CN116102599A - 寡核苷酸氨解方法 - Google Patents

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CN116102599A CN202211710645.5A CN202211710645A CN116102599A CN 116102599 A CN116102599 A CN 116102599A CN 202211710645 A CN202211710645 A CN 202211710645A CN 116102599 A CN116102599 A CN 116102599A
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Abstract

本申请涉及一种寡核苷酸氨解方法，该方法包括以下步骤：向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；洗脱处理的时间为30min～120min，洗脱处理的温度为18℃～28℃；将第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；其中，第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。上述寡核苷酸氨解方法中，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。

Description

寡核苷酸氨解方法
技术领域
本申请涉及寡核苷酸技术领域，特别涉及到一种寡核苷酸氨解方法。
背景技术
寡核苷酸，又称短链核苷酸，包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对连结，所以常用来作为引物或探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。引物(primer)是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点。目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行，固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点；该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5→3方向延伸，而是由3’端开始的，相邻的核苷酸通过3→5磷酸二酯键连接。TaqManTMTAMRATM探针是以Tamra为固相载体合成的一小段单链DNA或RNA。
氨解反应是指含有各种保护官能团的单体在高温氨气水溶液的作用下脱保护生成游离引物或探针的过程，保护官能团即碱基环上的氧乙基、苯甲酰基、异丙基等保护基团。但是采用传统的氨解方法进行氨解，寡核苷酸的结构尤其是Tamra结构会有所降解，产物纯度和产量降低，导致最终得率只有10％～20％。
发明内容
基于此，本申请提供了一种降解较少、得率较高的寡核苷酸氨解方法。
本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
本申请提供一种寡核苷酸氨解方法，包括以下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；所述洗脱处理的时间为30min～120min，所述洗脱处理的温度为18℃～28℃；
将所述第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；
其中，所述第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。
在其中一个实施例中，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1)：(1～4)。
在其中一个实施例中，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：1：2。
在其中一个实施例中，所述洗脱处理的时间为45min～90min。
在其中一个实施例中，所述氨解反应满足(a)～(b)中至少一个条件：
(a)所述氨解反应的温度为45℃～100℃；
(b)所述氨解反应的时间为60min～200min。
在其中一个实施例中，所述固相载体与第一氨解处理液的质量体积比为(7～15)mg：(50～350)μL。
在其中一个实施例中，所述向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱的步骤之前还包括如下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入乙腈进行清洗，然后除去所述乙腈；向经所述乙腈清洗后的连接有寡核苷酸的固相载体中加入第二氨解处理液进行预处理，然后除去所述第二氨解处理液；
所述第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～14)。
在其中一个实施例中，所述固相载体为固相微球，所述固相微球承载于合成柱中，所述合成柱的柱体积为400μL，所述乙腈的加入量为(50～350)μL，所述第二氨解处理液的加入量为(50～350)μL。
在其中一个实施例中，除去所述乙腈和/或所述第二氨解处理液的方法为真空抽滤，所述真空抽滤的步骤满足(c)～(d)中至少一个条件：
(c)所述真空抽滤的真空度为-5英寸汞柱；
(d)所述真空抽滤的时间≥1min。
在其中一个实施例中，在所述氨解反应之后还包括冷冻处理，所述冷冻处理的步骤满足(e)～(f)中至少一个条件：
(e)所述冷冻处理的冷冻温度为-15～-25℃；
(f)所述冷冻处理的冷冻时间为15min～20min。
与传统方法相比较，本申请的寡核苷酸氨解方法具有如下有益效果：
上述寡核苷酸氨解方法中，采用先切割洗脱再氨解的方式，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，将碱基上的氨基保护基团去除，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。其中，氨解处理液是热的良导体，有利于将密封加热装置提供的加热温度快速传递到反应室内部，高效引发氨解处理液气化和氨解反应的发生；同时密封条件下有效避免了氨解处理液的挥发损失，有助于高效完成氨解反应。
附图说明
图1为实施例1中的寡核苷酸的MS图谱；
图2为实施例1中的寡核苷酸的分析图谱；
图3为实施例2中的寡核苷酸的MS图谱；
图4为实施例2中的寡核苷酸的分析图谱；
图5为实施例3中的寡核苷酸的MS图谱；
图6为实施例3中的寡核苷酸的分析图谱；
图7为实施例4中的寡核苷酸的MS图谱；
图8为实施例4中的寡核苷酸的分析图谱；
图9为实施例5中的寡核苷酸的MS图谱；
图10为实施例5中的寡核苷酸的分析图谱；
图11为实施例6中的寡核苷酸的MS图谱；
图12为实施例6中的寡核苷酸的分析图谱；
图13为实施例7中的寡核苷酸的MS图谱；
图14为实施例7中的寡核苷酸的分析图谱；
图15为对比例1中的寡核苷酸的MS图谱；
图16为对比例1中的寡核苷酸的分析图谱；
图17为对比例2中的寡核苷酸的MS图谱；
图18为对比例2中的寡核苷酸的分析图谱；
图19为对比例3中的寡核苷酸的MS图谱；
图20为对比例3中的寡核苷酸的分析图谱；
图21为对比例4中的寡核苷酸的MS图谱；
图22为对比例4中的寡核苷酸的分析图谱；
图23为对比例5中的寡核苷酸的MS图谱；
图24为对比例5中的寡核苷酸的分析图谱；
图25为对比例6中的寡核苷酸的MS图谱；
图26为对比例6中的寡核苷酸的分析图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请的寡核苷酸氨解方法作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。本申请要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
除了在操作实施例中所示以外或另外表明之外，所有在说明书和权利要求中表示成分的量、物化性质等所使用的数字理解为在所有情况下通过术语“约”来调整。例如，因此，除非有相反的说明，否则上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，本领域的技术人员能够利用本文所公开的教导内容寻求获得的所需特性，适当改变这些近似值。用端点表示的数值范围的使用包括该范围内的所有数字以及该范围内的任何范围，例如，1至5包括1、1.1、1.3、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等等。
传统技术中，气相氨解的优势在于反应快速高效、操作简单，但是存在对设备要求高、需要使用有毒气体、存在安全隐患、污染环境、对引物的结构破坏性较大的缺点。
然而本申请的技术人员发现：由于氨解反应温度过高，引物/探针结构受热不稳定，在此过程中引物/探针结构会有所降解。因此，对于寡核苷酸氨解反应而言，需在反应条件温和下进行，但这样往往难以兼顾引物/探针结构降解较少、得率较高的性能。
综上所述，传统的氨解方法难以兼具降解较少、得率较高的特点。
由此，本申请的技术人员基于自身在本领域多年的研发及实际生产经验，经过大量创造性实验，获得本申请的技术方案。
本申请一实施方式提供了一种寡核苷酸氨解方法，该氨解方法包括如下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；洗脱处理的时间为30min～120min，洗脱处理的温度为18℃～28℃；
将第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；
其中，第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。
洗脱时间可为30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、105min、110min、115min或者120min。
上述寡核苷酸氨解方法中，采用先切割洗脱再氨解的方式，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，将碱基上的氨基保护基团去除，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。其中，氨解处理液是热的良导体，有利于将密封加热装置提供的加热温度快速传递到反应室内部，高效引发氨解处理液气化和氨解反应的发生；同时密封装置有效避免了氨解处理液的挥发损失，有助于高效完成氨解反应。
在其中一些实施例中，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：(0.8～1)：(1～4)。
在其中一些实施例中，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：1：2。
在其中一些实施例中，洗脱处理的时间为45min～90min。
可以理解，随着上述第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，合成的寡核苷酸一同洗脱下来，洗脱条件温和，对引物/探针结构的影响越小，洗脱时间越长，寡核苷酸洗脱得越充分，有利于进一步氨解反应的进行。
在其中一些实施例中，氨解反应的温度为45℃～100℃。
可理解，氨解反应的温度可为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。
在其中一些实施例中，氨解反应的时间为60min～200min。
加热的时间可以是60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、130min、140min、150min、160min、170min、180min、190min、200min。
在其中一些实施例中，氨解反应过程中采用密封垫密封后的96孔板作为氨解室。
可以理解，氨解处理液是热的良导体，有利于将加热装置提供的加热温度快速传递到96孔板内部，高效引发氨解缓冲液气化和氨解反应的发生；同时密封的96孔板有效避免了氨解处理液的挥发损失，有助于高效完成氨解反应。
在其中一些实施例中，固相载体与第一氨解处理液的质量体积比为(7～15)mg：(50～350)μL。
在其中一些实施例中，向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱的步骤之前还包括如下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入乙腈进行清洗，然后除去乙腈；向经乙腈清洗后的连接有寡核苷酸的固相载体中加入第二氨解处理液进行预处理，然后除去第二氨解处理液。
可理解，加入乙腈用于去除未反应的试剂和反应副产物，且预处理过程中加入第二氨解液淋洗有效去除未反应的试剂和反应副产物等干扰物质，但同时不破坏合成的寡核苷酸的结构。
在其中一些实施例中，预处理的时间为3min～10min。
可理解，预处理时间可为3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或者10min。
在其中一些实施例中，第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1:(0.8～1.2):(1～14)。
在其中一些实施例中，第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1:(0.8～1):(1～10)。
在其中一些实施例中，第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1:1:6。
在其中一些实施例中，固相载体为固相微球，固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，乙腈的加入量为(50～350)μL，第二氨解处理液的加入量为(50～350)μL。
在其中一些实施例中，除去乙腈和/或第二氨解处理液的方法为真空抽滤。
在其中一些实施例中，真空抽滤的真空度为-5英寸汞柱；
在其中一些实施例中，真空抽滤的时间≥1min。
可以理解，真空抽滤是在通过滤膜将抽滤装置分为上下两部分，上部盛装待过滤液体、下部盛装过滤后的滤液，并将抽滤装置连接真空泵，降低滤膜下方的真空度，使外界空气推动抽滤装置上部的样品通过滤膜，由于抽滤装置下部与抽滤装置上部形成压力差，因而加快了过滤速度，并使上部沉淀抽吸得较干燥。
在其中一些实施例中，在氨解反应之后还包括冷冻处理。
在其中一些实施例中，冷冻处理的冷冻温度为-15～-25℃；
在其中一些实施例中，冷冻处理的冷冻时间为15min～20min。
下面将结合具体的实施例对本申请进行了说明，但本申请并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本申请的范围，在本申请构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本申请的各实施例所进行的一定的改变，都将被本申请的权利要求书的精神和范围所覆盖。
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例对长度为21个碱基的寡核苷酸进行氨解，序列如表1所示：
表1
序列(5'-3') Base MW
5'FAM-TCATCCTGCTATGCCTCGCTA-3'TAM 21 7469.16
具体步骤如下：
(1)将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加入250μL 100％乙腈(ACN)进行清洗合成柱外部、顶部和底部。
(2)在真空装置里放置废液盘，将合成板置于真空装置上，用移液器向每个柱子中加入250μL 100％乙腈进行清洗，清洗结束后，打开真空泵的阀门，真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到真空板。
(3)将真空板放到真空装置上面，向固相载体中加入250μL第二氨解处理液进行预处理5min，其中，第二氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：1：6。
(4)预处理结束后，打开泵的阀门，使真空达到-5英寸汞柱抽2min。
(5)取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，进行洗脱处理，用封口膜封住柱子并盖上铝箔，洗脱时间为1h，洗脱温度为25℃，让第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，其中，第一氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：1：2。
当洗脱结束后，打开泵的阀门。真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到第一处理液。
(6)将第一处理液在密封垫密封后的96孔板中加热进行氨解反应，80℃加热180min，反应结束后，将氨解盒从烘箱中取出，立刻放入冰箱-20℃冷冻15min。
(7)收集氨解后的氨解液进行质谱分析和酶标仪定量。
实施例2～6
实施例2～6与实施例1的寡核苷酸氨解方法基本相同，不同之处仅在于：表2中的试验参数不同。
各实施例的具体试验参数设置如表2所示：A：第二氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比；B：第一氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比；C：固相载体与第一氨解处理液的质量体积比(mg：μL)；D：洗脱时间(min)；E：洗脱温度(℃)；F：氨解时间(min)；G：氨解温度(℃)。
表2
Figure BDA0004027404320000091
Figure BDA0004027404320000101
对比例1
对比例1与实施例1的寡核苷酸氨解方法不相同，不同之处仅在于：此方法使用先氨解再切割；
(1)将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，然后置于密封容器内，在烘箱中加热进行氨解反应，80℃加热180min。
(2)反应结束后，从上述密封容器中取出固相合成柱，向柱子中加入250μL ACN进行清洗，然后向固相载体中加入250μL第二氨解处理液进行预处理5min。
(3)预处理结束后，取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，进行洗脱处理，用封口膜封住柱子并盖上铝箔，洗脱时间为1h，洗脱温度为25℃，让第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，当洗脱结束后，打开泵的阀门，真空达到-5英寸汞柱抽2min，收集流出液。
(4)将收集后的流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
对比例2
对比例2与实施例1的寡核苷酸氨解方法基本相同，不同之处仅在于：第一氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：2：7。
(1)将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加入250μL 100％乙腈进行清洗合成柱外部、顶部和底部。
(2)在真空装置里放置废液盘，将合成板置于真空装置上，用移液器向每个柱子中加入250μL 100％乙腈进行清洗，清洗结束后，打开真空泵的阀门，真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到真空板。
(3)将真空板放到真空装置上面，向固相载体中加入250μL第二氨解处理液进行预处理5min。
(4)预处理结束后，打开泵的阀门，使真空达到-5英寸汞柱抽2min。
(5)取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，进行洗脱处理，用封口膜封住柱子并盖上铝箔，洗脱时间为1h，洗脱温度为25℃，让第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，当洗脱结束后，打开泵的阀门。真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到第一处理液。
(6)将第一处理液在密封垫密封后的96孔板中加热进行氨解反应，80℃加热180min，反应结束后，将氨解盒从烘箱中取出，立刻放入冰箱-20℃冷冻15min。
(7)收集氨解后的氨解液进行质谱分析和酶标仪定量。
对比例3
对比例3与实施例1的寡核苷酸氨解方法基本相同，不同之处仅在于：洗脱处理时间为5min。
(1)将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加入250μL 100％乙腈进行清洗合成柱外部、顶部和底部。
(2)在真空装置里放置废液盘，将合成板置于真空装置上，用移液器向每个柱子中加入250μL 100％乙腈进行清洗，清洗结束后，打开真空泵的阀门，真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到真空板。
(3)将真空板放到真空装置上面，向固相载体中加入250μL第二氨解处理液进行预处理5min。
(4)预处理结束后，打开泵的阀门，使真空达到-5英寸汞柱抽2min。
(5)取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，进行洗脱处理，用封口膜封住柱子并盖上铝箔，洗脱时间为5min，洗脱温度为25℃，让第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，其中，第一氨解液中叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：1：2。
当洗脱结束后，打开泵的阀门。真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到第一处理液。
(6)将第一处理液在密封垫密封后的96孔板中加热进行氨解反应，80℃加热180min，反应结束后，将氨解盒从烘箱中取出，立刻放入冰箱-20℃冷冻15min。
(7)收集氨解后的氨解液进行质谱分析和酶标仪定量。
对比例4
对比例4与实施例1的寡核苷酸氨解方法基本相同，不同之处仅在于：氨解处理液中甲醇替换为异丁醇。
(1)将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加入250μL 100％乙腈(ACN)进行清洗合成柱外部、顶部和底部。
(2)在真空装置里放置废液盘，将合成板置于真空装置上，用移液器向每个柱子中加入250μL 100％乙腈进行清洗，清洗结束后，打开真空泵的阀门，真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到真空板。
(3)将真空板放到真空装置上面，向固相载体中加入250μL第二氨解处理液进行预处理5min，其中，第二氨解液中叔丁胺、异丁醇和水的体积比为1：1：6。
(4)预处理结束后，打开泵的阀门，使真空达到-5英寸汞柱抽2min。
(5)取250μL第一氨解处理液加入连接有寡核苷酸的固相载体的柱子中，进行洗脱处理，用封口膜封住柱子并盖上铝箔，洗脱时间为1h，洗脱温度为25℃，让第一氨解处理液慢慢滴到洗脱板里，其中，第一氨解液中叔丁胺、异丁醇和水的体积比为1：1：2。
当洗脱结束后，打开泵的阀门。真空达到-5英寸汞柱抽2min，得到第一处理液。
(6)将第一处理液在密封垫密封后的96孔板中加热进行氨解反应，80℃加热180min，反应结束后，将氨解盒从烘箱中取出，立刻放入冰箱-20℃冷冻15min。
(7)收集氨解后的氨解液进行质谱分析和酶标仪定量。
对比例5
对比例5与实施例1的寡核苷酸氨解方法不同，不同之处在于：对比例5使用的是氨气氨解。具体步骤如下：
(1)二乙醇胺(DEA)前处理
步骤1将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加200μL 2M DEA，静置3分钟，2500转离心3min，弃洗液；
步骤2加200μL 2M DEA，静置20分钟，2500转离心3min，弃洗液；
步骤3加200μL 20％ACN/80％H2O，2500转离心3min，弃洗液；
步骤4加200μL 20％ACN/80％H2O，2500转离心3min，弃洗液。
(2)放入氨解锅
压力:480Kpa～500Kpa，温度:88℃～98℃；氨解2h。
(3)氨解后处理
步骤1样品板放置在吸风口1h，冷却和去除水分；
步骤2 200μL 100％ ACN，无静置时间，2500转3min,弃洗液；
步骤3 200μL 90％ACN/10％H2O，无静置时间，2500转3min,弃洗液；
步骤4 200μL 90％ACN/10％H2O，5分钟静置时间，2500转3min,弃洗液；
步骤5更换滤液(Elution)板收取DNA；
步骤5 200μL 5％TEA，5分钟静置时间，2500转3min,留洗液；
步骤6 200μL 5％TEA，5分钟静置时间，2500转3min,留洗液。
对比例6
对比例6与实施例1的寡核苷酸氨解方法不同，不同之处在于：对比例6使用的是氨水浸泡氨解。具体步骤如下：
(1)二乙醇胺(DEA)前处理
步骤1将10mg连接有寡核苷酸的固相微球承载于合成柱中，合成柱的柱体积为400μL，加200μL 2M DEA，静置3min，2500转离心3min，弃洗液；
步骤2加200μL 2M DEA，静置20min，2500转离心3min，弃洗液；
步骤3加200μL 20％ACN/80％H2O，2500转离心3分钟，弃洗液；
步骤4加200μL 20％ACN/80％H2O，2500转离心3分钟，弃洗液。
(2)把固相载体控制孔径玻璃球(Controlled Pore Glass，CPG)粉末放到2ml离心管，加入500μL的氨水；放到烘箱中80℃处理2h。
测试：
1、对实施例及对比例制得的寡核苷酸进行得率计算，具体采用：
全波长酶标仪SpectraMax 190测量粗品OD值、纯化后的OD值；
全波长酶标仪SpectraMax 190适用于DNA分析。能够检测任何标准96孔或UV-透射96孔微孔板。
软件符合IQ/OQ/PQ，以及FDA 21CFR Part11条款认证。
2、对实施例及对比例制得的寡核苷酸的纯度进行测试计算，具体采用：
Waters 2695高效液相色谱测量寡核苷酸的粗品纯度；
使用Thermo LTQ质谱仪测量寡核苷酸的粗品和纯化后的质谱分子量。
3、对实施例及对比例制得的寡核苷酸的外观(颜色)进行观察。
具体测定结果请见表3：
表3
实施例 得率 纯度 外观
实施例1 87.34％ 72.79％ 未见发黄现象
实施例2 17.16％ 4.2％ 未见发黄现象
实施例3 28.47％ 17.78％ 未见发黄现象
实施例4 29.6％ 19％ 未见发黄现象
实施例5 59.41％ 33.97％ 未见发黄现象
实施例6 56.3％ 35.14％ 未见发黄现象
实施例7 60.8％ 63.96％ 未见发黄现象
对比例1 40.7％ 23.14％ 未见发黄现象
对比例2 39.79％ 22.17％ 未见发黄现象
对比例3 34.82％ 19.41％ 未见发黄现象
对比例4 58.19％ 35.7％ 未见发黄现象
对比例5 4.44％ 8.44％ 发黄
对比例6 5.22％ 7.62％ 发黄
图1、3、5、7、9、11、13分别为实施例1～7中氨解后得到的寡核苷酸的MS图谱，图15、17、19、21、23、25分别为对比例1～6中得到的寡核苷酸的MS图谱；图2、4、6、8、10、12、14分别为实施例1～7中氨解后得到的寡核苷酸的分析图普，图16、18、20、22、24、26分别为对比例1～6中得到的寡核苷酸的分析图谱，综上表和附图所示，实施例1～7和对比例1～6中氨解的寡核苷酸的得率、纯度和外观如表3所示，可以看出，对比例5和6使用的氨解液容易造成寡核苷酸产品品质差的问题，寡核苷酸发黄严重，杂质较多，影响产物的结构和功能；本申请的氨解方法与对比例的氨解方法相比，寡核苷酸的得率和纯度均得到提升。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求。

Claims (10)

1.一种寡核苷酸氨解方法，其特征在于，包括以下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液，所述洗脱处理的时间为30min～120min，所述洗脱处理的温度为18℃～28℃；
将所述第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；
其中，所述第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1)：(1～4)。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：1：2。
4.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述洗脱处理的时间为45min～90min。
5.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述氨解反应满足(a)～(b)中至少一个条件：
(a)所述氨解反应的温度为45℃～100℃；
(b)所述氨解反应的时间为60min～200min。
6.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述固相载体与第一氨解处理液的质量体积比为(7～15)mg：(50～350)μL。
7.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理的步骤之前还包括如下步骤：
向连接有寡核苷酸的固相载体中加入乙腈进行清洗，然后除去所述乙腈；向经所述乙腈清洗后的连接有寡核苷酸的固相载体中加入第二氨解处理液进行预处理，然后除去所述第二氨解处理液；
所述第二氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，所述叔丁胺、所述甲醇和所述水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～14)。
8.如权利要求7所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，所述固相载体为固相微球，所述固相微球承载于合成柱中，所述合成柱的柱体积为400μL，所述乙腈的加入量为(50～350)μL，所述第二氨解处理液的加入量为(50～350)μL。
9.如权利要求7所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，除去所述乙腈和/或所述第二氨解处理液的方法为真空抽滤，所述真空抽滤的步骤满足(c)～(d)中至少一个条件：
(c)所述真空抽滤的真空度为-5英寸汞柱；
(d)所述真空抽滤的时间≥1min。
10.如权利要求1～3任一项所述的寡核苷酸氨解方法，其特征在于，在所述氨解反应之后还包括冷冻处理，所述冷冻处理的步骤满足(e)～(f)中至少一个条件：
(e)所述冷冻处理的冷冻温度为-15～-25℃；
(f)所述冷冻处理的冷冻时间为15min～20min。
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