CN1150431A - 用阴离子交换层析法纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了分离和纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的改进方法,我们首次应用DMAE离子交换层析来分离和纯化寡核苷酸硫代磷酸酯。我们发现通过改变所选用的条件,可得到极好的分离效果。尤其是,我们已能用比以往文献中已报道的更高的pH和更低的盐浓度来获得长达约35个核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯的层析分离产品。
Description
本发明的背景
本发明涉及对寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯(oligodeoxynucleotidephosphorothioate)的纯化的领域。
为了治疗的目的,在有选择性的基因调节的领域内,以已修饰磷酸骨架的寡脱氧核苷酸作为抗致敏寡核苷酸(antisense oligonucleotide)来使用,这一点在近几年来已引起越来越多的注意。有许多类型的经修饰的磷酸键,如甲基膦酸酯(methyl phosphonate),硫代磷酸酯,磷酰胺酯它们已被结合进抗致敏寡核苷酸和研究中。如Erickson and Izant(Eds.),Gene Regulation:Biology ofAntisense RNA and DNA(Raven Press,New York 1992)。举例如寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯已被发现来抑制组织培养中的免疫缺陷病毒(Agrawal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,7079(1988);Agrawal et al.,proc.Natl.Acad.Sci.USA86,7790(1989);Agrawal et al.,in Advanced Drug Delivery Reviews 6,251(R.Juliano,Ed,Elsevier,Amsterdam,1991);Agrawal et al.,in Prospects for AntisenseNucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS,143(E.Wickstrom,Ed.,Wiley/Liss,New York,1991;Zamecnik and Agrawal in Annual Review of AIDS Research,301(Koff et al.,Eds.,Dekker,New York,1991);and Matsukwra et al.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA83,4244(1988)),和流感病毒(Leiter et al.,Proc Natl.Acad.Sci USA 87,3420-3434(1990))。此外,寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯在基础研究(如Agrawal et al.,Proc Natl,Acad,Sci.USA87,1401(1990)and Eckstein andGish,Trends Biochem.Sci 14,97(1989)),组织培养中的酶抑制作用研究(Mujumdar et al.,Biochemistry 28,1340(1989)),癌基因表达的调控(Reed et al.,Cancer Res.50,6565(1990)),及IL-1表达(Manson et al.,Lymphokine Res.9,35(1990))众多领域也成为焦点。
自动合成仪已被证实是获得寡核苷酸的一个无法估量其价值的工具。寡核苷酸通过每次加一个单体到新生的寡核苷酸链上而逐步产生。然而在每次有一个核苷酸单体将被加入的循环期间有2-3%的反应失败了。结果是,最后的产物通常是寡核苷酸的一个异源混合物,有各种不同长度。如在一个典型的20体合成中,该20体产品只相当于回收的寡核苷酸产物的50%-60%。对很多目的(如治疗)而言,纯化混合物就异常重要。因而人们对发展层析技术来纯化寡核苷酸就产生了兴趣。由于寡核苷酸硫代磷酸酯有治疗潜力。因此兴趣主要集中在对它的纯化上。
已发表有纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯的方法。Agrawal et al.,J.Chromatography 509,396(1990)报道了用反相高效液相色谱对寡核苷酸硫代磷酸酯的分析。在这项研究中,Agrawal等人将寡核苷酸硫代磷酸酯转换成它的磷酸二酯对应物(counterpart)再进行高效液相色谱(HPLC)分析。用这种方法,他们能在一个强阴离子交换柱(Partisphere SAX柱)上分析含10个或更少核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯,而多于10个核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯,由于能与该SAX介质发生强相互作用而不能分析。
Metelev and Agrawal,Anal,Biochem 200,342(1992)报道了在一弱阴离子交换柱(Partisphere WAX)上对寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸酯的离子交换HPLC分析,在这个弱阴离子交换柱上使用了结合到Partisphere二氧化硅上的二甲氨丙基功能基团。这种离子交换容量为0.18meq/g的介质与阴离子的相互作用弱于那些发现具有强阴离子交换的介质。该研究的作者发现对寡核苷酸硫代磷酸酯的分离在不超过25个核苷酸的长度以内,是依赖于长度的。而且,n-1个峰可以从母体峰很好地分离开。他们还发现用同样的梯度可分离30体和35体寡核苷酸硫代磷酸酯,而用一个较浅的梯度能得到更好的分离效果。
Metelev et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660,321-323(1992)报道了用离子交换HPLC对寡核糖核苷酸和嵌合式寡核糖-寡脱氧核苷酸的分析。他们发现所研究的寡核苷酸的保留时间取决于寡核苷酸中核糖核苷酸部分的数目。此外,发现寡核糖核苷酸的保留时间依赖于它的长度。作者们还发现直到25个核苷酸长的寡核糖核苷酸也能被纯化和分析。
Bigelow et al.,J.Chromatography 533,131(1900)报道了应用离子对HPLC来分析寡核苷酸硫代磷酸酯。Stec.et al.,J.Chromatography 326,263(1985),and Agrawal and Zamecnik,Nucleic Acids Res.19.5419(1990)报道了用反相HPLC分析含有1或2个硫代磷酸酯核苷酸间键的寡脱氧核苷酸。
这些纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法均使用HPLC。而这项技术只适用于小规模操作,不适于大规模商业化应用。
本发明的概要
本发明的一个目的是提供纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯的改进方法。特别是,本发明的一个目的是要提供适用于大规模分离寡核苷酸硫代磷酸酯的纯化技术。我们在多项发现的基础上发展方法而达到了这些目的。首先,我们开发了一种层析法用的是一个DMAE Fractogel EMD柱,凭借它我们可不必再用含有机溶剂的洗脱缓冲液。这种方法的有利之处还在于,由于它不需高温,使它更能经得起大规模层析。
我们开发的另一项改进是本发明的方法用到一种洗脱缓冲液,其盐浓度显著低于在本领域中以前所知的浓度。这一发现所带来的最重要有利之处是它允许在离子交换柱上分离更长的寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯。
本文揭示的方法提供更大的优点以适用于大批量纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯。这些方法可取代常规传统上的C-18操作程序。
图的简短描述
图1显示了在DEM91洗脱时不同溶剂体系的影响。
图2显示了在离子交换柱上对15体,20体和25体的分离(柱的介质颗粒大小为25-40μm)。
图3显示了在DMAE Fractogel EMD柱上24体和25体的分离。
图4显示了在DMAE Fractogel EMD离子交换柱上对GEM-91(SEQ IDNo1)的纯化。
图5显示了图4所显示的部分的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图6显示了图5所示的部分D的毛细管凝胶电泳分析。
图7显示了在离子交换柱上用2.5cm内径的柱子及与图2中所描述的相同的缓冲液系统来纯化GEM-91(SEQ ID No1)的结果。
图8显示了图7所示的各部分的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,电泳条件与图5中所示的一致。
图9显示了在一个内径为5cm的离子交换柱上对GEM的纯化。
图10显示了在一离子交换柱上用高pH缓冲系统对GEM91的纯化。
图11显示了在DMAE Fractogel EMD离子交换柱上用高pH缓冲系统对HOFF(SEQ ID No3)的纯化,缓冲系统如上面图10所述。
图12显示了在不同凝胶颗粒大小的层析柱上对GEM-91(GEM-91(SEQ ID No1))的纯化:(A)颗粒大小为25~40μm;(B)颗粒大小为45~90μm。
图13显示了在内径2.6cm的DMAE Fractogel EMD(凝胶颗粒大小为45~90μm)的层析柱上用高pH缓冲系统对GEM-91(GEM-91(SEQ IDNo1))的纯化。
图14显示了图13所示各部分的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图15A显示了对图13所示的部分的集合(部分3-9的集合)进行毛细管凝胶电泳分析,而图15B显示了对集合部分的GEN-FAX离子交换层析分析。
图16显示了在内径2.6cm的DMAE Fractogel离子交换柱上对HOFF(SEQ ID No3)样本的纯化;这里所用的缓冲条件与图13中所示的一样。
图17显示了图16中各部分的电泳分析。
本发明的详细描述
本发明包括用离子交换层析法(色谱法)分离或纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法。正如本文所用到的,术语“分离”和“纯化”均意指可交换使用的两个词,而且它们均意味着一个过程,其中具有某特殊分子结构的寡核苷酸可从物理上与有不同分子结构的寡核苷酸分离。特别是,本发明包括用DMAE离子交换层析法分离寡核苷酸硫代磷酸酯。
寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯与层析柱介质之间的相互作用很复杂。硫代磷酸酯不仅与离子交换剂树脂发生相互作用,还与介质作用。结合到介质上的硫代磷酸酯比磷酸二酯的结合更紧。因而就需要较高盐浓度来洗脱。
升温进行层析会导致延长寡核苷酸硫代磷酸酯的保留时间,表明混合物的构象在不同层析条件下会改变。寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯在升高的温度下会伸展开,因而在分子表面暴露更多的负电荷。
考虑到硫代磷酸酯与柱介质之间相互作用的复杂性,就想到高pH洗脱缓冲液可以通过松动硫代磷酸酯对DMAE交换剂的结合而改进对硫代磷酸酯的纯化。因此,本文展示的试验计划使用更强的高pH缓冲液。此外,还应用一个较高线性流速来防止触脚部分(tentacle moiety)的体积排阻效应。为简化操作过程,洗脱缓冲液中未使用任何有机溶剂或添加剂。
我们发现寡核苷酸硫代磷酸酯能在用水相洗脱缓冲液的离子交换柱上纯化,该水相洗脱缓冲液比以前所报道的有更高的pH和更低的盐浓度。下面呈现的结果证明所述纯化技术能解析长度上只差一个核苷酸的寡核苷酸。本文展现的操作程序可代替传统的C18程序用于大规模纯化寡核苷酸硫代磷酸酯。这导致在生产过程中步骤更少,并容许更好地纯化和回收产品。
DMAE Fractogel EMD介质的PK值约为9。介质生产厂家建议所用的洗脱液pH值应不超过8。与此警告相反,我们发现分离约长10个核苷酸至约35核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯时,用大于pH8的洗脱液效果最好。
根据本发明的方法,长约10至35个核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯可在一个DMAE离子交换柱上分离。也可用聚乙烯亚胺层析柱。在一个较优选实施方案中,约25至35个核苷酸长的寡核苷酸硫代磷酸酯能用本方法分离。可用本方法分离的寡核苷酸可能有少至一个及多至全部的硫代磷酸酯核苷酸间键。与所述寡核苷酸硫代磷酸酯同样大小的寡核苷酸硫代二磷酸酯也能用同样的方法分离。
寡核苷酸被置于层析柱上,在环境温度(室温)下用一种第一缓冲液(缓冲液A)和第二缓冲液(缓冲液B)的梯度洗脱,缓冲液A中有约25mM Tris-HCl和约20%50mM水性甘露醇,缓冲液B有缓冲液A的所有组分及约2MNaCl(或另一种适合盐)。我们发现,寡核苷酸硫代磷酸酯将在低于约2M的盐浓度下,而且经常是低于约0.5M的盐浓度下洗脱出来。
本发明的分离方法基本上与层析柱颗粒大小无关。大小从25至90μm都能使纯化成功。在两种较优选实施方案中,颗粒大小是25-40μm或45-90μm。
以下实施例用实例论证了产生和实践本发明的较优选模式,但它并不意味着限制发明的范围。
实施例
所有按本发明的方法纯化的寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯是在一个自动合成仪(Milli GEN8700或8800DNA合成仪)上用标准条件合成的。它们的序列列在以下表I中。
表1
名称 序列号 序列 类型
GEM-91 1 CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 25体
GEM-92 2 CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGAG 32体
HOFF 3 GAGGGGAAACAGATCGTCCATGGT 23体
PAD-24 4 ACACCCAATTCTGAAAATGGGCAT 24体
PAD-15 5 CTCTCGCACCCATCT 15体
PAD-20 6 CTCTCGCACCCATCTCTCTC 20体
我们在这些试验中用的是由E.Merck Separation(Earmstat,Germany)生产的DMAE Fractogel EMD。这种Tractogel基质是由寡乙二醇,甲基丙烯酸缩水甘油酯以及季戊四醇二甲基丙烯酸酯的共聚物,其既具有一个亲水表面,又具有机械稳定性和对特高pH值的化学抗性。触须离子交换部分全都位于移植在支持物上的线性聚电解质链上。
由于一个水相系统比一个有机水溶剂在制药生产过程中更适用,并且需要较少的盐来洗脱寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯,因此在此选择了Tris-HCl加甘露醇的缓冲液来纯化GEM-91(SEQ ID No1)。甘露醇有可能扮演一个置换因子的角色。
实施例1
不同溶剂系统对最佳盐浓度的影响
GEM-91(SEQ ID No1)(无三苯甲基),在有三苯甲基的C18反相层析中纯化再去三苯甲基,将GEM-91上样于DMAE(二甲基氨基乙基)FractogelEMD(颗粒大小25-40μm)离子交换柱上,柱内径为1.5cm,流速5ml/分钟。以下缓冲系统被用于测试不同溶剂系统对最佳盐浓度的影响:
1)缓冲液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20%乙腈;
缓冲液B-缓冲液A+2M NaCl。
2)缓冲液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20%50mM甘露醇的水溶液;
缓冲液B-缓冲液A+2M NaCl。
表2表现了所用的洗脱梯度:
表2
时间(分钟) 梯度
0-2 缓冲液B的恒组成的20%浓度
2-50 缓冲液B从20%至80%的梯度
图1A显示了使用缓冲系统1时的洗脱曲线而图1B显示了用缓冲系统2时的洗脱曲线。结果显示,GEM-91(SEQ ID No1)在缓冲系统1中在盐浓度约1.1M NaCl时洗脱下来,而在缓冲系统2中它在一个较低的盐浓度下,约1M NaCl,被洗脱。
我们选择Tris-HCl/甘露醇溶液是因为水相系统比有机-水相溶剂更适合于制药生产。甘露醇在洗脱GEM-91(SEQ ID No1)时的影响尚未知晓,只知道甘露醇可能作为一种置换因子。
实施例2
决定于长度的寡核苷酸硫代磷酸酯的解析效果
一种GEM-91(SEQ ID No1)(15体),PAD-15(SEQ ID No5)(20体),和PAD-20(SEQ ID No6)(25体)的混合物被上样在一个1.5cm内径的DMAE Fractogel EMD交换柱上(颗粒大小为25-40μm)并以5ml/分钟的线性流速洗脱。以下是所用缓冲系统:
缓冲液A-25mM Tris-HCl(pH8.0)含20% 50mM甘露醇的水溶液;
缓冲液B-缓冲液A+2M NaCl
表3表示了所用的梯度:
表3
时间(分钟) 梯度
0-5 缓冲液B5%浓度恒组成
5-35 缓冲液B从15%至32%的线性梯度
35-40 缓冲液B32%浓度恒组成
40-70 缓冲液B从32%至50%的线性梯度
图2描述了结果。15体的保留时间是29.66分钟,20体的是42.14分钟,25体的是52.67分钟。这些结果显示,当总寡核苷酸长度在15至25个核苷酸之间时这种方法能完全解析(分离)长度差5个核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯。
同样的条件也被用于GEM-91(SEQ ID No1)(25体)及PAD-24(SEQID NO4)(24体)的混合物。图3描述了这一结果,显示了这种方法能部分地分离长度只差1个核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯。
实施例3
纯化GEM-91(SEQ ID No1)
我们纯化了GEM-91(SEQ ID No1)(60 A260单位)的一个粗样本,其中含50%用如实施例2所述的相同方法而得的产品。含有GEM-91(SEQ ID No1)的各部分被收集(图4)并用PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(20%的凝胶,恒流15mA进行电泳,图5)以及毛细管凝胶(图6)分析。最终产品的纯度约88%,基于CE(毛细管凝胶)分析。终产物量约是粗样本的30%。
实施例4
大规模的层析
我们进行了递增(Scale-up)试验以确定离子交换层析是否合适于大量制造过程。GEM-91(SEQ ID No1)在一个2.5cm直径的柱上从一个粗制混合物中进行分离,用实施例2中的同样的缓冲系统,流速10ml/分钟。表4列出了所用的梯度:
表4
时间(分钟) 梯度
0-5 缓冲液B等浓度15%
5-40 缓冲液B从15%-32%的线性梯度
40-45 缓冲液B的15%等浓度
45-80 缓冲液B从32%至45%的线性梯度
图7描述了结果。终产物纯度约85%;回收率约30%。PAGE分析显示较后的部分含有比较前部分更多的n-1的缺陷序列(failure sequence)(图8),可能是由于线性流动速率所致。所用的线性流速在此柱中(2.04cm/分钟)比小柱(1.5cm直径)的低一些,小柱流速为10ml/分钟。在较低的线性流速条件下,柱介质的触须部分导致柱变成一个体积排阻层析柱(size exclusionchromatography),使n-1缺陷序列的洗脱被推迟了。
大量的粗制GEM-91(SEQ ID No1)样本(100,000 A260个单位)在一个5cm直径柱上用与实施例2相同的缓冲系统,以20ml/分钟的流速进行纯化。表5列出了所用的梯度:
表5
时间(分钟) 梯度
0-5 缓冲液B的15%浓度
5-60 缓冲液B从15%-32%的线性梯度
60-120 缓冲液B的32%浓度
120-160 缓冲液B从32%-45%的线性梯度
160-165 缓冲液B的45%浓度
165-260 缓冲液B从45%-100%的线性梯度
图9描述了结果。终产物的纯度约与2.5cm直径的柱上获得的一样,但回收率只有25%。较后各部分也含有更多的n-1缺陷序列。洗脱GEM-91(SEQ ID No1)时需要更多的盐(约1.3M NaCl而不是0.8M)。这种柱所用的线性流速减为1.02cm/分钟,是由于反压的限制。由低线性流速引起洗脱剂体积不足就要求高浓度的NaCl来洗脱GEM-91(SEQ ID No1)。
HOFF(SEQ ID No3)(24体)样本在胍中含量很多,它们不能用Tris-HCl,甘露醇在2M NaCl洗脱,甚至当溶液有饱和尿素时也不行。
实施例5
洗脱缓冲液pH的影响
为验证这样一个理论,即可以用比厂家建议的DMAE Fractogel EMD柱的更高pH的洗脱缓冲液,我们将一个粗制的GEM-91(SEQ ID No1)样品上样在一个1.0cm直径的柱上(25-40μm颗粒大小),流速5ml/分钟(相应于6.39cm/分钟的线性流速)。以下是所用的缓冲系统:
缓冲液A:50mM Tris-HCl,pH9
缓冲液B:缓冲液A+2M NaCl
表6列出了所用的梯度:
表6
时间(分钟) 梯度
0-2 缓冲液B的0%浓度
2-40 缓冲液B从0-15%的线性梯度
混合物在约200mM NaCl被洗脱(图10)。虽然GEM-91(SEQ ID No1)的峰相当宽,但是产物的量非常接近于从合成产量中计算出的量。
粗制的HOFF(SEQ ID No1)(24体)样品也能在同样条件下分离。终产物的保留时间几乎与GEM-91(SEQ ID No1)的一样(图11)。
一个较大的柱(2.6cm内径,颗粒大小45-90μm)被用于递增试验。所用的缓冲系统如下:
缓冲液A:50mM Tris-HCl,pH9.0
缓冲液B:缓冲液A+1M NaCl
表7列出了流速为35ml/分钟时所用的梯度:
表7
时间(分钟) 梯度
0-5 缓冲液B0%浓度
5-60 缓冲液B从0-30%的线性梯度
60-61 缓冲液B从60%-100%的线性梯度
GEM-91(SEQ ID No1)样本的主要峰被分成9个不同的部分(图13)。每个部分以及最后一个峰均用PAGE分析。在第4至第9部分较少发现有缺失序列。在更后的部分中没有n-1缺失序列。这说明较高的线性流速(6.6cm/分钟)有可能阻止了触须部分的体积排阻效应。数据还显示最后一个峰主要含有n+x序列,它们可能是在合成中造成的,并且用C18反相柱不能分离(图14)。
第3至第9部分被集中起来,并在GENFAX阴离子交换柱上(图15A)及用毛细管电泳(图15B)进行了分析。终产物的纯度高于90%,收率是初始材料的50%。SEQ ID 3(24体)可用相同的柱梯度从粗制样本中纯化出(图16)。然而,有三个主要峰含有主要的产物(图16和17),表明在分离期间可能发生了碱基堆积(base stacking)。
实施例6
柱介质颗粒大小的影响
在这个试验中用到一个1.0cm直径的柱,用以下缓冲系统:
缓冲液A:50mM Tris-HCl,pH9.0
缓冲液B:缓冲液A+1M NaCl 流速5ml/分钟。
表8列出了所用的梯度:
表8
时间(分钟) 梯度
0-5 0%浓度缓冲液B
2-50 缓冲液B从0-20%的线性梯度
使用这个系统,有两种不同柱介质颗粒大小,其结果显示在图12A(25-40μm颗粒大小),和图12B(45-90μm颗粒大小)。正如从图的比较中可以归纳的一样,颗粒大小的改变没有显著影响。
序列表
(1)一般资料
(i)申请人:Tang Ph.D.,Jin-Yan Guo Ph.D.,Que Agrawal Ph.D.,Sudhir
(ii)发明的题目:使用阴离子交换色谱纯化寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯。
(iii)序列数:6
(iv)通讯地址
(A)地址:Allegretti & Witcoff Ltd.
(B)街道:10South Wacker Drive,Suite 3000
(C)城市:Chicago
(D)州:IL
(E)国家:USA
(F)邮编:60606
(v)计算机可读形式
(A)介质类型:Floppy disk
(B)计算机:Apple Macintosh
(C)操作系统:Macintosh System 7.1
(D)软件:Microsoft Word 5.1
(vi)现有申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类号:
(viii)律师/代理人 资料
(A)姓名:Greenfield Ph.D.,Michael S.
(B)登记号:37,142
(C)目录号:93,769
(ix)电信资料
(A)电话:(312)715-1000
(B)电传:(312)715-1234
(2)SEQ ID No:1的资料
(i)序列特征:
(A)长度:25个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓朴构型:线性
(iii)假拟:无
(ix)特征
(A)名称/关键词
(B)位置1..25
(D)其他资料:/注:“所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯”
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1 CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT(2)SEQ ID No:2的资料
(i)序列特征:
(A)长度:33个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
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(iii)假拟:无
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(A)名称/关键词
(B)位置1..33
(D)其他资料:/注:“所有核苷酸间键合均是硫代磷酸酯”
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTGGAGA GAG(2)SEQ ID No:3的资料
(i)序列特征:
(A)长度:24个碱基对
(B)类型:核酸
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(iii)假拟:无
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(A)名称/关键词:-
(B)位置:1..24
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(xi)序列描述:SEQ ID NO:3
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(i)序列特征:
(A)长度:24个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓朴构型:线性
(iii)假拟:无
(ix)特征
(A)名称/关键词:-
(B)位置:1..24
(D)其他资料:/注意:“所有核苷酸间键合均为硫代磷酸酯”
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4
ACACCCAATT CTGAAAATGG GCAT
(2)SEQ ID No:5的资料
(i)序列特征:
(A)长度:15个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓朴构型:线性
(iii)假拟:无
(ix)特征
(A)名称/关键词:-
(B)位置:1..15
(D)其他资料:/注意:“所有核苷酸间键合均为硫代磷酸酯”
(xi)序列描述:SEQ ID NO:5CTCTCGCACC CATCT(2)SEQ ID No:6的资料(i)序列特征:(A)长度:20个碱基对(B)类型:核酸(C)链型:单链(D)拓朴构型:线性(iii)假拟:无(ix)特征(A)名称/关键词:-(B)位置:1..20(D)其他资料:/注意:“所有核苷酸间键连接均为硫代磷酸酯”(xi)序列描述:SEQ ID No:6 CTCTCGCACC CATCTCTCTC
Claims (3)
1、一种用DMAE阴离子交换层析法纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法,包括用包含甘露醇和超过8.0的pH的一个水性洗脱缓冲液梯度,洗脱寡核苷酸,其中寡核苷酸长度为约10至约35个的核苷酸,至少有一个硫代磷酸酯核苷酸间键,而且洗脱时盐浓度小于2M左右。
2、一种用如权利要求1的阴离子交换层析法纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法,其中寡核苷酸硫代磷酸酯的洗脱盐浓度小于约0.5M。
3、一种用如权利要求1的阴离子交换层析法纯化寡核苷酸硫代磷酸酯的方法,其中寡核苷酸硫代磷酸酯长度为25个左右至35个左右的核苷酸。
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