CN113481283A - 等温扩增核酸靶序列的方法 - Google Patents

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CN113481283A CN202110733555.7A CN202110733555A CN113481283A CN 113481283 A CN113481283 A CN 113481283A CN 202110733555 A CN202110733555 A CN 202110733555A CN 113481283 A CN113481283 A CN 113481283A
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Abstract

本发明提供一种等温扩增核酸靶序列的方法。该方法适用于双链DNA、单链DNA、单链RNA，包括切口酶和链置换酶的联合反应，在进行双链DNA和单链DNA检测时，采用3条引物和1条探针，而进行单链RNA检测时，可以为3条引物和1条探针，也可以是2条引物和1条探针。探针为分子信标，扩增过程中不发生降解，仅用于特异性结合目标片段，提供荧光信号，保证反应的特异性。本发明采用与引物之间在靶序列上的结合区域没有重叠的信标探针来实时判断结果，信标探针结合目标序列具有很强的特异性；同时反应后不开管，进一步避免假阳性的产生；反应在恒定温度下进行，耗时短，8min内即可完成检测，更符合POCT检测需求。

Description

等温扩增核酸靶序列的方法
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体地说，涉及一种等温扩增核酸靶序列的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是目前应用最广的一种核酸扩增检测技术(Nucleic Acid Amplification Test，NAAT)。该技术的经典反应包括变性、复性和延伸三个步骤，是一个需要温度快速循环的过程，需借助特定的热循环仪进行高精度的温度控制，消耗大量电力。同时反应时间较长，满足不了即时检测(POCT)的要求。尽管近年来有15-30分钟完成反应的产品面世，然而这些产品借助极为复杂的工业设计，成本过高。
为了解决PCR技术带来的诸多问题，出现了一系列的等温扩增技术。较常见的技术为重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SDA)、切口和延伸的扩增技术(NEAR)、转录扩增介导技术(TMA)等。
RPA技术依赖于三种酶：结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。通过重组酶识别单链核酸的互补序列，使它们结合，通过单链结合蛋白稳定结合区域，链置换DNA聚合酶进行延伸。反应一般在37-42℃进行，时长为15-30min，可加入特殊探针来判断结果。RPA涉及的组分较多，试剂成本过高。
LAMP利用链置换酶完成反应，通过设计4条或6条引物，通过形成茎环产物，在链置换酶的作用下，不断在茎环处起始反应。该技术需要30-45min完成，一般采用染料用于终点的判断。LAMP试剂价格便宜，不过用染料进行结果偏低，容易出现假阳性，引物设计难度较大。
SDA采用特殊修饰的核苷酸、内切酶和链置换DNA聚合酶，需要4条引物。使用解链引物和扩增引物与模板反应，生成两端带酶切位点的产物，因为带有修饰核苷酸的一端无法被内切酶切开，该产物在内切酶的作用下，产生切口，在链置换DNA聚合酶下进行置换延伸，形成指数型扩增。在双链DNA模板中，需要先进行高温解链和引物退火，再加入酶进行反应。反应时长一般在30-60min。
NEAR和SDA相似，采用切口酶和链置换，仅需要2条引物。这2条条引物(3′末端)之间的距离在1-5个碱基，通过引物侵入的作用，形成两端带切口酶位点的产物，该产物在切口酶和链置换DNA聚合酶的作用下，进行指数型扩增。产物可通过探针、染料进行分析。该技术已有不少的产品上市，在新冠病毒核酸检测中，出现灵敏度过低的报道。由于引物之间的距离过短，采用探针进行实时检测时，引物和探针之间由于有同源位置，容易出现假阳性。反应时长在12min左右。
转录扩增介导技术(TMA)通过反转录酶、RNA聚合酶进行反应，主要产物为RNA。反应时长15-60min。
CN104726549A公开了一种基于切口酶的双链等温扩增检测新方法，该方法使用3条引物，其中一条扩增引物可以设计成信标探针的方式，产物采用染料法、荧光法、电化学法、比色法、化学反光法进行分析，检测时长为30-60min。采用荧光法以外的方法都容易导致假阳性，而该专利对引物进行标记，使得反应无法正确进行，同时，标记引物的非特异反应都将带来假阳性结果。基于反应时间过长，产物分析不合理等因素，目前尚无产品上市。
发明内容
本发明的目的是提供一种等温扩增核酸靶序列的新方法，
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种等温扩增核酸靶序列的方法，所述核酸可以是双链DNA、单链DNA或单链RNA；所述方法包括双链初始产物形成和指数扩增信号采集两个阶段：
I、双链初始产物形成
(1)当所述核酸为双链DNA时，包括以下步骤：
A1、将切口酶和DNA聚合酶与双链DNA接触，所述双链DNA在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到单链靶标；
B1、将扩增引物P1和置换引物与步骤A产生的单链靶标接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链靶标延伸所述扩增引物P1、所述置换引物的同时，用延长的置换引物置换延长的扩增引物(以产生供下一引物结合的单链)；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
C1、将扩增引物P2与步骤B形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
(2)当所述核酸为单链DNA时，包括以下步骤：
A2、将扩增引物P1和置换引物与单链DNA接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链DNA延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换延长的引物(以产生供下一引物结合的单链)；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
B2、将扩增引物P2与步骤A2形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
(3)当所述核酸为单链RNA时，分以下两种情况：
①当所述DNA聚合酶具有链置换功能，同时兼具RNase H活性和反转录酶活性时，包括以下步骤：
A3、将扩增引物P1与单链RNA接触，在反转录酶的作用下沿所述单链RNA延伸扩增引物P1；同时，在反转录酶的作用下降解与延伸产物互补的RNA链。形成单链模板；
B3、将扩增引物P2与步骤A3形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
②当所述DNA聚合酶具有链置换功能，同时兼具反转录酶活性时，包括以下步骤：
A4、将扩增引物P1和置换引物与单链RNA接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链RNA延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换延长的引物(以产生供下一引物结合的单链)；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
B4、将扩增引物P2与步骤A4形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
II、指数扩增信号采集
包括以下步骤：
D、将切口酶和DNA聚合酶与双链初始产物接触，所述双链初始产物在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；
E、将扩增引物P1或P2与步骤D形成的单链接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链核酸分子；
F、将切口酶和DNA聚合酶与步骤E产生的双链核酸分子接触，所述双链核酸分子在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；单链再与扩增引物P1或P2接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链核酸分子；
G、重复步骤F，以指数形式得到扩增产物。
其中，上述步骤在等温的条件下实施，且无需在扩增前对靶序列进行变性。
步骤D～G还包括将扩增体系与分子信标探针接触，以提供荧光信号。
所述扩增引物P1和P2，沿5′-3′方向，依次包含稳定区、切口酶识别位点以及能与靶序列互补的碱基区域。其中所述稳定区的长度为6-20bp。
所述置换引物与靶序列完全互补。
所述分子信标探针与靶序列互补或可与靶序列杂交，所述分子信标探针与所述扩增引物P1、P2在靶序列上的结合区域没有重叠。
所述方法可以是非疾病诊断目的。
进一步地，扩增引物长度在17-40bp之间，置换引物在10-30bp之间，GC％含量在20-80％之间，探针长度在20-40bp之间，GC％含量在10％-80％之间。
本发明提供的等温扩增核酸靶序列的方法为闭管实时荧光检测，完成样本核酸加样后，上机进行反应，中间无开管过程，避免了因开盖造成产物污染的可能性。
优选地，所述单链靶标的长度为30-100个碱基。
优选地，所述扩增是在37℃-70℃之间实施。
前述的方法，整个反应时间一般在1-10min。优选地，所述方法的反应时间不超过8min，阳性和阴性结果在8min内获得，样本中存在高浓度阳性靶序列时可在1-2min获得阳性结果。
本发明中，所述切口酶可选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII等中的至少一种。
本发明中，所述DNA聚合酶可选自Bst DNA聚合酶(包括Bst 2.0，Bst3.0等升级产品)、Bst DNA聚合酶大片段、Bsu DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶大片段、phi29 DNA聚合酶等中的一种。
本发明的引物为单链核苷酸聚合物，根据实际需要，引物中可包含锁核酸(LNA)、甲基化等常规合成修饰。
本发明分子信标探针的一端为荧光基团，另一端为荧光淬灭基团，且探针的5′端和3′端部分序列互补，可形成茎环结构。根据实际需要，探针可包含与上述引物类似的常规合成修饰，以及可能在5′和3′末端包含spacer修饰，以增加其长度。
扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。在引物探针设计时，保证足够的特异性位置使探针与靶序列结合，且探针和扩增引物之间在靶序列上没有碱基的重叠。
第二方面，本发明提供用于实现上述方法的试剂盒，所述试剂盒至少包括上述方法中的扩增引物P1、P2、置换引物以及分子信标探针，还可以包括酶(如切口酶、DNA聚合酶)以及常见核酸扩增反应中使用的各类物质，如Tris HCl缓冲液、BSA、NaCl、KCl、dNTP、Mg2+、(NH4)2SO4等反应中常用的缓冲液和离子成分，另外还包括添加剂，如海藻糖、甜菜碱、二甲基亚砜、明胶、吐温20、Triton-x100、NP-40等。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的快速等温扩增和检测核酸的新方法。该方法适用于双链DNA、单链DNA、单链RNA，包括切口酶和链置换酶的联合反应，在进行双链DNA和单链DNA检测时，采用3条引物和1条探针，而进行单链RNA检测时，可以为3条引物和1条探针，也可以是2条引物和1条探针。探针为分子信标，扩增过程中不发生降解，仅用于特异性结合目标片段，提供荧光信号，保证反应的特异性。
本发明采用与引物之间在靶序列上的结合区域没有重叠的信标探针来实时判断结果，信标探针结合目标序列具有很强的特异性，避免使用染料法或电化学法等方案导致的假阳性；同时反应后不开管，进一步避免产物污染导致假阳性的产生；反应在恒定温度下进行，耗时短，8min内即可完成检测(一般等温扩增反应需要30-60min)，更符合POCT检测需求。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中检测双链DNA时的原理图。
图2为本发明较佳实施例中检测单链DNA和双链RNA时初始模板形成的原理图。
图3为本发明较佳实施例中检测双链RNA时初始模板形成的原理图。
图4为本发明较佳实施例中检测携带人类基因PSMB2的质粒扩增效果图。
图5为本发明较佳实施例中检测肺炎支原体样本扩增效果图。
图6为本发明较佳实施例中检测其他呼吸道病原体样本的扩增效果图。
图7为本发明较佳实施例中检测乙型流感样本的扩增效果图。
图8为本发明较佳实施例中检测细小犬病毒的扩增效果图。
图9为本发明较佳实施例中样本自身链置换扩增的原理图。
图10为本发明较佳实施例中样本自身链置换扩增反应的扩增效果图。
具体实施方式
本发明提供双链DNA、单链DNA和单链RNA的快速等温扩增和检测新方法。包括如下步骤：
反应包括初始产物生成阶段(双链初始产物形成阶段)和指数扩增信号采集阶段。
1、在初始产物生成阶段中，根据模板情况和使用的酶体系略有差异：
a)当模板为双链DNA时，切口酶作用于双链DNA模板上的切口酶酶切位点，形成切口，链置换酶(具有链置换功能的DNA聚合酶)从该切口出发进行延伸和链置换，形成单链产物，带单链酶切位点的引物(F/R，即扩增引物P1)和置换引物(B)结合到单链产物上，通过延伸和链置换，形成带酶切位点的单链产物，另一条带单链酶切位点的引物(R/F，即扩增引物P2)与该单链产物结合并延伸，再经过酶切和链置换，形成了初始产物，即两端带有2个酶切位点的双链初始产物(图1)。
b)当模板为单链DNA时，带单链酶切位点的引物(F/R)和置换引物(B)结合到单链产物上，通过上述相同的过程，形成初始产物(图2)。
c)当模板为单链RNA时，有2种不同的方式可形成初始模板。第1种，使用带RNase H活性的反转录酶时，不需要置换引物(B)，如图3所示，通过反转录和Rnase H作用，形成带酶切位点的单链，后续反应同前所述；第2种，使用反转录酶(如Bst 3.0)，通过反转录和链置换功能，生成带酶切位点的单链，过程类似于单链DNA模板。
2、指数扩增信号采集阶段，切口酶在初始产物上产生切口，形成两种一侧带酶切位点的双链DNA，如图4的“指数扩增”区域所示，第1种产物可在切口酶和扩增酶的作用下，生成单链产物，该产物进一步和扩增引物结合并延伸，可形成第2种；反之，第2种产物，也可生成第1种产物，两者形成指数型扩增。分子信标探针可以与其中一种单链产物结合，合适的荧光检测系统可以采集到扩增信号。
本方法在检测双链DNA、单链DNA和单链RNA时，使用2条扩增引物、1条置换引物和1条分子信标探针；在检测单链RNA时还可以是2条扩增引物和1条分子信标探针。
本发明使用的扩增酶具有以DNA为模板合成DNA的功能，同时具备链置换功能，有些种类的扩增酶还具有以RNA为模板反转录成DNA的功能。
所述初始产物的特异性区域(不计算引物扩增引入的酶切位点等序列)长度在30-100bp之间。
所述分子信号探针在单链产物上结合时，与扩增引物在单链产物上的结合区域没有重叠。扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。在引物探针设计时，保证足够的特异性位置使探针与靶序列结合，且探针和扩增引物之间在靶序列上没有碱基的重叠。
反应过程中温度恒定，反应可以在8min内完成。
本发明采用3条引物和1条信标探针(检测单链RNA检测时，可以是2条引物和1条探针)，切口酶和链置换DNA聚合酶，在8min内可完成核酸扩增和产物的实时荧光检测。
所述的方法为等温扩增，在反应中温度恒定，反应温度在37-70℃之间。
所述的方法反应时间不超过8min，阳性和阴性结果在8min内获得，样本中存在高浓度阳性靶序列时可在1-2min获得阳性结果。所述的方法为闭管实时荧光检测，完成样本核酸加样后，上机进行反应，中间不存在开管过程。
所述的引物为单链核苷酸聚合物，如有必要，引物中可能包含锁核酸(LNA)、甲基化等常规合成修饰。3条引物中，1条为链置换引物，2条为扩增引物，链置换引物和模板完全互补，而扩增引物包含3个区域，分别是特异结合区、酶切位点区和稳定区。
所述信标探针是指带荧光基团和淬灭基团修饰的单链核苷酸聚合物，5′和3′末端的人工序列为互补，形成茎环结构。如有必要，可能包含和上述引物类似的常规合成修饰，以及可能在5′和3′末端包含spacer修饰，以增加其长度。信标探针和引物在靶序列上没有重合部分，保证其特异性。
所述的切口酶是识别双链DNA特异序列在其上形成切口的一类特殊酶，如Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII或其它均有同样功能的酶。
所述的链置换DNA聚合酶，是一类具有核酸3′末端聚合活性，同时拥有置换聚合方向核酸功能的聚合酶。如Bst DNA聚合酶(包括Bst 2.0，Bst3.0等升级产品)、Bst DNA聚合酶大片段、Bsu DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶大片段、phi29 DNA聚合酶等。
除了上述引物、探针、酶外，所述方法，还包括常见核酸扩增反应中用的各类物质，比如Tris HCl缓冲液、BSA、NaCl、KCl、dNTP、Mg2+、(NH4)2SO4等反应中常用的缓冲液和离子成分，另外还包括添加剂，比如海藻糖、甜菜碱、二甲基亚砜、明胶、吐温20、Triton-x100、NP-40等。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1携带人类基因PSMB2的质粒的检测
引物探针序列(5′-3′)如下：
PSMB2-B(引物)：CCCAGCACTTT
PSMB2-F(引物)：TTCAGACTATTGAGTCTATTCTGACCAACAT
PSMB2-R(引物)：GTCAGACTATTGAGTCTTCTCCCAGCTAAT
PSMB2-P(探针)：ATGGTAGTAGAGACGGGGTTTTACCAT
反应体系(各成分的终浓度)如下：
Tris-HCl pH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，10mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
甜菜碱，0.5M
PSMB2-B，200mM
PSMB2-F，300mM
PSMB2-R，300mM
PSMB2-P，300mM
Nt.BstNBI，3U
Bst 2.0warmstart，4.8U
反应在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler 480II。检测质粒1E5、1E4、1E3、1E2、1E1和无模板对照，结果如图4所示，扩增曲线呈现较好的”S”型。
实施例2肺炎支原体临床样本检测
引物探针序列(5′-3′)如下：
Mp-B(引物)：CTCTCCACTAA
Mp-F(引物)：CATAGACTTATGAGTCTTCTATTCGCTTC
Mp-R(引物)：GTTAGACTTTTGAGTCTTCTTGCTCTGGT
Mp-P(探针)：CGCAGCTGGTTACGGGAATACTGCG
反应体系(各成分的终浓度)如下：
Tris-HCl pH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，8mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
甜菜碱，0.5M
Mp-B(引物)，200mM
Mp-F(引物)，400mM
Mp-R(引物)，400mM
Mp-P(探针)，300mM
Nt.BstNBI，3U
Bst 2.0warmstart，4.8U
反应在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler 480II。检测8例肺支样本，结果如图5所示，8例肺炎支原体样本均检测为阳性，扩增曲线形态呈现“S”型，无模板对照没有扩增曲线。
采用相同的反应体系检测其它呼吸道病原体：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人细小病毒B19、金黄色葡萄球菌、人呼吸道腺病毒验证反应体系特异性，结果如图6所示，阳性对照扩增正常，所有上述的病原体均检测为阴性，结果显示与上述常见呼吸道病原体没有交叉。
实施例3乙型流感病毒(单链RNA病毒)临床样本检测
引物探针序列(5′-3′)如下：
FluB-B(引物)：TGTTGCTAAACT
FluB-F(引物)：CTACTGATGAGTCTTTTAGTGGAGGAT
FluB-R(引物)：CCTTCATTGAGTCTTTTGAAGAGTGA
FluB-P(探针)：ACGGCCATCGGATCCTCAAGCCGT
注：“A”用LNA修饰。
反应体系(各成分的终浓度)如下：
Tris-HCl pH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，8mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
甜菜碱，0.5M
FluB-B(引物)，200mM
FluB-F(引物)，400mM
FluB-R(引物)，400mM
FluB-P(探针)，300mM
Nt.BstNBI，3U
Bst 3.0，6U
反应在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler 480II。检测8例乙型流感病毒临床样本，结果如图7所示，8例乙流阳性样本均检测为阳性。
实施例4细小犬病毒检测
细小犬病毒为单链DNA病毒，引物探针序列(5′-3′)如下：
CVP-F(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTACTATACACATC
CVP-R(引物)：GAACTTTTGAGTCTTTTCCCAGTTTTCAT
CVP-B(引物)：AGTCTTTGCAACCT
CVP-P(探针)：CGCCAGGAAAAGTACCAGAATGGCG
反应体系(各成分的终浓度)如下：
Tris-HCl pH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，8mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
CVP-B(引物)，200mM
CVP-F(引物)，500mM
CVP-R(引物)，500mM
CVP-P(探针)，300mM
Nt.BstNBI，3U
Bst 3.0，6U
反应在55℃下进行，每10s采集一次信号，仪器为LightCycler 480II。检测5例细小犬病毒样本，结果如图8所示，5例细小犬病毒均检测为阳性。
实施例5样本自身的链置换扩增
在使用链置换酶和切口酶进行样本扩增时，由于样本上有非常多的酶切点，样本自身会发生链置换扩增，这个过程与多重置换反应类似(multiple displacementamplification)，原理如图9所示。只是不需要引物探针的参与。反应示例如下：
配制以下反应体系：
Tris-HCl pH8.0，50mM
(NH4)2SO4，20mM
MgCl2，8mM
NaCl，30mM
KCl，10mM
dNTP，1mM
Evagreen 1×
Nt.BstNBI，3U
Bst 3.0，6U
反应在55℃下进行，每1min采集一次信号，共60个循环，仪器为LightCycler480II，样本为咽拭子提取的核酸原液、该原液的10倍和100稀释，各重复2次。结果如图10所示，咽拭子提取的核酸样本在12min左右出现扩增信号。在使用链置换酶和切口酶进行扩增时，这种样本自身扩增是不可避免的，CN104726549A采用染料法判断结果时，当反应进行30-60min时，无法避免这种假阳性现象的出现。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.等温扩增核酸靶序列的方法，其特征在于，所述核酸为双链DNA、单链DNA或单链RNA；所述方法包括双链初始产物形成和指数扩增信号采集两个阶段：
I、双链初始产物形成
(1)当所述核酸为双链DNA时，包括以下步骤：
A1、将切口酶和DNA聚合酶与双链DNA接触，所述双链DNA在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到单链靶标；
B1、将扩增引物P1和置换引物与步骤A产生的单链靶标接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链靶标延伸所述扩增引物P1、所述置换引物的同时，用延长的置换引物置换延长的扩增引物；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
C1、将扩增引物P2与步骤B形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
(2)当所述核酸为单链DNA时，包括以下步骤：
A2、将扩增引物P1和置换引物与单链DNA接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链DNA延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换延长的引物；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
B2、将扩增引物P2与步骤A2形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
所述DNA聚合酶具有链置换功能；
(3)当所述核酸为单链RNA时，分以下两种情况：
①当所述DNA聚合酶具有链置换功能，且反转录酶兼具RNase H活性和反转录酶活性时，包括以下步骤：
A3、将扩增引物P1与单链RNA接触，在反转录酶的作用下沿所述单链RNA延伸扩增引物P1；同时，在反转录酶的作用下降解与延伸产物互补的RNA链；形成单链模板；
B3、将扩增引物P2与步骤A3形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
②当所述DNA聚合酶具有链置换功能，同时兼具反转录酶活性时，包括以下步骤：
A4、将扩增引物P1和置换引物与单链RNA接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链RNA延伸扩增引物P1的同时用置换引物置换延长的引物；将由扩增引物P1延伸形成的产物作为单链模板；
B4、将扩增引物P2与步骤A4形成的单链模板接触，在DNA聚合酶的作用下沿所述单链模板延伸扩增引物P2，再由切口酶作用于延伸产物，在切口处延伸并置换，形成双链初始产物；
II、指数扩增信号采集
包括以下步骤：
D、将切口酶和DNA聚合酶与双链初始产物接触，所述双链初始产物在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；
E、将扩增引物P1或P2与步骤D形成的单链接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链核酸分子；
F、将切口酶和DNA聚合酶与步骤E产生的双链核酸分子接触，所述双链核酸分子在切口酶作用下产生切口，DNA聚合酶从所述切口出发扩增得到可与扩增引物P1或P2互补的单链；单链再与扩增引物P1或P2接触，并在DNA聚合酶的作用下延伸形成双链核酸分子；
G、重复步骤F，以指数形式得到扩增产物；
其中，上述步骤在等温的条件下实施，且无需在扩增前对靶序列进行变性；
步骤D～G还包括将扩增体系与分子信标探针接触，以提供荧光信号；
所述扩增引物P1和P2，沿5′-3′方向，依次包含稳定区、切口酶识别位点以及能与靶序列互补的碱基区域；其中所述稳定区的长度为6-20bp；
所述置换引物与靶序列完全互补；
所述分子信标探针与靶序列互补或可与靶序列杂交，所述分子信标探针与所述扩增引物P1、P2在靶序列上的结合区域没有重叠；
所述方法为非疾病诊断目的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链靶标的长度为30-100个碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增是在37℃-70℃之间实施。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，整个反应时间为1-10min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切口酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.CviPII中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、BsuDNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶中的一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst 2.0或Bst3.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信标探针的一端为荧光基团，另一端为荧光淬灭基团，且探针的5′端和3′端部分序列互补，可形成茎环结构。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增引物P1和P2的3′端末端碱基之间处在靶序列上的距离不小于10bp。
10.用于实现权利要求1-9任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9任一项所述方法中所述的扩增引物P1、P2、置换引物以及分子信标探针。
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