯化操作梯度如下:
首先用100%的A液,平衡层析柱1个体积;以100ml/min快速上样,接着用20%-40%的B液,洗脱6个体积;而后用40%-80%B液,洗脱4个体积,同时开始收集目的组分;最后用80%B液洗脱1个体积;洗脱过程流速均为120ml/min.
原理:本DNA纯化仪使用双泵,流速可达200ml/min,且柱填料亦可耐受高压。使用较高流速可缩短纯化时间,但降低纯化效果。通过实际测试,确定纯化过程中流速保持在100-120ml/min。强阴离子交换材料聚苯乙烯二乙烯基苯交换介质离子具有较大的容量。大量上样未发现组分在梯度上升前有穿透现象,但会因组分扩散等作用影响到样品分离效果,上样体积不宜过大,对1000ml离子交换柱通常保持每柱上样体积为150ml左右,而且采用纯化泵大流速(100ml/min)快速进样。
通过对包括组合步骤和梯度在内的不同线形和梯度的试验,我们发现要实现目的组分和N-1失败序列片断杂质的分离需要一个相当平缓的浓度梯度。而在其它部分,梯度斜率可以加大,甚至可以直接实行梯度跳跃。为了实现杂质更彻底的去除,在纯化前期可以使用一个较陡的梯度,这可以保证目的序列洗脱之前较短的合成序列被充分去除。之后,目的物被洗脱
目的组分在线监测和收集:在线快速联机紫外监测器设定290nm波长监测目的组分出峰位置,分段收集紫外最大吸收峰处的洗脱液,综合考虑生产成本和产品质量两方面因素,生产中分段收集的各组分,经高效液相色谱测定,纯度>95%以上的样品组分可混合进入后续脱盐工序,最终得到目的产物。
原理:寡核苷酸在260nm处有最大吸收峰,但在大规模纯化中,由于上样量较大,若在260nm处监测,由于过高的浓度使紫外吸收过载,在峰开始和下降时都处于饱和,导致差的层析分离。而寡核苷酸在290nm有相对小的吸光系数,在较大的载样时,仍能产生清楚的色谱峰,有利于目的组分的收集。
Claims (1)
1.一种纯化硫代寡核苷酸的工业化方法,生产设备包括自动液相层析仪和离子交换纯化柱,自动液相层析仪配有多元梯度泵、流动相自动切换系统、在线紫外监测器和pH监测器;包括纯化层析体系选择;生产步骤包括:⑴原料液处理,⑵在线监测,⑶上样、分离、洗脱,⑷目的组分收集,其特征在于:自动液相层析仪器的纯化柱为直径100mm的不锈钢柱,装填层析填料1000ml;流动相组成:A:20mM氢氧化钠水溶液、B:20mM氢氧化钠+2.5M氯化钠水溶液;
生产步骤(2)起动纯化仪,开始在线监测,选择紫外监测器的紫外波长为290nm;
步骤(3)上样、分离、洗脱:每次纯化上样量为上样原料液150ml;
其分步骤为:
分步骤①用液量为1个层析柱体积的流动相A液平衡层析柱,然后以100ml/min快速上样;
分步骤②用80%-60%流动相A液、20%-40%的流动相B液进行洗脱,液量为6个层析柱体积,洗脱过程流速为120ml/min;
分步骤③用60%-20%流动相A液、40%-80%的流动相B液进行洗脱,液量为4个层析柱体积,同时开始分段收集紫外最大吸收峰处的洗脱液,洗脱过程流速为120ml/min;
分步骤④用20%流动相A液、80%的流动相B液进行洗脱,液量为1个层析柱体积,洗脱过程流速为120ml/min;
步骤(4)生产中分段收集的各组分,经高效液相色谱测定,纯度>95%以上的样品组分可混合进入后续脱盐工序,最终得到目的产物。
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CN110106165A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-09 | 通用生物系统(安徽)有限公司 | 一种硫代修饰引物氨解纯化的方法 |
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CN1150431A (zh) * | 1994-04-08 | 1997-05-21 | 海布里顿公司 | 用阴离子交换层析法纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯 |
CN1514842A (zh) * | 2001-06-07 | 2004-07-21 | ISISҩ�﹫˾ | 提纯寡核苷酸的方法 |
CN1643145A (zh) * | 2002-03-21 | 2005-07-20 | 艾夫西亚生物科技公司 | 寡核苷酸及其类似物的纯化方法 |
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2012
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PB01 | Publication | ||
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