CN114891047A - 一种支链dna的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种支链DNA的合成方法。本发明突破了分支DNA合成的关键技术，解决了现有合成工艺只能合成直链不能合成分支的问题，在应用上可以提高DNA探针的荧光强度8～10倍，从而克服了传统的realtimePCR技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。另外，由于分支结构DNA打破了传统直链DNA概念，而且本发明合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线，提供更多的技术方案。

Description

一种支链DNA的合成方法
技术领域
本发明涉及合成DNA、RNA、蛋白质及类似分子的改进的方法，特别涉及一种支链DNA的合成方法。
背景技术
支链DNA(Branched DNA，缩写成bDNA)指一种人工合成的、由于在结构上整合了带有被保护羟基的核苷衍生物而形成的分支状的寡脱氧核糖核酸。
目前人工合成的DNA绝大多数都是直链型的寡脱氧核糖核酸，这种寡脱氧核糖核酸类似于一根直直的链条。而bDNA是一种离散的、高度分枝的、单分散的寡脱氧核糖核酸，带分支树枝状序列结构的DNA具有让人联想到树分枝的图案。基于bDNA具有树枝状大分子的特点，其具有以下几点优点：一、由于支链结构的形成了5'末端的数量成比例地增加，因此可以5'末端或者树枝状序列的中间成比例地增加修饰化学基团，比如在这些支链序列上修饰荧光信号，相比于普通的直链型的寡脱氧核糖核酸，支链DNA所产生的荧光信号可以成倍数地增加。二、树枝状分支结构的支链DNA对Taq聚合酶的外切活性具有降解抗性，可防止酶对支链的影响，经PCR反应后，可以由形成多个多重标记的单链探针。三、分支结构可以增加DNA的解链温度，因此可以提高PCR反应的ΔTm(完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差)，从而减少错配。
因此bDNA技术具有高灵敏度、检测范围大和准确定量等优点，对各种普通样本和qPCR很难分析的血液样本与保存多年后mRNA高度降解的甲醛固定石蜡包埋的FFPE样本同样具有极高的准确度与重现性。最常见的DNA诊断方法是扩增目标序列，以产生足够的拷贝，以便使用常规检测系统观察到信号。而bDNA相比于普通直链型DNA可以通过分支状结构进行信号放大，甚至无需PCR扩增即可直接分析出目标DNA。
bDNA技术不仅用于病毒DNA或RNA的检测，也可用于检测细胞内基因的表达水平，在临床检测和科研工作中应用越来越广泛。采用该技术“人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测试剂盒(支链DNA信号扩增法)”也已经于2010年在国内实现商业化上市推广，其技术就是依托于bDNA，信号放大技术，其不依赖于指数级的核酸分子扩增，在业内首次实现了HPV检测的高特异性，高信号灵敏度，处于全球领先。
然而bDNA的合成技术一直是西门子公司旗下Chiron公司独有的垄断性专利技术，该技术的合成原料和合成工艺都处高度保密的状态，其对外商业化合成的bDNA产品在国内外虽然有销售，但是交付周期长，而且售价也极其昂贵，致使该技术应用于诊断试剂盒等产品中时，终产品成本高居不下，售价极其昂贵，非常不利于大规模应用，从而制约了bDNA技术的国产化和推广应用。
目前在国外独家专利保护的情况下，急需一种全新的更加高效低成本的bDNA合成方法来解决上述问题。本发明就能够很好地解决该问题，打破国外技术垄断，市场售价仅为西门子公司的1/5，极大地加快bDNA技术的国产化和推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种了合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线的支链DNA的合成方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种支链DNA的合成方法，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。
进一步，所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3’位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5’位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV-dA、LEV-dC、LEV-dG三种核苷酸单体，所述5’位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除。
进一步，所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV-dA(或LEV-dC，或LEV-dG)不影响整个DNA主链后继缩合循环反应，待主链合成结束后，利用强还原剂硼氢化钠对乙酰丙酰基(LEV)进行还原，从而形成一个裸露的羟基(-OH)，可以参与DNA合成的聚合反应，形成一个带枝丫的DNA结构，可在此枝丫的羟基上进行常规核苷酸的缩合。
进一步，所述乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到DNA的主链上之后，被还原形成裸漏羟基的DNA枝丫结构，然后通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸单体合成到上述提到LEV-核苷酸的羟基上，然后得到更长的DNA支链。
进一步，所述羟基由活化脂(NHS ESTER)原料活化于荧光基团上，使其与-NH2基团之间化学反应，且将荧光标记的功能基团连接到一段带有-NH2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。
本发明的有益效果：
本发明突破了分支DNA合成的关键技术，解决了现有合成工艺只能合成直链不能合成分支的问题，在应用上可以提高DNA探针的荧光强度8～10倍，从而克服了传统的realtime PCR技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。另外，由于分支结构DNA打破了传统直链DNA概念，而且本发明合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线，提供更多的技术方案。
附图说明
图1为本发明中光谱分析的示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种支链DNA的合成方法，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。
所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3’位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5’位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV-dA、LEV-dC、LEV-dG三种核苷酸单体，所述5’位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除，
所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV-dA(或LEV-dC，或LEV-dG)不影响整个DNA主链后继缩合循环反应，待主链合成结束后，利用强还原剂硼氢化钠对乙酰丙酰基(LEV)进行还原，从而形成一个裸露的羟基(-OH)，可以参与DNA合成的聚合反应，形成一个带枝丫的DNA结构，可在此枝丫的羟基上进行常规核苷酸的缩合。
所述乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到DNA的主链上之后，被还原形成裸漏羟基的DNA枝丫结构，然后通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸单体合成到上述提到LEV-核苷酸的羟基上，然后得到更长的DNA支链。
所述羟基由活化脂(NHS ESTER)原料活化于荧光基团上，使其与-NH2基团之间化学反应，且将荧光标记的功能基团连接到一段带有-NH2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。
根据DNA合成单体的氨基基团可以通过乙酰丙氨基进行保护，而后再利用强还原剂硼氢化钠将乙酰丙基进行还原，还原成羟基的技术原理。DNA合成技术所采用的合成单体为核苷亚磷酰胺，目前的核苷亚磷酰胺是一种经过化学修饰的核苷酸，3’位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5’位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，而A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团(核苷酸T杂环没有氨基，因此不需要保护修饰)，目前这3种核苷酸，分别被苯甲酰基和异丙酰基修饰保护起来。根据固相亚磷酰胺三酯法，待到DNA合成的聚合反应结束后，5’位的二甲氧基三苯甲基(DMT)可用三氯乙酸进行脱除，其它修饰的保护基团可在后面氨解反应中用氨去除。本发明提案所采用的技术原理是将A、C、G三种核苷酸杂环上的氨基基团使用乙酰丙酰基(LEV)进行保护，形成LEV-dA、LEV-dC、LEV-dG三种核苷酸单体，应用于分支结构的枝丫点合成。即在DNA合成过程中只需要在合成序列某个A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV-dA(或LEV-dC，或LEV-dG)不影响整个DNA主链后继缩合循环反应。待主链合成结束后，利用强还原剂硼氢化钠对乙酰丙酰基(LEV)进行还原，从而形成一个裸露的羟基(-OH)，可以参与DNA合成的聚合反应，形成一个带枝丫的DNA结构，可在此枝丫的羟基上进行常规核苷酸的缩合。
乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到DNA的主链上之后，被还原形成裸漏羟基的DNA枝丫结构，类似大树树干上长出的分支，此时可以通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸单体合成到上述提到LEV-核苷酸的羟基上，经不断循环反应，最终得到更长的DNA支链。然而在LEV-核苷酸的羟基上直接合成的DNA分子，由于分子间作用力的影响，会降低缩合效率，降低分子的柔韧性和溶解性等性能，最终难以达分支DNA的最佳应用效果。因此，通过引入对称或不对称的梳齿状乙酰丙烯磷酰胺。由于梳齿状结构可以形成更多的支链，在这些支链上可以合成正常的核苷酸单体，大大增加了支链间的空间距离，减少了分子间作用力的影响，从而降低树枝状大分子分支的堆积密度，提高缩合效率，可以得到更长的支链分子，优化分子的柔韧性、溶解性等物理化学性能。利用此原理，可使合成的DNA支链更多更长，当应用于荧光探针合成时，可以使分支DNA探针的荧光强度比普通单链DNA的提高近10～20倍。
利用活化脂(NHS ESTER)原料活化荧光基团上的羟基，使其与-NH2基团之间化学反应，从而将荧光标记的功能基团连接到一段带有-NH2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。即先合成寡核苷酸序列骨架，之后在需要修饰的碱基位或C链上通过亚磷酰胺法连接一个-NH2基团，经过解氨纯化回收后，再将活化脂活荧光基团，并与寡核苷酸序列上的-NH2基团，最终得到带有荧光基团的DNA探针。
针对本发明的技术方案，设计一条30个碱基的主链寡聚核苷酸序列5`-CACATATGAGTCGCTGAAGTCGGTTGTAGG-3`，同时该序列也作为常规寡聚核苷酸序列对照，而支链DNA在此序列基础上设计中间需要分支的碱基位：
表
1、常规DNA序列与bDNA序列的碱基位设计表
Figure BDA0003636812860000041
2、主链寡聚核苷酸序列的合成：
主链寡聚核苷酸序列和常规寡聚核苷酸序列的合成均是采用固相亚磷酰胺三酯法进行。主要是在固相载体上完成DNA链的合成，合成方向由待合成引物的3`端向5`端进行，相邻的核苷酸通过3`→5`磷酸二酯键连接进行连接。将设计好的寡聚核苷酸序列输入自动化DNA合成仪即可进行自动合成。其中bDNA的主链序列需要通过亚磷酸胺三酯法，将经过乙酰丙酰基(LEV)保护的LEV-核苷亚磷酰胺(此处采用的是LEV-dC)合成到bDNA主链序列的对应碱基位上。最后，在主链寡聚核苷酸序列和常规寡聚核苷酸序列的5`端均需要合成上一个DMT-Amino C-6CED phosphoramidite，用于荧光基团的连接合成。
3、主链寡聚核苷酸序列封闭：
主链寡聚核苷酸序列合成结束后，需要使用三氯乙酸将5`端的DMT保护基团去除，再利用Caps试剂将5`端封闭保护起，以免影响下一步支链的缩合反应。该步骤的封闭基团可以在最后的氨解反应中去除。
4、乙酰丙酰基(LEV)的还原：
对于bDNA的主链序列合成结束并做封闭处理后，为支链寡聚核苷酸序列的合成作准备，需要将乙酰丙酰基(LEV)的还原，并裸露出羟基。该步骤使用1:1吡啶/乙酸配制成0.5M浓度的硼氢化钠作为还原剂和1:1吡啶/乙酸、无水乙腈作为清洗剂。操作方法：将合成柱从合成仪上取下，用注射器向合成柱内注入200ul的0.5M硼氢化钠还原剂，并用注射器缓慢地将还原剂来回推过柱中的Frits,使还原剂与Frits充分接触，且在室温下反应15分钟。待反应后，分别用1.5mL 1:1吡啶/乙酸和1.5mL ACN冲洗合成柱，反复此清洗步骤三次。最后使用氩气将合成柱吹干，继续下一步分支序列的合成。常规DNA无需此步骤操作。
5、支链寡聚核苷酸序列的合成：
为了降低树枝状大分子分支的堆积密度，提高缩合效率，优化分子的柔韧性、溶解性等物理化学性能，在此使用对称或不对称的梳齿状乙酰丙烯磷酰胺经4,5-二氰基咪唑(DCI)活化后，与上述乙酰丙酰基(LEV)还原形成的羟基缩合反应，最终可以在主链分支结构上得到更多的支链结果，之后通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸合成到支链结构上，经过不断缩合延长，可以得到相同序列相同长度的支链寡聚核苷酸序列。最后，同样的需要在分支寡聚核苷酸序列的5`端合成上一个DMT-Amino C-6CED phosphoramidite，同样用于荧光基团的连接合成。
6、上述合成结束后，对完成合成的bDNA和常规DNA进行气相氨解去除保护基团，并进行脱盐纯化回收。
7、经测量回收产物浓度后，分别取bDNA和常规DNA的20nmol量进行干燥，干燥后再用200ul的pH7.8的硼酸缓冲液进行溶解。
8、FAM荧光标记基团原料的溶解与活化：
按0.06M的浓度溶解FAM荧光标记基团原料，溶剂为无水的乙腈(CAN)。再取适量的活化脂原料粉末(按1/3mg每条引物)充分溶解于FAM原料溶液中，并在37℃下振荡混匀，以使FAM荧光基团原料充分活化。
9、之后将上述活化好的FAM荧光原料分别加入之前用硼酸缓冲液溶解好的bDNA和常规DNA中，其中加入bDNA的FAM荧光原料体积量是加入常规DNA的4倍，并将反应容器密封，在37℃温度下震荡培养5分钟。最终将FAM荧光基团连接到bDNA主链、支链和常规DNA主链的5`末端-NH2基团上。最终合成出如下表中的序列结构(结构简式见下图)：
表9-1：常规DNA与bDNA对应的荧光探针序列结构表
Figure BDA0003636812860000051
10、FAM荧光基团连接反应结束后，分别对bDNA荧光探针和常规DNA荧光探针进行HPLC纯化回收，并测量浓度，同时质谱检测，确定合成产物为目标产物。
11、分别取同样量的bDNA荧光探针与常规DNA荧光探针，使用光谱分析仪对分别进行光谱分析，其光谱分析结果见下图1。
12、光谱检测结果分析：
从以上光谱检测结果可以看出，当在bDNA形成主链和分支结构的5`端上连接荧光标记基团，与常规DNA的相比，其荧光强度是常规DNA荧光探针的近4倍，由此可见分支DNA的分支结构可以使5`端的荧光强度大大增强。即可说明该发明可实现有效增益。
因此，上述提到的先合成寡核苷酸序列主骨架，在主骨架中间添加LEV碱基，之后LEV碱基可以经过硼氢化钠还原出羟基(-OH)，然后使用对称或不对称的梳齿状乙酰丙烯磷酰胺与羟基(-OH)缩合，可以在此梳齿状结构上继续合成延伸更长的寡核苷酸序列，最终可以形成多个分支状结构的bDNA。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种支链DNA的合成方法，其特征在于，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。
2.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3’位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5’位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV-dA、LEV-dC、LEV-dG三种核苷酸单体，所述5’位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除。
3.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV-dA(或LEV-dC，或LEV-dG)不影响整个DNA主链后继缩合循环反应，待主链合成结束后，利用强还原剂硼氢化钠对乙酰丙酰基(LEV)进行还原，从而形成一个裸露的羟基(-OH)，可以参与DNA合成的聚合反应，形成一个带枝丫的DNA结构，可在此枝丫的羟基上进行常规核苷酸的缩合。
4.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到DNA的主链上之后，被还原形成裸漏羟基的DNA枝丫结构，然后通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸单体合成到上述提到LEV-核苷酸的羟基上，然后得到更长的DNA支链。
5.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述羟基由活化脂(NHS ESTER)原料活化于荧光基团上，使其与-NH2基团之间化学反应，且将荧光标记的功能基团连接到一段带有-NH2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。
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