CN104031059A - 一种埃博霉素的膜提取分离工艺 - Google Patents
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Abstract
一种埃博霉素的膜提取分离工艺，将埃博霉素a,b发酵液经过有机膜过滤，得到有机膜过滤液，有机膜过滤液再经陶瓷膜过滤后得到陶瓷膜过滤液；然后上凝胶色谱柱洗脱，分段收集经过HPLC检测的洗脱液，得到的洗脱液再经纳滤膜浓缩，将得到的浓缩液经过正相硅胶色谱洗脱，分段收集经过HPLC检测的洗脱液，将分别收集到的洗脱液低温结晶后得到埃博霉素a,b结晶。所述有机膜规格为5000~6000截留分子量。陶瓷膜规格为1000~1500截留分子量。纳滤膜为500~800截留分子量。结晶温度为-30℃~-10℃。本发明采用正相色谱分离出浓缩液中的埃博霉素a,b，减少了有机溶剂的使用量，简化了提取工艺，降低了成本。
Description
技术领域
本发明属于一种抗肿瘤化合物的过滤提取方法，具体涉及一种埃博霉素的膜提取分离工艺。
背景技术
埃博霉素 (epothilone)是一类大环内酯类化合物，具有很强的抗肿瘤活性，能在较低的浓度杀死癌细胞，生物合成主要是通过粘细菌发酵来生产埃博霉素，生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，在相关人体细胞系中研究后发现，埃博霉素a抗癌效果弱于紫杉醇，而埃博霉素b抗癌效果强于紫杉醇，目前主要以埃博霉素b的效价来衡量产量。
生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，其过滤一般是通过树脂解析的方法，但昂贵的设备，提取量小，并且埃博霉素a,b不能高效的分离，已成为目前制约埃博霉素a,b工业化生产的一个因素之一。
膜是具有选择性分离功能的材料。利用膜的选择性分离可以实现不同组分的分离、纯化、浓缩的过程。埃博霉素a,b在提取的过程中往往要用一些化学溶剂如甲醇/丙酮等进行解析，膜分离是典型的物理分离过程，不用化学试剂和添加剂，对环境保护有着积极的意义。
发明内容
本发明的目的是针对目前埃博霉素提取分离方法的缺陷，提供一种埃博霉素的膜提取分离工艺，该方法达到了埃博霉素a,b的高效分离。
为了达到成目的，本发明采用的技术方案如下：
一种埃博霉素的膜提取分离工艺，包括以下步骤：
1）将埃博霉素发酵液经过有机膜过滤，得到有机膜过滤液，再以过滤液20%体积量的蒸馏水进行清洗，合并有机膜过滤液和洗液，再经陶瓷膜过滤后得到陶瓷膜过滤液；再以过滤液10%体积量的蒸馏水进行清洗膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa；
2）将步骤1）得到的陶瓷膜过滤液和洗液上凝胶色谱柱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,收集到的洗脱液再经纳滤膜浓缩，得到纳滤浓缩液后，将浓缩液经过正相硅胶色谱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，将分别收集到的洗脱液低温结晶后分别得到埃博霉素a和b结晶；膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa。
步骤1）中所述有机膜规格为5000~6000截留分子量。
步骤1）中所述陶瓷膜规格为1000~1500截留分子量。
步骤1）中所述蒸馏水清洗流程为每次添加5%体积量的洗液进行容器和膜的润洗。
步骤2）中所述凝胶色谱柱为SephadexG-15。
步骤2）中所述凝胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:1~7配置而成。
步骤2）中所述纳滤膜为500~800截留分子量。
步骤2）中所述正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为5-10 ：1。
步骤2）中所述正相硅胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：1~6配置而成。
步骤2）中所述低温结晶温度为-30℃~-10℃。
有益效果：本发明采用有机膜、陶瓷膜进行过滤分离，埃博霉素a,b发酵液中的杂质大分子95%以上都得以去除，提高了滤液品质；本发明采用凝胶色谱、纳滤膜进行浓缩，基于膜的高效性，大幅度提升了产品质量，降低了产品成本和操作难度；本发明采用正相凝胶色谱洗脱，低温结晶分别提取出浓缩液中的埃博霉素a,b，达到了埃博霉素a,b的高效分离，减少了有机溶剂的使用量，优化了提取工艺，降低了成本。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步描述，
将本实验室筛选出的埃博霉素高产菌YU-970（保藏编号：CCTCC NO：M 2014144）的10L发酵罐中加入沉降体积为10%的XAD-16大孔吸附树脂，发酵结束后，取树脂于38℃烘箱内烘干，并加入5ml蒸馏水浸泡每株突变菌株发酵的树脂，浸泡树脂24h解析并收集两次解析液，得到本实验所用埃博霉素发酵液，经HPLC检测产量埃博霉素a含量为320mg/L,埃博霉素b含量为230mg/L，总含量为550mg/L。
埃博霉素发酵液并不限定于上述发酵液，可以使用任何菌株发酵所得的含埃博霉素a,b成分的发酵液。
实施例1
将100ml经HPLC检测得到埃博霉素a,b含量为550mg/L的发酵液经过有机膜过滤，有机膜规格为5000截留分子量，得到滤液、洗液合计103ml，再将滤液和洗液通过陶瓷膜过滤，陶瓷膜规格为1000截留分子量，得到滤液、洗液合计76ml，洗液用普通蒸馏水，将收集到的滤液和洗液通过SephadexG-15凝胶色谱柱洗脱，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:7配置而成，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,得到58ml洗脱液，再将洗脱液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤膜为500截留分子量，得到48ml浓缩液，浓缩液经过正相凝胶色谱洗脱分离，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：6配置而成；
正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为10 ：1，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，置于-20℃下进行低温结晶，得到28g埃博霉素a白色粉针状结晶，21g埃博霉素b白色粉末针状结晶。经过HPLC检测得出，埃博霉素a,b提纯率均达到85%以上，纯度达到95%以上。
实施例2
将100ml经HPLC检测得到埃博霉素a,b含量为550mg/L的发酵液经过有机膜过滤，有机膜规格为5500截留分子量，得到滤液、洗液合计98ml，再将滤液和洗液通过陶瓷膜过滤，陶瓷膜规格为1000截留分子量，得到滤液、洗液合计75ml，洗液用普通蒸馏水，将收集到的滤液和洗液通过SephadexG-15凝胶色谱柱洗脱，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:7配置而成，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,得到52ml洗脱液，再将洗脱液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤膜为500截留分子量，得到43ml浓缩液，浓缩液经过正相凝胶色谱洗脱分离，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：6配置而成；
正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为5 ：1，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，置于-20℃下进行低温结晶，得到的27g埃博霉素a白色粉针状结晶，20g埃博霉素b白色粉末针状结晶。经过HPLC检测得出，埃博霉素a,b提纯率均达到85%以上，纯度达到95%以上。
实施例3
将100ml经HPLC检测得到埃博霉素a,b含量为550mg/L的发酵液经过有机膜过滤，有机膜规格为6000截留分子量，得到滤液、洗液合计99ml，再将滤液和洗液通过陶瓷膜过滤，陶瓷膜规格为1000截留分子量，得到滤液、洗液合计72ml，洗液用普通蒸馏水，将收集到的滤液和洗液通过SephadexG-15凝胶色谱柱洗脱，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:7配置而成，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,得到53ml洗脱液，再将洗脱液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤膜为500截留分子量，得到48ml浓缩液，浓缩液经过正相凝胶色谱洗脱分离，洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：6配置而成；
正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为8 ：1，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，置于-20℃下进行低温结晶，得到的29g埃博霉素a白色粉针状结晶，21g埃博霉素b白色粉末针状结晶。经过HPLC检测得出，埃博霉素a,b提纯率均达到85%以上，纯度达到95%以上。
埃博霉素检测方法：
试剂：色谱丙酮
检测条件：流动相为丙酮：水=7:3；流速为1.0mL/min；检测波长为249nm，进样品量20μL。
（1）标样的制备：准确称取埃博霉素a，埃博霉素b标准品0.02g（精确至0.0002g)溶于50ml容量瓶中，用色谱丙酮溶解并定容至刻度，再用移液管取1ml至10ml容量瓶，色谱丙酮溶解，并定容至刻度，备用。
（2）样品的检测：在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样埃博霉素峰面积相对变化小于1.5%后，再将制备好的样品进样检测。
计算方法=埃博霉素产量（mg/L)=（样品峰面积/标准品峰面积）*标准品浓度*稀释倍数。
Claims (10)
1.一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于包括以下步骤：
1）将埃博霉素发酵液经过有机膜过滤，得到有机膜过滤液，再以过滤液20%体积量的蒸馏水进行清洗，合并有机膜过滤液和洗液，再经陶瓷膜过滤后得到陶瓷膜过滤液；再以过滤液10%体积量的蒸馏水进行清洗，膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa；
2）将步骤1）得到的陶瓷膜过滤液和洗液上凝胶色谱柱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,收集到的洗脱液再经纳滤膜浓缩，得到纳滤浓缩液后，将浓缩液经过正相硅胶色谱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，将分别收集到的洗脱液低温结晶后分别得到埃博霉素a和b的结晶；膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa。
2.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤1）中所述有机膜规格为5000~6000截留分子量。
3.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤1）中所述陶瓷膜规格为1000~1500截留分子量。
4.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤1）中所述蒸馏水清洗流程为每次添加过滤液5%体积量的洗液进行容器和膜的润洗。
5.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述凝胶色谱柱为SephadexG-15。
6.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述凝胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:1~7配置而成。
7.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述纳滤膜为500~800截留分子量。
8.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为5-10 ：1。
9.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述正相硅胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：1~6配置而成。
10.根据权利要求1所述的一种埃博霉素的膜提取分离工艺，其特征在于：步骤2）中所述低温结晶温度为-30℃~-10℃。
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|---|---|---|---|---|
| CN104761635A (zh) * | 2015-03-24 | 2015-07-08 | 靖江至高生物科技有限公司 | 一种水蛭素提取分离的工艺 |
| CN107987110A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-04 | 陕西麦可罗生物科技有限公司 | 一种春雷霉素浓缩液的脱盐方法 |
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2014
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| CN107987110A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-04 | 陕西麦可罗生物科技有限公司 | 一种春雷霉素浓缩液的脱盐方法 |
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| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140910 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |