CN113736858A - 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 - Google Patents
一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种恒温特异性核酸检测的新方法,具体地,带有荧光、电化学活性或侧流试纸标记的环状探针和引物组可以在不具有5'‑3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶催化下对靶核酸进行扩增,同时切刻内切酶可特异性识别扩增产物并从环状探针延伸的产物上切割标记,从而实现在恒定温度下核酸序列的快速、实时准确的监测。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求于2020年5月28日提交的美国临时申请系列号No.63/102,048的优先权,该申请的全部内容通过引用并入本文,包括所有表、图或附图。
技术领域
本申请大体上涉及生物化学和分子生物学领域,特别是涉及核酸靶标的实时检测。更具体而言,本申请涉及具有特定环结构和序列的核酸探针及其在用于使用基于荧光、电化学、侧流试纸的检测技术来检测特定核酸序列的核酸反应中的使用方法。
背景技术
为了对样本中较低含量的靶标核酸进行直接准确的检测,在检测过程中需要引入核酸扩增的步骤。除了需要两个或三个温度控制的常规聚合酶链反应(PCR)之外,仅需要一个反应温度的等温扩增法(例如环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA);参见(例如)美国专利No.4,683,195;No.4,629,689;No.5,427,930;No.5,339,491;和No.5,409,818)已经广泛用于诊断研究。
LAMP是一种用于核酸扩增的方法,其使用一套六个特别设计的引物,在Bst DNA聚合酶存在下,可在等温环境(60℃至65℃)以高特异性和灵敏度扩增DNA/RNA(T.Notomi,“Loop-mediated isothermal amplification of DNA,”Nucleic Acids Res.,vol.28,no.12,pp.63e–63,Jun.2000.)。LAMP由于其较高的扩增效率和稳定性(robustness)已被广泛使用。与作为金标准的PCR相比,LAMP具有相似的灵敏度,并且不易受抑制剂的影响。在一些情况下,甚至可以省去PCR所需的样品制备步骤(Y.Mori和T.Notomi,“Loop-mediatedisothermal amplification(LAMP):A rapid,accurate,and cost-effective diagnosticmethod for infectious diseases,”J.Infect.Chemother.,vol.15,no.2,pp.62–69,2009;A.Bartholomeusz和S.Locarnini,“Sequence-Specific Detection Method forReverse Transcription,Loop-Mediated Isothermal Amplification of HIV-1,”Antivir.Ther.,vol.55,no.November 2005,pp.52–55,2006;Y.P.Wong,S.Othman,Y.L.Lau,S.Radu和H.Y.Chee,“Loop-mediated isothermal amplification(LAMP):aversatile technique for detection of micro-organisms,”J.Appl.Microbiol.,vol.124,no.3,pp.626–643,2018.)。尽管等温方法中的引物设计比PCR复杂,但是因其扩增在恒温条件下进行,且试剂和工作流程相对简单,所以仍然具有一定的优势。目前已有一些例如浊度、比色和荧光视觉检测之类的检测方法。通常LAMP产物的测定依赖于最后结果分析并且需要扩增后处理,这样的操作极易导致交叉污染或由非特异性扩增引起的假阳性结果。例如:利用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物(T.Notomi,“Loop-mediated isothermalamplification of DNA,”Nucleic Acids Res.,vol.28,no.12,pp.63e–63,Jun.2000.);利用焦磷酸镁(Mg2P2O7)的积累引起的反应试剂变的浑浊这一现象进行浊度分析(Y.Mori,K.Nagamine,N.Tomita和T.Notomi,“Detection of loop-mediated isothermalamplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphateformation.,”Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.289,no.1,pp.150–154,Nov.2001.);或利用SYBR Green I或EvaGreen这类嵌入染料在UV光下检测dsDNA(M.Parida等人,“Rapiddetection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-timereverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay.,”J.Clin.Microbiol.,vol.43,no.6,pp.2895–2903,Jun.2005.),以及如钙黄绿素/Mn2+或羟基萘酚蓝染料(HNB)的金属离子指示剂的视觉检测(M.Goto,E.Honda,A.Ogura,A.Nomoto,和K.I.Hanaki,“Colorimetric detection of loop-mediated isothermalamplification reaction by using hydroxy naphthol blue,”Biotechniques,vol.46,no.3,pp.167–172,2009.)。其中,嵌入型荧光染料目前常用于临床诊断,因其相比浊度信号不易受诸如蛋白质之类的不透明物质的影响。然而,使用这类非靶基因特异检测方法的主要缺点是高风险的假阳性结果不可避免(P.Francois等人,“Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.,”FEMSImmunol.Med.Microbiol.,vol.62,no.1,pp.41–48,Jun.2011.)。LAMP依赖4种至6种不同的引物以独立地鉴别靶序列上的6个至8个独立区域,但这至少在理论上比双引物PCR更具有特异性。尽管非特异性扩增的机制尚不清楚,但假定在六个引物中顺式和反式引物可能是造成这种现象的原因。因此仅能对扩增产物进行间接检测仍然是LAMP技术的主要缺点之一。
采用荧光标记的核酸探针与目标物特异性结合的方法已被证明是解决非特异性染料检测系统的理想解决方案,如用于qPCR的水解型TaqManTM探针。由于LAMP特殊的扩增性质,任何可用于qPCR的策略应用到LAMP上都有一定的困难。目前,已开发出的基于探针的LAMP检测体系,包括:鸟嘌呤自猝灭探针(F.Zerilli,C.Bonanno,E.Shehi,G.Amicarelli,D.Adlerstein和G.M.Makrigiorgos,“Methylation-specific loop-mediated isothermalamplification for detecting hypermethylated DNA in simplex and multiplexformats.,”Clin.Chem.,vol.56,no.8,pp.1287–1296,Aug.2010.),检测荧光修饰引物检测荧光信号增强(Y.Kouguchi,T.Fujiwara,M.Teramoto和M.Kuramoto,“Homogenous,real-time duplex loop-mediated isothermal amplification using a singlefluorophore-labeled primer and an intercalator dye:Its application to thesimultaneous detection of Shiga toxin genes 1and 2in Shiga toxigenicEscherichia coli isolates,”Mol.Cell.Probes,vol.24,no.4,pp.190–195,Aug.2010.),猝灭标记物释放检测扩增(DARQ)(N.A.Tanner,Y.Zhang,和T.C.J.Evans,“Simultaneousmultiple target detection in real-time loop-mediated isothermalamplification.,”Biotechniques,vol.53,no.2,pp.81–89,Aug.2012.),同化探针以及分子信标(W.Liu等人,“Establishment of an accurate and fast detection methodusing molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay.,”Sci.Rep.,vol.7,p.40125,Jan.2017.)。由于它们自身原理的限制,这些方法因添加了一种或多种荧光标记,导致不可避免的高背景。由于LAMP反应中使用的Bst聚合酶缺乏5'至3'核酸内切酶活性,因此传统的水解荧光猝灭剂探针无法解决高背景的问题,这影响了LAMP反应的特异性。
因此,目前仍然需要可以用于实时核酸检测、同时降低背景检测的探针。
发明内容
本发明涉及一种具有特定序列设计和结构的具有标记的环状探针,一般用于恒温条件下核酸序列的快速扩增和实时监测。特别地,水解探针可用于电化学核酸检测。此外,本发明还依赖于无固定化生物传感器原理,以及基于水解前后核酸片段扩散系数差异原理的定性分析。由于无需荧光探针猝灭基团,因此降低了噪声,提高了灵敏度。该方法兼容侧流试纸目标特异性核酸检测,特别是兼容采用恒温和目视检测的大量有益的新方法。因此,我们提出了一种新的环标记探针方法来提高等温扩增和检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1A.检测原理方案。荧光环状探针的结构包括在5'端(报告基因)的荧光基团和位于环结构中的相应猝灭基团,以确保探针处于猝灭状态。茎区包括切刻酶识别序列。将错配引入到最后的G碱基中,使得在不存在靶核酸的情况下,其不会被切割。将5'CG碱基添加到茎的末端以增加双链区域的稳定性。
图1B.检测原理方案。在不存在靶核酸的情况下,线状探针或环状探针这两者中的任一者都不会被切割从而释放标记。
图1C.检测原理方案。在存在靶核酸的情况下,环状探针与相应的靶核酸位点杂交,并且通过切刻内切酶切割释放荧光信号。
图2A.使用荧光环状探针的检测方案。预扩增过程。选择具有两对引物结合位点的DNA模板:由正向引物(FP)和反向引物组成(BP)的外引物对以及由环状探针(LP)和辅助探针(AP)组成的内引物对。合理设计内引物LP和AP,使得它们在热力学上分别比其外引物对应物FP和BP更有利于首先与其互补区域结合。
图2B.使用荧光环状探针的检测方案,双环扩增的过程和信号输出原理。
图3A.使用电活性环状探针的检测原理。电活性标记的环状探针的结构包括在5'端的电化学标记。茎区包括切刻酶识别序列。将错配引入到最后的G碱基中,使得在不存在靶核酸的情况,其不被切割。将5'CG二聚体添加到茎的末端以增加双链区域的稳定性。
图3B.使用电活性环状探针的检测原理。在不存在靶核酸的情况下,线状探针或环状探针这两者中的任一者都不会被切割,并且因此环状形探针不能容易地扩散到电极表面。
图3C.使用电活性环状探针的检测原理。当与靶核酸结合时,环状探针被切刻酶切割,并观察电化学读数。
图4A.使用电活性环状探针的检测方案。预扩增过程。选择具有两对引物结合位点的DNA模板:由正向引物(FP)和反向引物(BP)组成的外引物对,以及由环状探针(LP)和辅助探针(AP)组成的内引物对。合理设计内引物LP和AP,使得它们在热力学上分别比其外引物对应物FP和BP更有利于首先与其互补区域结合。
图4B.使用电活性环状探针的检测方案,双环扩增的过程和信号输出原理。
图5A.使用侧流层析分析的检测方案。具有5'端修饰和内部修饰的环状探针。修饰可以是具有特异性结合抗体的如6-FAM、生物素或地高辛的分子,或者如生物素的链霉抗生物素蛋白的分子。
图5B.使用侧流层析分析的检测方案。信号放大方案。M1、内部修饰。在不存在靶标的情况下,环状探针不被切割,并且环状探针将与缀合有抗体的纳米颗粒结合并被固定在对照带上。在存在靶标的情况下,环状探针被切割,并且5'端标记作为切割产物而释放,其将与纳米颗粒结合,流过对照带,并被测试带固定(strapped)。因此,在存在靶标的情况下将出现测试带。(M2、5'端修饰。抗M1、与M1特异性结合的抗体或分子。抗M2、与M2特异性结合的抗体或分子。抗-抗M1、与抗M1特异性结合的抗体或分子。NP,示出了颜色或荧光的缀合有抗体的纳米颗粒,例如金纳米颗粒、有色聚苯乙烯乳胶颗粒、量子点等。T、测试带。C、对照带。)
图6.示出了来自经切割的荧光标记的荧光信号。取决于混合物中核酸模板的浓度,发现6分钟至15分钟后可检测到信号。
图7.示出了来自经切割的电活性标记的电标记信号。结果示出了30分钟后,不同浓度的模板的信号出现的峰高范围为0.024μA至0.035μA。
序列表说明
SEQ ID NO:1:正向引物(FP),使用荧光、电化学或侧流层析读数检测沙门菌属(Salmonella spp.)Sul1基因。
SEQ ID NO:2:反向引物(BP),使用荧光、电化学或侧流层析读数检测沙门菌属Sul1基因。
SEQ ID NO:3:环状探针(LP),使用由附接于核苷酸序列的标记得到的荧光读数检测沙门菌属Sul1基因。
SEQ ID NO:4:环状探针(LP),使用由附接于核苷酸序列的标记得到的荧光、电化学或侧流层析读数检测沙门菌属Sul1基因。从5'至3',LP包括报告基因、切刻酶识别位点、环序列和在5'端的切刻酶识别位点的一个错配以及与靶序列完全互补的正向内引物。
SEQ ID NO:5:作为在3'端具有反向内引物的发夹结构(harpin)示出的辅助探针(AP),其与靶序列完全同源,使用荧光、电化学或侧流层析读数检测沙门菌属Sul1基因。
具体实施方式
术语与定义
除非上下文另外明确说明,如本文中使用的,单数形式“一个(a)”,“一种(an)”和“该(the)”旨在包括复数引用。此外,就在详细描述和/或权利要求这两者中的一者中使用的术语“包括(including)”、“包含(includes)”、“具有(having)”、“有(has)”、“拥有(with)”或它们的变型而言,这样的术语旨在是包含性的,与术语“含有(comprising)”具有相同的方式。变型术语/短语(及其任何语法变体)“含有(comprising)”、“具备(comprises)”、“涵盖(comprise)”包括词组“基本上由…组成(consisting essentiallyof)”、“基本上由…构成(consists essentially of)”、“由…组成(consisting)”和“由…构成(consist)”。
词组“基本上由…组成(consisting essentially of)”或“基本上由…构成(consists essentially of)”表示权利要求包括含有特定材料或步骤的实施方案以及实质上不影响权利要求的基础特征和新颖特征的那些实施方案。
术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内,这将部分地取决于如何测定或确定该值,即测定系统的限制。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下,除非另有说明,否则应当假设术语“约”是指在特定值的可接受误差范围内。
在本公开中,范围以简写方式描述,从而避免必须对范围内的各个值和所有值进行详细地陈述和描述。在适当的情况下,可以选择在范围内的任何适当的值作为该范围的上限值、下限值或端值。例如,1至10的范围表示1和10的端值,以及2、3、4、5、6、7、8、9的中间值,并且包括在1至10内的所有中间范围,例如2至5、2至8和7至10。此外,当在本文中使用范围时,旨在明确包括范围的组合和子组合(例如,在所公开的范围内的子范围)以及其中的具体实施方案。
如本文和权利要求中使用的,“样品”是指细胞、组织或流体的样品,包括(但不限于)(例如)皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、肿瘤、包括水路、土壤或空气的环境来源、体外细胞培养成分的样品(包括(但不限于)在细胞培养基中细胞生长所产生的条件培养基、重组细胞和细胞组分)、或衍生自生物体或包含生物体的任何其他来源。
如本文中使用的术语“生物体”包括病毒、细菌、真菌、植物和动物。生物体的其他实例是本领域普通技术人员已知的,并且此类实施方案在本文公开的材料和方法的范围内。本文所述的分析可用于分析从任何生物体获得的任何遗传物质。
如本文中使用的术语“基因组”、“基因组的”、“遗传物质”或其他语法变型是指来自任何生物体的遗传物质。遗传物质可为病毒基因组DNA或RNA、诸如基因组DNA之类的细胞核遗传物质、或诸如线粒体DNA或叶绿体DNA之类的存在于细胞器中的遗传物质。它还可以代表来自天然或人工混合物的遗传物质或来自几种生物体的遗传物质的混合物。
如本文中使用的“靶序列”是包括“靶位点”的多核苷酸(例如,如本文中定义的,包括DNA、RNA或DNA/RNA杂合体,以及其修饰形式)。术语“靶位点”用于指存在于靶基因组序列(例如,宿主或病原体中的DNA或RNA)中的核酸序列,引物(例如,本文中的任何引物)将与核酸序列结合,条件是存在充分结合条件(例如,充分互补性)。合适的DNA/RNA结合条件包括细胞中正常存在的生理条件。其他合适的DNA/RNA结合条件(例如,无细胞体系中的条件)是本领域已知的。
当用于两个序列时,术语“杂交”表示两个序列彼此充分互补以使得两个序列之间的核苷酸碱基配对。彼此杂交的序列可以是完全互补的,但也可以具有一定程度的错配。因此,本文所述的环状探针和辅助探针以及正向引物和反向引物的5'和3'端的序列可以与靶核苷酸区域的5'和3'端的相应靶序列具有少量错配,只要环状探针和辅助探针以及正向引物和反向引物可以与靶序列杂交即可。取决于杂交的严格性,两个互补序列之间的错配高达约5%至20%将使得在两个序列之间杂交。通常,高严格条件具有较高温度和较低盐浓度,并且低严格条件具有较低温度和较高盐浓度。优选高严格杂交条件。
“杂交条件”是指温度、pH和反应物浓度的条件,这使得至少一部分互补序列彼此退火。完成杂交所需的条件取决于待杂交的寡核苷酸的尺寸、寡核苷酸之间的互补程度和杂交反应混合物中其他物质的存在。各杂交步骤所需的实际条件是本领域公知的,或者可以由本领域普通技术人员容易地确定。典型的杂交条件包括使用缓冲至pH约7至约8.5的溶液和约30℃至约80℃的温度。杂交条件也可包括对于寡核苷酸和其他组分相容(即,化学惰性)的缓冲液,但仍使得在互补碱基对之间杂交。
“引物”是能够在核酸扩增反应中启动核酸序列的合成的寡核苷酸。当置于诱导与模板核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时,引物启动核酸扩增反应。这些条件包括提供合适的核苷酸、诸如DNA聚合酶之类的用于聚合的酶、合适的缓冲液和合适的温度。基于靶标基因座的序列合成引物。例如,基于靶标基因座的序列和靶标基因座侧翼的序列,技术人员可以确定用于扩增靶标基因座的引物或引物对的序列。
引物对是一对寡核苷酸,为特定设计的用于从模板核苷酸序列物质扩增的特定核苷酸对。设计引物对以在模板遗传物质中扩增特定基因的指导原则是本领域公知的。
如本文中使用的,可互换使用的短语“可操作地连接(operably linked或operatively linked)”或“可操作地关联(operatively associated with)”是指并置,其中该组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。第一组分可以通过任何有用的键(例如,共价键、非共价键和/或通过范德华力、氢键和/或(例如)包括π-π相互作用、盐桥或阳离子-π相互作用的其他分子间力连接)或任何有用的连接子(例如本文的任何连接子)与第二组分可操作地连接。
在本公开中,通过特定命名法描述不同序列,例如引物结合序列、引物序列、靶序列和探针序列。当使用这种命名法时,应当理解,所鉴别的序列与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补。例如,“引物序列”描述了与引物序列的至少一部分基本上相同或与引物序列的至少一部分基本上反向互补的序列。这是因为当捕获的靶标基因组区域转化为包含引物结合序列的双链形式时,可以使用具有与引物结合序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补的序列的引物对双链靶标基因组区域进行测序。因此,本文使用命名法以简化本文公开的方法中使用的不同多核苷酸和多核苷酸的部分的描述;然而,本领域普通技术人员将认识到,与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补的适当序列可用于实施本文公开的方法。
此外,彼此对应的两个序列(例如,引物结合序列和引物序列或测序引物结合序列和测序引物序列)在至少70%、优选至少80%、甚至更优选至少90%并且最优选至少95%的序列中,具有至少90%的序列同一性、优选至少95%的序列同一性、甚至更优选至少97%的序列同一性并且最优选至少99%的序列同一性。或者,彼此对应的两个序列彼此反向互补,并且在反向互补序列中,在至少70%、优选至少80%、甚至更优选至少90%并且最优选至少95%的序列中,具有至少90%的完全匹配,优选至少95%的完全匹配,甚至更优选至少97%的完全匹配并且最优选至少99%的完全匹配。因此,彼此对应的两个序列可以在至少70%、优选至少80%、甚至更优选至少90%并且最优选至少95%的序列中彼此杂交或与共同参考序列杂交。优选地,彼此对应的两个序列在两个序列的整体长度上100%相同,或者在两个序列的整体长度上100%反向互补。
本公开提供了一种材料和方法,在使干扰背景最小化的同时,解决了与用于扩增核酸序列的实时分析监测的常规方法相关的问题。
靶序列扩增
本文公开的方法提供了扩增靶核苷酸的方法及其引物及探针的结构和设计方法。该方法包括提供靶DNA核苷酸序列、包括正向引物(FP)和反向引物(BP)的外引物对、以及包括环状探针(LP)和辅助探针(AP)的内引物对,其中FP和LP可与靶核苷酸序列的同一链结合,靶核苷酸序列优选为双链DNA(dsDNA)模板,而BP和AP与相反链结合。任选地,合理设计内引物LP和AP,使得与其外引物对应物FP和BP相比,内引物LP和AP分别在热力学上有利于首先与其互补区域结合。
在某些实施方案中,环状探针包括与靶核酸中的第一位点具有充分互补性的第一核酸序列,该第一核酸序列可操作地连接至标记并可操作地连接至两个或更多个核酸内切酶结合位点,其中两个或更多个核酸内切酶结合位点中的一者具有阻止环状探针的核酸内切酶消化的至少一个经置换的碱基对,并且辅助探针包含与靶核酸的第二位点具有充分互补性的第二核酸序列;并且正向引物和反向引物与所述靶核酸的至少一部分互补。在优选的实施方案中,辅助探针和反向引物与环状探针下游的序列互补,而正向引物与环状探针上游的序列互补。
除了模板DNA和探针以及引物之外,初始反应混合物还可包含一种或多种试剂,例如LAMP试剂(对于靶DNA)或RT-LAMP试剂(对于靶RNA)、一种或多种酶(聚合酶、逆转录酶、包括切刻内切酶等的核酸内切酶)、缓冲液、水盐、核苷酸、二价阳离子(例如Mg2+)、或增强剂(例如,甜菜碱、二甲基亚砜、乙二醇、甘油、甲酰胺、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸、2'-脱氧肌苷5'-三磷酸或1,2-丙二醇)。可以将混合物孵育任何有用的时间,例如约至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或更长。在某些实施方案中,孵育时间为约10分钟至约120分钟、约20分钟至约90分钟、约30分钟至约75分钟。在某些实施方案中,反应混合物处于任何有用的温度,例如,约55℃至约75℃,约60℃至约65℃,或优选为约61℃至约63℃以促进扩增。可以使用实时PCR进行反应。
在某些实施方案中,检测过程将始于预扩增步骤,其中核酸模板在(例如)约60℃至约65℃左右进行恒定杂交和再杂交,使得内引物(例如,LP或AP)中的一者与其靶DNA上的互补区域结合并退火,并使用聚合酶启动DNA合成。当环状探针(LP)与靶DNA结合时,合成的互补链比模板短,从而在模板链上暴露出LP结合位点的上游的正向引物(FP)结合位点。当FP与上述模板链结合,并通过无核酸外切酶活性的DNA聚合酶延伸时,合成产物1(图2A),从模板链置换先前结合的含LP片段(产物3;图2A),并且产物1的最终结构(图2A)是由模板和FP引发的合成序列形成的双链DNA(dsDNA),并可参与另一循环的LP引物结合和延伸。
在先前步骤中置换并具有与先前循环中的模板互补的序列的单链含LP链(产物3;图2A)可作为反向内引物AP的模板,从而合成产生与上述LP引发的序列(产物3;图2A)类似的较短互补链,并在相同链上暴露出在AP结合位点的上游的反向引物(BP)结合位点。由BP链引发的延伸链可形成双链DNA(产物5;图2A),其形成了含有双链的切刻内切酶的结合位点,因此可以通过优选使用切刻内切酶的核酸内切酶消化,从而释放标记物,产生荧光信号。被切割的标记可以包括电活性或荧光标记。同时,由于BP引物的延伸,可置换含AP的链,形成以5'端的为含AP序列且在3'端为LP序列(LP')的互补序列的单链DNA。随后AP和LP'片段将在两个末端自发地采取双环结构(产物7;图2B)。
如上所述,若首先结合的是LP而不是AP,则同样可以发生上述的反应,不同之处在于,最终的双环产物(产物8;图2B)将含有LP和AP'(AP的互补序列)环。随后在这两种情况中的任一种情况下,双环结构可以进行到下一步骤的扩增阶段。
在某些实施方案中,由预扩增产生的双环产物产物7(图2B)和产物8(图2B)可以从各自的双环结构(例如,LP')的3'端延伸,从而形成具有延伸的茎区的发夹结构,并且其他环(分别为产物9和产物10;图2B),例如AP环将线性化。因反应混合物中存在的过量的LP探针,可以与LP'环结合,在聚合酶引导下延伸,从而形成具有来自先前步骤的延伸的经置换的单链区域的双链产物。单链区域具有AP结构,其随后转变为环结构并进入下一个扩增循环。最终扩增的结构将是LP'-靶标-AP-靶标的串联重复的长dsDNA结构,其中各靶序列是相同的序列。最后,每个环状探针区域(LP'和AP)将在切刻内切酶的作用下消化,并释放标记物质。当从含有LP-AP'的环状探针开始时,可以获得相同的结构,不同之处是用LP-靶标-AP'-靶标的串联重复序列。
引物和探针的设计和检测
在某些实施方案中,可以将引物设计成与靶核酸序列或其部分以及衍生自靶核酸序列的扩增子杂交。在某些实施方案中,引物或探针的互补核苷酸片段的长为5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或100个碱基对或更长。此外,可以用荧光标记(例如,用于与猝灭基团一起使用)、电活性标记来标记引物(例如,本文的任何引物,如内引物、外引物或环状引物、辅助引物)或侧流层析法涉及的免疫亲和标记物,或可以不进行标记。引物或探针可具有核酸内切酶结合位点。可以优化引物和探针的浓度以促进扩增反应。
在某些实施方案中,本文的引物和探针可以包括任何有用的标记,包括在核酸序列中任何有用位置的荧光标记和猝灭基团标记,例如(如)在探针的3'端和/或5'端或环结构内。荧光标记的实例包括量子点、荧光团。用于该方法的荧光标记的实例包括荧光素、6-FAMTM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、TETTM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、VICTM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、MAX、HEXTM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、TYETM(ThermoFisher Scientific,Waltham,马萨诸塞州)、TYE665、TYE705、TEX、JOE、CyTM(Amersham Biosciences,Piscataway,新泽西州)染料(Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、得克萨斯红(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、得克萨斯红-X、(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oreg.)染料(AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 500、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700、AlexaFluor 750)、DyLightTM(ThermoFisherScientific,Waltham,马萨诸塞州)染料(DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 755)、ATTOTM(ATTO-TECGmbH,Siegen,德国)染料(ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 520、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rhol01、ATTO 590、ATTO 594、ATTO 610、ATTO 620、ATTO 633、ATTO 635、ATTO 637、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO700、ATTO 725、ATTO 740)、(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BOPDIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、HiLyteFluorTM(AnaSpec,Fremont,加利福尼亚州)染料(HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 594、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750)、AMCA、AMCA-S、级联蓝(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、级联黄、香豆素、羟基香豆素、罗丹明绿TM-X(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、罗丹明红TM-X(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oreg.)、罗丹明6G、TMR、TAMRATM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、5-TAMRA、ROXTM(Applied Biosystems,Carlsbad,加利福尼亚州)、Oregon(Life Technologies,Grand Island,纽约)、Oregon Green 500、700(Li-Cor Biosciences,Lincoln,内布拉斯加州)、IRDye 800、WeIIRED D2、WeIIRED D3、WeIIRED D4和640(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)。在一些实施方案中,可以使用消光系数>50,000M-1cm-1且与荧光检测通道适当光谱匹配的明亮荧光团。
在某些实施方案中,反应混合物中包含荧光基团标记的引物或探针,并且产生荧光标记的反应产物。本申请的方法的实施方案和组合物中所含的用作标记以产生荧光标记引物的荧光团可为多种荧光团中的任一种,荧光团包括(但不限于)4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸茋-2,2'二磺酸;吖啶和衍生物,例如吖啶和异硫氰酸吖啶;4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐、荧光黄VS;N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺;邻氨基苯甲酰胺、亮黄;BIODIPY荧光团(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省);香豆素和衍生物,例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆满151);酸性红;DAPDXYL磺酰氯;4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI);5',5"-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红);7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸酯基苯基)-4-甲基香豆素;二亚乙基三胺五乙酸盐;4,4'-二异硫氰酸根二氢-茋-2,2'-二磺酸;4,4'-二异硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸;5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯);(4-4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL);4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC);EDANS(5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸)、诸如曙红异硫氰酸酯之类的曙红和衍生物;赤藓红和衍生物,例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红;乙啡锭,例如溴化乙锭;荧光素和衍生物,例如5-羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)和异硫氰酸荧光素(FITC);荧光胺;绿色荧光蛋白和衍生物,例如EBFP、EBFP2、ECFP和YFP;IAEDANS(5-({2-(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)萘-1-磺酸)、孔雀石绿异硫氰酸盐;4-甲基伞形酮;邻甲酚酞;硝基酪氨酸;副蔷薇苯胺;酚红;B-藻红蛋白;邻苯二醛;芘和衍生物,例如芘丁酸酯、1-芘磺酰氯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯;QSY7;QSY9;活性红4(亮红3B-A);罗丹明和衍生物,例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(罗丹明6G)、异硫氰酸罗丹明、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明B、罗丹明123、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红);N,N,N',N-四甲基-羧基罗丹明(TAMRA);四甲基罗丹明;四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC);核黄素;玫红酸和铽螯合物衍生物。在某些实施方案中,组合物和使用方法中荧光探针或引物的浓度为约0.01μM至约100μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM或约1μM至约10μM。在某些实施方案中,荧光探针或引物的浓度为约0.01μM、0.1μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.5μM或5μM。
猝灭基团标记的实例包括荧光团、量子点、金属纳米颗粒等。合适的猝灭剂包括黑洞猝灭剂-1(Biosearch Technologies,Novato,CA)、BHQ-2、Dabcyl、IowaFQ(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)、IowaBlack RQ、QXLTM(AnaSpec,Fremont,CA)、QSY 7、QSY 9、QSY 21、QSY 35、IRDye QC、BBQ-650、Atto 540Q、Atto 575Q、Atto 575Q、MGB 3'CDPI3和MGB-5'CDPI3。在一个实例中,术语“猝灭剂”是指当接近供体时减少来自荧光供体的发射的物质。在优选的实施方案中,猝灭剂在荧光标记的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸碱基内。当从荧光团发射的荧光可检测地减少,例如减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多时,荧光猝灭。许多荧光团猝灭剂是本领域已知的,包括dabcyl;磺酰氯,例如丹磺酰氯;以及猝灭剂BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
在某些实施方案中,反应混合物包括电活性标记的引物或探针,并且产生电活性标记的反应产物。可以将电活性报告基团用作标记以产生本申请的方法的实施方案和组合物中所含的电活性标记的探针或引物,电活性报告基团可为许多电活性报告基团中的任一者包括(但不限于)亚甲基蓝、蒽醌、Ru(bpy)2dppz2+、Ru(phen)2dppz2+、二茂铁衍生物、苏木精、磁珠、QD、生物素-advinHRP、纳米复合物和二茂铁。在某些实施方案中,组合物和使用方法中的电活性探针或引物的浓度为约0.01μM至约100μM、0.1μM至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM或约1μM至约10μM。在某些实施方案中,电活性探针或引物的浓度为约0.01μM、0.1μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.5μM或5μM。
其他标记亦可用于本申请的反应,包括能够进行比色法和化学发光或荧光检测的这些方法。例如,生物素或地高辛是本领域公知的,并且生物素或地高辛可与耦合到碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素或若丹明(如上所述)的抗地高辛抗体和链霉抗生物素蛋白一起使用,以能够进行比色法和化学发光或荧光检测。
可操作地检测标记反应产物的任何检测方法或体系都可用于根据本申请的实施方案的方法中,并且这样的合适的检测方法和体系是本领域公知的。在某些实施方案中,靶核苷酸序列可直接检测或通过切割的探针间接检测,其中探针的标记端作为切割产物释放。可以通过选自由凝胶电泳、嵌入染料检测、PCR、实时PCR、荧光、荧光共振能量转移(FRET)、质谱、侧流层析分析、比色分析和基于CRISPR的检测系统组成的组中的方法进行扩增核酸或切割产物的检测。例如,使用二极管检测来自荧光标记的反应产物的信号。
在优选的实施方案中,通过由探针切割下来的标记间接确定靶核酸的存在。在某些实施方案中,在存在靶标的情况下,环状探针被切割,并且5'端标记作为切割产物释放。可以使用多种公知的方法进行该切割标记的检测。检测方法的实例包括电活性分析、荧光分析或侧流层析分析。在荧光或电化学活性分析中,可以确定,各扩增的环状探针区域可以含有诸如(如)Nb.BssSI之类的限制性内切酶的切口位点。当限制性内切酶进行切割时,可释放荧光团或电活性报告基团。例如,可以使用丝网印刷用碳电极或任何其他基于电化学标记的生物分析来检测来自电活性标记反应的信号。使用丝网印刷用碳电极的两种类型可用于本申请的方法。第一类型包括在恒温加热设备或PCR热循环仪上进行反应,然后,将适当体积的反应溶液滴加到电极表面上,从而确保反应溶液充分覆盖全部电极(工作电极、对电极和参比电极)。然后,可以记录无模板对照(NTC)和使用电化学站的样品的电化学信号。第二类型包括在电化学检测室中进行反应,其中丝网印刷用碳电极在电池下方。然后,可以记录使用电化学站的实时电化学信号变化。在优选的实施方案中,首先在约60℃至约65℃的最佳温度孵育包含引物、探针和靶标的等温扩增反应混合物以促进靶标的扩增,随后取所述反应的等分试样并将其滴加在诸如丝网印刷用碳电极的表面上。然后,可以使用电化学站获得通过差分脉冲伏安法(DPV)获得的电化学信号。可以使用100mV/s的脉冲振幅和25mV/s的扫描速率进行DPV测定。在某些实施方案中,金电极或盘电极可以适合作为电极表面,并且适合于电流测定法或其他伏安法。也可以在脉冲振幅范围为50mV/s至200mV/s且扫描速率为5mV/s至50mV/s的情况下进行DPV测定。使用电活性标记的探针和引物的实例以及检测所述探针和引物的方法如本领域中(例如)美国专利No.8,975,025所述,该申请的全部内容通过引用并入本文。
在侧流层析分析中,(例如)样品可以穿过具有识别条带的表面,识别条带包含核酸或优选为抗体。侧流层析分析可为夹心分析或竞争性分析这两者中的任一者。在某些实施方案中,由靶核苷酸的存在所导致的经切割的标记将与修饰有抗体的纳米颗粒结合,流过对照带,并终止于测试带。因此,在存在靶标的情况下将出现测试带。在不存在靶标的情况下,环状探针不会被切割,并且它将与缀合有抗体的纳米颗粒结合并且被对照带捕获。图5B提供了使用侧流层析分析的检测方案的非限制性实例。
在某些实施方案中,反应中的探针或引物可以具有至少一个、两个、三个、四个或更多个序列,这便于进一步加工或检测。这样的序列包括限制性内切酶或核酸内切酶位点、特别是切刻内切酶位点。切刻内切酶的实例包括Nb.BsrDI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、和Nt.BsmAI。在优选的实施方案中,当与可由核酸内切酶识别的核苷酸序列相比时,至少一个核酸内切酶位点具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个核苷酸的核苷酸置换、添加或缺失。核苷酸修饰可阻止核酸内切酶对该位点的识别。在优选的实施方案中,探针或引物具有两个核酸内切酶结合位点,并且一个结合位点、优选为与标记可操作地连接的位点具有当DNA的互补链与引物的探针杂交时可由核酸内切酶识别的位点,而另一核酸内切酶结合位点、优选为与标记可操作地连接的位点下游的位点具有单个核苷酸置换。
在某些实施方案中,可以在引物和探针中添加、缺失、置换或修饰包括DNA、锁核酸(LNA)或RNA碱基的其他序列,以赋予有利的性质。可以修饰5'或3'区域,特别是可以添加、缺失或置换一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个DNA、锁核酸(LNA)或RNA碱基。在优选的实施方案中,优选在包括核酸内切酶结合位点的茎区中添加5'CG二聚体,以增加双链区域的稳定性。
试剂盒
在某些实施方案中,本申请的组合物和使用方法可以进一步以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包括以下中的一种或多种:一种或多种引物(FP和/或LP),一种或多种探针(AP和/或BP),其他试剂(例如,本文所述的任何试剂,例如酶、缓冲液、核苷酸或增强剂)、特别是本领域技术人员将认识到对LAMP必要或有益的试剂,以及使用说明书(例如,包括本文所述的任何方法的这些说明书)。试剂盒的各组分可以单独或一起包装。在一个实例中,将组分包装在一起以允许单个室或单个试管反应。
酶
在某些实施方案中,可以使用一种或多种酶,包括多种聚合酶和核酸内切酶。如果靶核酸包括RNA序列或RNA序列的一部分,那么可以使用逆转录酶将RNA靶标逆转录为DNA(例如,cDNA)序列。
可在温度为约50℃至约70℃工作且具有3'至5'置换活性的任何DNA聚合酶都可用于本申请。聚合酶的实例包括Bst DNA聚合酶(包括Bst 3.0;New England BioLabs,Inc.,Ipswich,MA)、Bca(外)DNA聚合酶、DNA聚合酶I Klenow片段、Vent DNA聚合酶、Vent(外)DNA聚合酶(具有核酸外切酶活性缺陷的Vent DNA聚合酶)、VentTMDNA聚合酶、9°NTM聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶,Deep Vent(外)DNA聚合酶(具有核酸外切酶活性缺陷的Deep VentDNA聚合酶)、129噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo Co.,Ltd.)、Taq聚合酶和KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)以及其变体。
核酸内切酶的实例包括Nb.BsrDI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、和Nt.BsmAI。期望将其他核酸内切酶用于本申请,特别是在约50℃至约70℃的温度起作用的切刻内切酶,并且核酸内切酶切割的切割产物包括在可从扩增子释放的识别序列的5'端的核苷酸的区域。
可用于本申请的逆转录酶可以是表现出逆转录酶活性的任何聚合酶。本领域已知几种逆转录酶,并且其是市售的(例如,购自Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.;Life Technologies,Inc.,Rockville,Md.;New England Biolabs,Inc.,Beverley,Mass.;Perkin Elmer Corp.,Norwalk,Conn.;Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.,Piscataway,N.J.;Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.;Stratagene,La Jolla,Calif.)。在一些实施方案中,逆转录酶可以是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)、莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)、人免疫病毒逆转录酶(HIV-RT)、EIAV-RT、RAV2-RT、生氢氧化碳嗜热菌(C.hydrogenoformans)DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、SUPERSCRIPT I、SUPERSCRIPTII,以及它们的突变体、变体和衍生物。应当理解,在不背离本文公开的范围或优选实施方案的情况下,包括上文未具体公开的逆转录酶的多种逆转录酶可以用于本申请。
核苷酸碱基
可用于本申请的核苷酸碱基可以是可用于核酸聚合的任何核苷酸。核苷酸可以是天然存在的、不常见的、经修饰的、衍生的或人工的。核苷酸可以是未标记的,或者通过本领域已知的方法(例如,使用放射性同位素、维生素、荧光或化学发光部分、地高辛配基(dioxigenin))可检测地标记的。优选地,核苷酸为脱氧核苷三磷酸、dNTP(例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-硫代-dNIT、生物素-dUTP、荧光素-dUTP、地高辛配基-dUTP、7-脱氮-dGTP)。dNTP也是本领域公知的,并且可商购(例如,购自Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.;New England Biolabs,Inc.,Beverley,Mass.;Pharmacia LKBBiotechnology,Inc.,Piscataway,N.J.)。
本申请的核苷酸可以以任何浓度存在。在一些实施方案中,核苷酸的存在量为约0.001μM至约40μM、约0.005μM至约20μM或者优选为约0.01μM至约4μM。本领域技术人员将理解,其他浓度的核苷酸可用于本申请。
缓冲剂和盐
用于本申请的缓冲剂和盐为核酸合成(例如,为逆转录酶和DNA聚合酶活性)提供了合适的稳定pH和离子条件。本领域已知的多种缓冲液和盐溶液以及改性缓冲液可用于本申请,包括本文未具体公开的试剂。优选的缓冲剂包括(但不限于)Tris-HCl、NaCl、MgCl2和BSA。优选的盐溶液包括(但不限于)乙酸钾、硫酸钾、氯化钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂和乙酸锂的溶液。
本申请的缓冲剂可以以任何浓度存在。在一些实施方案中,缓冲剂的存在量为约0.01mM至约4000mM,约0.05mM至约2000mM,或者优选为约0.1mM至约400mM。本领域技术人员将理解,其他浓度的缓冲液可用于本申请。
使用方法
在某些实施方案中,本申请的探针、引物、分析和方法可用于检测任何目的靶标。特别地,探针、引物、分析和方法能够进行单步反应。与现有的核苷酸检测方法相比,本申请的组合物和方法可以进一步提供降低的背景扩增和/或检测。在一些实施方案中,本申请的组合物和方法可以配置为用于感测核酸(例如,DNA或RNA),并且用于检测病原体(例如,细菌病原体,如本文中的任何病原体)、代谢物、遗传修饰和/或杀虫剂以用于任何用途(例如,牲畜监测、农作物维持以及任何其他农业用途)。
本申请的组合物和方法可用于检测任何有用的靶标(例如,靶核酸或衍生自靶标或可识别为靶标的核酸序列)。靶标的实例包括细菌,例如芽孢杆菌属(Bacillus)(例如,炭疽芽孢杆菌(B.anthracis))、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)(例如,沙门菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、克雷白杆菌属(Klebsiella)和志贺菌属(Shigella))、耶尔森菌属(Yersinia)(例如,鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)或小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如,金黄色葡萄球菌(S.aureus))、链球菌(Streptococcus)、淋球菌(Gonorrheae)、肠球菌(Enterococcus)(例如,粪肠球菌(E.faecalis))、利斯特氏菌属(Listeria)(例如,单核细胞增多性利斯特菌(L.monocytogenes))、布鲁菌(Brucella)(例如,流产布鲁菌(B.abortus)、羊布鲁菌(B.melitensis)或猪布鲁菌(B.suis))、弧菌属(Vibrio)(例如,霍乱弧菌(V.cholerae))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如,假鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei)或铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa))、伯克霍尔德菌(Burkholderia)(例如,鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)或假鼻疽伯克霍尔德菌(B.pseudomallei))、志贺菌属(例如,志贺痢疾杆菌(S.dysenteriae))、立克次体属(Rickettsia)(例如,立氏立克次体(R.rickettsii)、普氏立克次体(R.prow azekii)、或莫氏立克次体(R.typhi))、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、支原体属(Mycoplasma)(例如,蕈状支原体(M.mycoides))等;过敏原,例如真菌毒素、霉菌孢子或诸如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和产气荚膜菌(C.perfringens)之类的细菌孢子;毒素,例如蓖麻毒蛋白、真菌毒素、河豚毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、葡萄球菌肠毒素B或蛤蚌毒素;病毒,例如腺病毒科(例如,腺病毒)、沙粒病毒科(例如,马秋波病毒)、布尼亚病毒科(例如,汉坦病毒或裂谷热病毒)、冠状病毒科(例如,SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2)、正粘病毒科(例如,流感病毒)、丝状病毒科(例如,埃博拉病毒和马尔堡病毒)、黄病毒科(例如,日本脑炎病毒和黄热病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒科(例如,乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如,单纯性疱疹病毒)、乳多空病毒科(例如,乳头状瘤病毒)、副黏液病毒科(例如,呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒或副流感病毒)、细小病毒科、小核糖核酸病毒科(例如,脊髓灰质炎病毒)、痘病毒科(例如,天花病毒)、呼肠病毒科(例如,轮状病毒)、逆转录病毒科(例如人类嗜T细胞淋巴病毒(HTLV)和人体免疫缺陷病毒(HIV))、弹状病毒科(例如,狂犬病病毒))和披膜病毒科(例如,脑炎病毒、黄热病病毒和风疹病毒);原生动物,例如隐孢子虫、脑包内原虫属(Encephalitozoa)、疟原虫属、刚地弓形虫属、棘阿米巴属、痢疾变形虫属、蓝伯贾第虫属、阴道毛滴虫属、利什曼原虫属或锥虫属(例如,布氏锥虫和克氏锥虫);蠕虫,例如绦虫(条虫)、吸虫类(trematodes)(吸虫(flukes))或线虫(蛔虫,例如,人蛔虫、毛首鞭虫、美洲钩虫或十二指肠钩虫);寄生虫(例如,本文所述的任何原生动物或蠕虫);真菌,例如曲霉菌(Aspergilli)、念珠菌(Candidae)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)和隐球菌(Cryptococci);病原体;环状境污染物;水添加剂;农业标记物;核酸(例如,寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸、核苷、DNA分子或RNA分子,包括染色体、质粒、病毒基因组、引物或任何有用病原体的基因,如本文所述的这些);或基因修饰(例如,抗生素抗性标记基因)。靶标还包括食物源性病原体,例如沙门菌属(例如,鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium))、致病性大肠杆菌(例如,O157:H7)、芽孢杆菌属(例如,蜡样芽孢杆菌(B.cereus))、肉毒梭菌、单核细胞增多性利斯特菌、耶尔森菌属(例如,小肠结肠炎耶尔森菌)、诺如病毒(例如,诺沃克病毒)、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、刚地弓形虫、弧菌属(例如,创伤弧菌(V.vulnificus)霍乱弧菌、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus))、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和产气荚膜菌;以及武器化病原体,例如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁菌(例如,猪布鲁氏菌)、鼻疽伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌、志贺菌属、肉毒梭菌、天花(Variola)(例如,重型天花(V.major))、丝状病毒科(例如,埃博拉病毒和马尔堡病毒)、沙粒病毒科(例如,拉沙病毒和马秋波病毒)、产气荚膜菌、任何食源性病原体(例如,沙门菌属、大肠杆菌O157:H7或志贺菌属)、鹦鹉热衣原体、贝氏柯克斯体、金黄色葡萄球菌、立克次体属(例如,普氏立克次体(R.prow azekii)或立氏立克次体)、甲病毒属(Alphavirus)(例如,委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒或西方脑炎病毒)、霍乱弧菌、隐孢子虫、亨德拉尼帕病毒属(Henipavirus)(例如,尼帕病毒)、布尼亚病毒科(例如,汉坦病毒或裂谷热病毒)、黄病毒科(例如,日本脑炎病毒和黄热病毒)和球孢子菌属(Coccidioides spp.)。
测试样品可以包括任何有用的样品,例如微生物、病毒、细菌、真菌、寄生虫、蠕虫、原生动物、细胞、组织、流体、拭子、生物样品(例如,血液、血清、血浆、唾液等)、植物、环境样品(例如,空气、土壤和/或水)等。
本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容均通过引用并入本文,包括所有附图和表格,在一定程度上它们与本说明书的明确教导一致。
以下是说明实施本申请的过程的实施例。不应将这些实施例解释为限制性的。除非另有说明,否则所有的百分比都是重量百分比,并且所有的溶剂混合物比例都是体积百分比。
实施例
在以下实施例中,使用荧光探针、电活性环状探针和侧流层析环状探针的方案用于检测导致耐药性的许多致病菌中的重要耐药基因,所述致病菌包括(例如)沙门菌属(例如,肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhimurium)(53648TM)。通过使用实时PCR仪以监测反应中使用荧光环状探针的动态扩增过程,并使用琼脂糖凝胶观察产物以分离形成的产物。通过使用丝网印刷用碳电极进行使用电活性环状探针的最后结果分析。
实施例1-使用荧光环状探针实时检测靶DNA
在本实施例中,示出了使用荧光环状探针实时检测靶DNA。在图1A至1C中描述了检测原理。图1A示出了荧光环状探针的结构,探针在5'端含有荧光团并且在多达13个碱基的环上修饰有相应的猝灭剂,以确保探针猝灭。正向引物为约18bp至20bp,与模板DNA互补,并且熔点为61℃至63℃。茎区含有切刻酶Nb.BsrDI的识别序列。在成环之前的茎的末尾碱基对(G碱基)上引入错配阻止了在不存在靶DNA时的探针断裂。将5'CG二聚体添加到茎端以增加双链区域的稳定性。图1B示出了在不存在靶标的情况下,环状探针的环形或线性状态这两者都会被切刻酶的消化。图1C描述了目的靶标,其在DNA聚合酶的帮助下可以促进双链结构的形成。因此,Nb.BsrDI可以在远离DNA的5'端的3个碱基对处产生切口。因为该片段太短无法稳定形成双链结构而被释放,并且产生荧光信号。
如图2A所示,所选择的模板DNA具有两对引物结合位点:正向引物(FP)和反向引物(BP)组成的一对外引物,以及由环状探针(LP)和辅助探针(AP)组成的一对内引物。FP和LP与dsDNA模板的同一链结合,而BP和AP与相反链结合。值得注意的是,热力学计算可用于合理设计内引物LP和AP,并使它们比外引物FP和BP更易于首先与互补区域结合。检测过程开始于预扩增步骤,其中dsDNA模板在60℃至65℃连续杂交且再杂交使得内引物(即LP或AP)中的一者在DNA模板上的其互补区域退火,并且通过聚合酶启动DNA合成。当LP与DNA模板结合时,合成的互补链比模板DNA短,从而使新合成的链的上游的FP结合位点露出。当没有核酸外切酶活性的DNA聚合酶延伸FP时,置换先前结合的含有LP的片段,并且最终结构是双链DNA(dsDNA),其可以参与新的引物结合和延伸循环。
图2B描述了双环扩增的过程。诸如LP'之类的先前形成的双环产物可以从双环结构的3'端延伸,以形成具有延伸的茎区的发夹结构,并且在该实施例中,其他环状AP将被线性化。此外,过量的LP探针还可以与LP'环结合或通过聚合酶延伸以形成双链产物,这可以由在先前步骤中延伸的移位的单链区域替代。单链区域具有AP结构,然后使用冗余AP探针而不是LP探针将其转化为以与上述相同的方式连续的环结构。最终的扩增结构将是LP'-靶标AP靶标串联重复的长dsDNA结构。最后,Nb.BsrDI使各环状探针区域(LP'和AP)带切口,并且释放荧光团。当从包含环状探针的LP-AP'开始时,将获得相同的结构,但将会被LP靶标AP'-靶标的串联重复替代。
特别地,本文提供的方法可用于检测RNA靶标。扩增过程与上述过程类似,只有轻微的改变。在扩增之前,应当将RNA指导的DNA聚合酶(即,逆转录酶)添加到反应中,并在特定条件、通常为约37℃至约42℃孵育10分钟至20分钟。由靶RNA生成的cDNA可以用作扩增和检测的模板。因此,我们的方法也适用于具有附加逆转录步骤的RNA检测。
实施例2-在丝网印刷用碳电极上使用环状探针实时检测靶DNA
在本实施例中,将标记有电活性分子的探针用于实时检测靶DNA。如图3A至图3C所示,环状探针切割的原理与实施例1中的荧光原理类似,不同之处在于它使用Nb.BssSI切刻酶并且它的特异性识别位点在5'端用电活性报告基团修饰的水解环状探针中。该报告基团可为亚甲蓝、二茂铁等。值得注意的是,使用不同的切刻酶仅是为了证明其可行性。茎和引物序列与前面描述的荧光标记的探针类似。图3B示出了使用本申请方法的无固定电化学生物传感器。由于空间位阻,因此环状探针中的报告基团不能扩散到丝网印刷用碳电极表面。在存在靶标的情况下(图3C),Nb.BssSI可以与识别位点结合并产生切口,使得携带电活性报告基团的三核苷酸片段释放。然后,该片段可以扩散到电极,并使用电位计记录电化学信号。如图4A至图4B所示,扩增和切割过程与先前的实施例类似,不同之处在于使用电活性环状探针代替荧光标记的探针。
实施例3-使用侧流层析环状探针基于比色纸检测靶DNA
在该实施例中,将具有5'端修饰和内部修饰的探针用于基于比色纸检测。如图5A所示,环状探针切割的原理与实施例1中的荧光检测原理类似,不同之处在于它使用Nb.BssSI切刻酶,并且其特异性识别位点在水解环状探针中。值得注意的是,使用不同的切刻酶仅是为了证明其可行性。图5A示出了具有5'端修饰和内部修饰的侧流层析环状探针的结构。这些修饰可为6-FAM、生物素、地高辛等。茎和引物序列与前面描述的荧光标记的探针类似。侧流层析读数可以适于信号开启模式或信号关闭模式这两者中的任一者。图5B示出了侧流层析读数的信号开启设计的示意图,其中测试带的出现指示阳性结果。
实施例4-使用荧光环状探针实时检测抗硫化性基因(Sul1)
A.测序
引物和探针的序列列于下表中:
B.灵敏度试验
在25μl反应混合物体系中进行反应,如下:8U Bst 3.0聚合酶、1U Nb.BssSI切刻内切酶、2.5μl 10×NEB 3.1缓冲液、6mM MgSO4、1.4mM的各dNTP和适当的核酸模板。对于一个反应,使用1.6μM荧光环状探针、1.6μM辅助探针、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物。最后,添加不含核酸酶的水以获得25μl的最终体积。在61℃在Bio-radTM实时PCR系统中进行反应。结果示出了随着扩增时间的延长,荧光信号遵循S形曲线的扩增趋势。发现6分钟至15分钟后根据混合物中核酸模板的浓度可检测信号。检测限达到3.24拷贝/反应(图6)。
B.特异性试验
在25μl反应混合物体系中进行反应,如下:8U Bst 3.0聚合酶、1U Nb.BssSI切刻内切酶、2.5μl 10×NEB 3.1缓冲液、6mM MgSO4、1.4mM的各dNTP和不包括靶序列的适当的PUC质粒。对于一个反应,使用1.6μM荧光环状探针、1.6μM辅助探针、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物。最后,添加不含核酸酶的水以获得25μl的最终体积。在61℃在Bio-radTM实时PCR系统中进行反应。结果示出了甚至在孵育1小时后也没有信号曲线。
实施例5-在丝网印刷用碳电极上使用电活性环状探针检测抗硫酰胺基因(Sul1)
A.测序
引物和探针的序列列于下表中:
B.灵敏度试验
使用与前述实施例类似的条件进行反应,不同之处在于用1.6μM电活性环状探针代替荧光标记的探针。在4阵列丝网印刷用碳电极上进行电化学检测;并且使用100mV/s的脉冲振幅和25mV/s的扫描速率进行微分脉冲伏安法(DPV)。结果示出了30分钟后,各种浓度模板的信号表现出的峰高范围为0.024μA至0.035μA(图7);并且检测限与前述方法相同(图6)。
应当理解,本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的,并且本领域技术人员将想到根据本申请的实施例和实施方案的各种修改或变化,并且这些修改或变化将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外,本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案进行组合,并且认为所有这些组合在本申请的范围内,但不限于此。
SEQUENCE LISTING
<110> 香港科技大学
<120> 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法
<130> HKUS.159X
<150> 63/102048
<151> 2020-05-28
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 1
accgcggcga tcgaaat 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 2
gcgcatagcg ctgggtt 17
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于检测Sul1基因的核苷酸探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 在5'端的HEX标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 在碱基对11处具有猝灭剂修饰的胸腺嘧啶
<400> 3
cgctcgtgac tagcctgctc actcgaacga gcgctattgg tctcggtgtc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于检测Sul1基因的核苷酸探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 在5'端的亚甲蓝标记
<400> 4
cgctcgtgac tagcctgctc actcgaacga gcgctattgg tctcggtgtc 50
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<211> 49
<212> DNA
<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)
<400> 5
cggtcgtgcc actgccctct atcgacacga ccgccgagaa ggtgattgc 49
Claims (20)
1.一种用于实时检测样品中的靶核酸序列的方法,该方法包括:
a)任选地,使所述样品中的所述靶核酸序列扩增;
b)将所述样品与聚合酶、包括正向引物和反向引物的外引物对以及包括环状探针和辅助探针的内引物对混合,以提供反应混合物,其中:
i)所述环状探针包括与所述靶核酸中的第一位点具有充分互补性的第一核酸序列,所述第一核酸序列可操作地连接至标记并可操作地连接至两个或更多个核酸内切酶结合位点,其中所述两个或更多个核酸内切酶结合位点中的一者具有阻止所述环状探针的核酸内切酶消化的至少一个经替换的碱基对,并且所述辅助探针包括与所述靶核酸的第二位点具有充分互补性的第二核酸序列;以及
ii)所述正向引物和所述反向引物与所述靶核酸的至少一部分互补;
c)将核酸内切酶添加到所述反应混合物中;以及
d)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列,则扩增所述靶核酸序列,其中当合成与所述环状探针互补的DNA链时,从所述环状探针上切割所述标记,并且目标靶核酸与包括所述环状探针的序列的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针的所述标记为荧光标记,并且所述环状探针还包括与所述第一核酸序列可操作地连接的猝灭剂标记。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针的所述标记为电化学活性分子。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针的所述标记为侧流试纸标记分子。
5.根据权利要求1所述的方法,其中至少一个核酸内切酶结合位点的序列为切刻内切酶结合位点。
6.根据权利要求5所述的方法,其中通过切刻内切酶Nb.BssSI或Nb.BsrDI识别所述切刻内切酶结合位点。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针为具有3'突出端和茎区的单链环状DNA。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述3'突出端的解链温度为约50℃至约65℃。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述茎区的解链温度为约50℃至约65℃。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针的核酸内切酶结合位点的解链温度为约50℃至约65℃。
11.根据权利要求7所述的方法,其中所述茎区包含CG二聚体。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述聚合酶具有5'至3'置换活性。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述聚合酶不具有5'至3'核酸外切酶活性。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸序列为双链DNA。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸序列为单链DNA。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸序列为RNA。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述环状探针和/或辅助探针是内引物、环状引物或为配置为用于环介导等温扩增反应的环状引物。
18.根据权利要求1所述的方法,其中在单个反应室中并且以恒温进行混合步骤和扩增步骤。
19.根据权利要求1所述的方法,其中实时检测由被切割的标记所提供的信号。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述反应混合物还包含选自由二价阳离子、缓冲液、核苷酸、脱氧核苷酸、核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录酶和增强剂组成的组中的一种或多种试剂。
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