CN110408678A - 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法 - Google Patents

单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法，所述单管型多重微生物检测体系包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。本发明通过DNA解旋酶和/或随机六引物将待检测的标本中的病原微生物(DNA或RNA)转换成单链DNA，使单链DNA与信号转换序列模板互补结合，在切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下生成信号分子DNA单链，信号分子DNA单链在信号扩增序列模板、切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下不断扩增信号，通过指示剂的作用表征检测体系的颜色变化，即可检测出是否具备病原微生物，通过进一步的筛查即可检测出待检测标本对应的病原微生物的种类。

Description

单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法
技术领域
本发明涉及病源微生物检测技术领域，尤其涉及一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法。
背景技术
当前病原微生物的检测都是基于病原微生物的抗原、抗体或的核酸物质，专业的检测机构如医院和第三方诊断机构，因为拥有专业的人员和各类设备仪器，可以优先追求结果的可靠准确，可以接受复杂的操作流程；但是在缺乏条件的地方如诊所、家庭和野外作业时，因为缺乏复杂昂贵仪器，就需要操作极简单，方便判读的方法。
之前人们也开发了一些即时检测方法，如利用体液中病原微生物的抗原或者抗体，做的胶体金免疫层析试纸，属于成熟的即时检测方法。可针对公共卫生危害比较大的病原微生物做出即时检测，如HIV检测试纸，此类层析试纸基于抗原抗体的方法，决定了其方法的敏感性不足，一般高危行为发生2周后方可检测艾滋病病毒抗体；适用于有明确怀疑病原微生物对象的场景，如高危行为后排查HIV感染情况；然而日常中最多见的场景是呼吸道系统或泌尿系统等细菌和病毒感染；呼吸道系统或泌尿系统等病原微生物种类繁多，目前并没有针对此类情况开发的层析试纸，个人家庭也不太可能每种试纸都购买和测试，因此不适用于呼吸道或泌尿系统感染等未有明确可怀疑病原微生物的大范围筛查。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种等温特异扩增病原微生物核酸的技术，也是成熟的即时检测方法；优点是特异性高，60℃恒温扩增，产生的信号强；然而此类方法也是检测单一病原微生物的核酸，不能做到多重，适合于针对公共卫生危害比较大的病原微生物，同样不适宜用于常见呼吸道或泌尿系统感染等未有明确怀疑对象的病原微生物的大范围筛查。
血液中的游离DNA中包含了来自周身各种组织细胞的基因组，理论上也会包含各类病毒和微生物的基因组。有人之前已经注意到，游离DNA的高通量测序数据中，会有1％左右的序列不能匹配到人类基因组。斯坦福大学Stephen R.Quake团队分析了1351例样本的cf-DNA测序数据，提取其中的非人源序列，组装后发现其中只有很少一部分能匹配上已知的细菌基因组，大多数未鉴定序列可能来自未知微生物。特别在病原体如细菌或病毒感染的情况下，其释放到血液中的基因组DNA或RNA大大增加。本专利在于开发一种单管即时检测多种病原微生物的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法，实现多种病原微生物的即时检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：所述单管型多重微生物检测体系包括至少种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst。
在本发明提供的单管型多重微生物检测体系的一种较佳实施例中，所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI，所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝的镁离子金属指示剂。
所述检测体系的即时检测方法包括以下步骤：
步骤一，配制检测体系：配制多种检测体系，包括具有多个信号转换序列模板的检测体系和多个具有1个信号转换序列模板的检测体系，每一个信号转换序列对应一种病原微生物，将每一所述检测体系组分配好后冻干，密封于石蜡中，并置于反应管中，反应管中加入水；
步骤二，初步筛查：将具有多个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在该检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本是否具备病原微生物，如检测出具备病原微生物则执行步骤三；
步骤三，进一步筛查：将每一个具有1个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在每一所述检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本对应的病原微生物的种类。
在本发明提供的所述检测体系的即时检测方法的一种较佳实施例中，所述检测体系与待检测标本中的病原微生物的反应包括如下步骤：
步骤一一：标本中含有的病原微生物的特征游离核酸-双链DNA被DNA解旋酶降解成长度、大小不等单链DNA片段；或病原微生物的RNA在随机六引物的作用下逆转录成单链DNA；
步骤一二：以步骤一一得到的病原微生物的单链DNA序列作为信号输入，互补结合于信号转换序列模板的病原微生物识别序列，在DNA聚合酶的作用下继续延伸；
步骤一三：切刻内切酶识别信号转换序列模板中双链状态的第一切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一四：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来，通过单链延伸和链置换，产生的信号分子DNA单链越来越多；
步骤一五：以步骤一四中产生的信号分子DNA单链作为信号输入，互补结合于信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列，在DNA聚合酶的作用下进一步延伸为双链；
步骤一六：切刻内切酶识别信号扩增序列模板中双链状态的第二切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一七：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来；
步骤一八：被置换下来的信号分子DNA单链继续与信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列杂交，循环往复，指数倍扩增信号。
与现有技术相比，本发明提供的单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法的有益效果是：本发明通过DNA解旋酶和/或随机六引物将待检测的标本中的病原微生物(DNA或RNA)转换成单链DNA，使单链DNA与信号转换序列模板互补结合，在切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下生成信号分子DNA单链，信号分子DNA单链在信号扩增序列模板、切刻内切酶及DNA聚合酶的作用下不断扩增信号，通过指示剂的作用表征检测体系的颜色变化，即可检测出是否具备病原微生物，通过进一步的筛查即可检测出待检测标本对应的病原微生物的种类。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明提供的所述信号转换序列模板的结构示意图；
图2是本发明提供的所述信号扩增序列模板的结构示意图；
图3是本发明提供的所述信号转换序列模板与病原微生物的反应示意图；
图4是本发明体用的所述信号扩增序列模板与信号分子DNA单链的反应示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
病原微生物包括细菌和病毒，病毒可以是DNA病毒和或RNA病毒。
实施例一：假定病原微生物为DNA病毒和/或细菌。
所述单管型多重微生物检测体系包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶以及指示剂，DNA解旋酶将双链DNA旋解呈单链DNA。
本实施例中的所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰，具体地，所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT(inverted deoxythymidine，idT)，避免DNA聚合酶作用下的序列延长。
请参阅图1，本实施例中的每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。
本实施例中的每一种信号转换序列模板区别在于：每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物单链DNA(此处为DNA病毒或细菌)，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸(LNA)，提高杂交的特异性。
请参阅图2，本实施例中的所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。
本实施例中的所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst，DNA聚合酶Bst具有强烈的逆转录酶活性。
本实施例中的所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI。
本实施例中的所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝(HNB)的镁离子金属指示剂，所述指示剂的变色原理为：HNB与Mg2+结合使得检测体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色。
实施例二：假定病原微生物为RNA病毒。
所述单管型多重微生物检测体系包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、随机六引物以及指示剂，所述随机六引物将RNA逆转录为单链DNA。
本实施例中的所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰，具体地，所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT(inverted deoxythymidine，idT)，避免DNA聚合酶作用下的序列延长。
请参阅图1，本实施例中的每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。
本实施例中的每一种信号转换序列模板区别在于：每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物单链DNA，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸(LNA)，提高杂交的特异性。
请参阅图2，本实施例中的所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。
本实施例中的所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst，DNA聚合酶Bst具有强烈的逆转录酶活性。
本实施例中的所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI。
本实施例中的所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝(HNB)的镁离子金属指示剂，所述指示剂的变色原理为：HNB与Mg2+结合使得检测体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色。
实施例三：假定病原微生物包括细菌和/或DNA病毒和RNA病毒。
所述单管型多重微生物检测体系包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶、随机六引物以及指示剂，DNA解旋酶将双链DNA旋解呈单链DNA，随机六引物将RNA逆转录为单链DNA。
本实施例中的所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰，具体地，所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT(inverted deoxythymidine，idT)，避免DNA聚合酶作用下的序列延长。
请参阅图1，本实施例中的每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。
本实施例中的每一种信号转换序列模板区别在于：每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物单链DNA(此处为DNA病毒或RNA病毒或细菌)，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸(LNA)，提高杂交的特异性。
请参阅图2，本实施例中的所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。
本实施例中的所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst，DNA聚合酶Bst具有强烈的逆转录酶活性。
本实施例中的所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI。
本实施例中的所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝(HNB)的镁离子金属指示剂，所述指示剂的变色原理为：HNB与Mg2+结合使得检测体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色。
上述实施例中，所述检测体系的即时检测方法包括以下步骤：
步骤一，配制检测体系：配制多种检测体系，包括具有多个信号转换序列模板的检测体系和多个具有1个信号转换序列模板的检测体系，每一个信号转换序列对应一种病原微生物，将每一所述检测体系组分配好后冻干，密封于石蜡中，并置于反应管中，反应管中加入水；
步骤二，初步筛查：将具有多个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在该检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本是否具备病原微生物，如检测出具备病原微生物则执行步骤三；
此步骤的检测体系的颜色变化为：检测体系本色为紫罗兰色，当检测出具备病原微生物时为天蓝色(阳性反应)，否则为紫罗兰色(阴性反应)。
步骤三，进一步筛查：将每一个具有1个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在每一所述检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本对应的病原微生物的种类。
所述步骤三中根据不同病原微生物配制检测体系，其反应表征如下表：
对照组 阴性对照标本 阳性对照标本 标本3 标本4 … 标本N
NTC 阴性 阳性 阳性 阳性 … 阴性
表中：NTC为无模板对照组；阳性反应显示为天蓝色，阴性反应显示为紫罗兰色。
由此，可精确检测出病原微生物具体为哪种病原微生物。
请参阅图3和图4，具体地，所述检测体系与待检测标本中的病原微生物的反应包括如下步骤：
步骤一一：标本中含有的病原微生物的特征游离核酸-双链DNA被DNA解旋酶降解成长度、大小不等单链DNA片段；或病原微生物的RNA在随机六引物的作用下逆转录成单链DNA；
步骤一二：以步骤一一得到的病原微生物的单链DNA序列作为信号输入，互补结合于信号转换序列模板的病原微生物识别序列，在DNA聚合酶的作用下继续延伸；
步骤一三：切刻内切酶识别信号转换序列模板中双链状态的第一切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一四：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来，通过单链延伸和链置换，产生的信号分子DNA单链越来越多；
步骤一五：以步骤一四中产生的信号分子DNA单链作为信号输入，互补结合于信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列，在DNA聚合酶的作用下进一步延伸为双链；
步骤一六：切刻内切酶识别信号扩增序列模板中双链状态的第二切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一七：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来；
步骤一八：被置换下来的信号分子DNA单链继续与信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列杂交，循环往复，指数倍扩增信号。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单管型多重微生物检测体系，其特征在于：包括至少1种信号转换序列模板、1种信号扩增序列模板、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲溶液、DNA解旋酶和/或随机六引物以及指示剂。
2.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板为DNA单链核酸，且所述信号转换序列模板和信号扩增序列模板的3＇末端具有化学修饰。
3.根据权利要求2所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述化学修饰包括修饰2个颠倒的胸腺嘧啶idT。
4.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：每一所述信号转换序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为信号分子序列、第一切刻酶识别序列和病原微生物识别序列。
5.根据权利要求4所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：每一所述病原微生物识别序列分别对应一种病原微生物，每一所述病原微生物识别序列的多个位置引入人工核苷酸，所述人工核苷酸包括但不限于锁核酸。
6.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述信号扩增序列模板由3段序列组成，从5＇到3＇依次为第一信号分子互补序列、第二切刻酶识别序列和第二信号分子互补序列。
7.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述DNA聚合酶采用具有DNA聚合延伸、RNA逆转录和链置换能力的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶Bst。
8.根据权利要求1所述的单管型多重微生物检测体系，其特征在于：所述切刻内切酶包括但不限于Nb·BbvCI，所述指示剂包括但不限于羟基萘酚蓝的镁离子金属指示剂。
9.根据权利要求1～7任一所述检测体系的即时检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，配制检测体系：配制多种检测体系，包括具有多个信号转换序列模板的检测体系和多个具有1个信号转换序列模板的检测体系，每一个信号转换序列对应一种病原微生物，将每一所述检测体系组分配好后冻干，密封于石蜡中，并置于反应管中，反应管中加入水；
步骤二，初步筛查：将具有多个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在该检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本是否具备病原微生物，如检测出具备病原微生物则执行步骤三；
步骤三，进一步筛查：将每一个具有1个信号转换序列模板的检测体系的反应管加热至47～64℃，使石蜡熔化，检测体系组分溶解于水，输入外界待检测标本，在每一所述检测体系的反应下，观察反应管中的颜色变化，即可得出待检测标本对应的病原微生物的种类。
10.根据权利要求9所述检测体系的即时检测方法，其特征在于：所述检测体系与待检测标本中的病原微生物的反应包括如下步骤：
步骤一一：标本中含有的病原微生物的特征游离核酸-双链DNA被DNA解旋酶降解成长度、大小不等单链DNA片段；或病原微生物的RNA在随机六引物的作用下逆转录成单链DNA；
步骤一二：以步骤一一得到的病原微生物的单链DNA序列作为信号输入，互补结合于信号转换序列模板的病原微生物识别序列，在DNA聚合酶的作用下继续延伸；
步骤一三：切刻内切酶识别信号转换序列模板中双链状态的第一切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一四：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来，通过单链延伸和链置换，产生的信号分子DNA单链越来越多；
步骤一五：以步骤一四中产生的信号分子DNA单链作为信号输入，互补结合于信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列，在DNA聚合酶的作用下进一步延伸为双链；
步骤一六：切刻内切酶识别信号扩增序列模板中双链状态的第二切刻酶识别序列，并切刻DNA链，产生一个切刻缺口；
步骤一七：切刻内切酶产生的切口，在DNA聚合酶的作用下，切口右边的3＇端单链继续延长，同时切口左边已存在的单链置换下来；
步骤一八：被置换下来的信号分子DNA单链继续与信号扩增序列模板中的第二信号分子互补序列杂交，循环往复，指数倍扩增信号。
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