CN101368209A - 一种基于核酸适体和pcr扩增来检测目标分子的方法 - Google Patents

Abstract

基于核酸适体的PCR(aptamer based polymerase chain reaction，A－PCR)是一种检测微量目标物质的高灵敏度技术。该技术把核酸适体和配体结合的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子来放大核酸适体和配体结合率，从而检测目标配体的一种方法。核酸适体PCR是迄今最敏感的检测方法之一，理论上可以检测单个目标分子。相比于免疫PCR，具有操作和过程简单，影响因素少，结果更加可靠的特点；敏感性比现行的ELISA法高10²～10⁸倍，可以被广泛的应用于蛋白质分子和小分子的微量检测。

Description

一种基于核酸适体和PCR扩增来检测目标分子的方法

技术领域

本发明涉及一种用核酸分子识别和结合样品中的目标分子，利用PCR方法扩增来定量和检测目标分子的方法。

背景技术

核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术(Systematic evolution of ligand byexponential enrichment，SELEX)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。自1990年Tuerk等首次利用SELEX技术成功筛选到噬菌体T₄DNA聚合酶的RNA型适体以来，截止到2004年6月8日，据Aptamer Database网站报道，各个实验室通过该技术已成功筛选出了2882种核酸适体，许多申请专利保护的适体序列还未计其中。核酸适体作为一种新型的分子识别工具，与传统的抗体相比不仅具有高度的亲和力与特异性，还具有易合成、易修饰、半衰期较长、不易变性、稳定性好等优点，并且避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点，有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。在基础研究、临床诊断、药物研制和目标蛋白的定量检测方面得以广泛应用。

目前，结合核酸适体对蛋白质和小分子的检测方法有分子荧光、电化学、化学发光等手段，具有较高的灵敏度。这些方法的检测限一般在10^-6—10^-12mol/L，但是对于更高灵敏度的检测要求则难以做到，或者结果重现性差，难以在实际应用。

PCR技术自1985年问世以来，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。但是PCR只能对DNA分子进行扩增和检测，限制了它对蛋白质和小分子的检测。

1992年Sano等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的、极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫PCR。免疫PCR运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，实验中可检测到数百个抗原分子，在理论上甚至可检测到1至数个抗原分子。但免疫PCR影响因素较多，如连接分子、显示系统的选择、DNA报告分子的浓度、PCR循环次数等，都影响它的敏感性和特异性，目前该技术尚未完全成熟，限制了它的进一步应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适体的PCR方法。用于高灵敏度的检测微量目标物质。

本发明所提供的方法，称为核酸适体PCR(aptamer based polymerase chain reaction，A-PCR)，包括以下步骤：

1固定能与目标分子结合的核酸片段或者核酸适体。

在核酸适体的一端上(3’端或者5’端)上预先标记硫基或者生物素(为便于描述，我们将此核酸适体命名为A链)，以固定在支持物上。如：可以标记硫基，以固定在铂金电极上；或者标记生物素和标记链霉亲和素或者亲和素的支持物相连接。与电极固定时，首先将电极磨好，将电极浸放在含有核酸适体的溶液中过夜，核酸适体的浓度在10^-8—10^-12mol/L之间。

2在固定A链后，为了使固定在电极上的A链直立不倒伏，我们用硫基来饱和电极上的结合位点。

3设计一个核酸片段，特征在于：与步骤1中的核酸片段部分互补；长度大于30碱基(为便于描述，我们将此核酸适体命名为B链)。为了后面步骤的有效分离，可以在B链的一端标记生物素，以和标记链霉亲和素或者亲和素的磁珠结合。

4将B链与A链杂交，形成部分互补的杂交双链。杂交温度45℃，杂交时间大于30min，杂交时B链过量，杂交后从溶液中取出电极并冲洗，以去除多余的B链。

5将形成的杂交双链核酸与包含目标分子的样品溶液混合。混合后，核酸适体(A链)和目标分子(配体)结合，形成核酸片段和目标分子复合物，这种结合造成B链和A链的解离。

6用磁珠吸附游离在样品溶液中的B链，进行富集，并去除样品溶液中对PCR扩增有负面影响的成分。

7如果B链为RNA，将其反转录为cDNA。

8用PCR或者荧光定量PCR方法扩增步骤5中解离的B链；或者步骤6中富集的B链；或者步骤7中反转录的cDNA。

9用扩增的DNA的量或者荧光定量PCR计算出的Ct值来间接的定量目标分子。

将扩增的DNA用电泳进行特异PCR产物检测，根据目标条带的有无或者强弱来判断目标分子的多少，或者根据荧光定量PCR计算出的Ct值来判断。Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系，利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图，制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确的确定起始模板的数量。

本发明的原理如图1所示。

1在支持物(电极)上固定核酸适体(A链)；2用硫基来饱和电极上的结合位点；3将B链与A链杂交，形成部分互补的杂交双链；4将形成的杂交双链核酸与样品溶液混合，核酸适体和目标分子(配体)结合后，B链和A链的解离；5用磁珠吸附游离在样品溶液中的B链，进行富集；6用PCR或者荧光定量PCR方法扩增并检测。

该技术把核酸适体和配体结合的高特异性和聚合酶链反应的高灵敏性有机结合起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子来放大核酸适体和配体结合率，从而检测目标配体的一种方法。它利用核酸适体和目标分子的结合力高于核酸适体和互补序列的结合力这一特点，已结合配体的核酸适体将和DNA报告分子解离，PCR扩增这段解离下的DNA分子并检测特异PCR产物。将蛋白质和小分子的检测转换为特异识别的核酸适体的检测，不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点，还有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。核酸适体PCR是迄今最敏感的检测方法之一，理论上可以检测单个目标分子。相比于免疫PCR，具有操作和过程简单，影响因素少，结果更加可靠的特点；敏感性比现行的ELISA法高10²～10⁸倍，可以被广泛的应用于蛋白质分子和小分子的微量检测。将会在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。

本发明的核酸适体PCR具有以下优点：

1操作和步骤简单，影响因素少，结果可靠。

2高特异性。

3高灵敏性，理论上可以检测单个目标分子。

4可以在溶液中直接对生物分子进行识别和检测。

5可以在生物体液中直接对生物分子进行识别和检测。

附图说明

附图1为：Aptamer based PCR原理图

附图2为：荧光定量PCR

附图3为：依据Ct值确定扩增前B链的量

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：用Aptamer based PCR进行血清或血浆中微量可卡因的检测(小分子检测)(不用磁珠富集和分离)

本实验所用的DNA序列：

A链序列：(39 bases)

3-HS-(CH2)₆-CTG GGT GAA GTA ACT TCC TAA AAG GAA CAG AGG GGGAGT-5

B链序列：(58bases)

5-GTGTGAAGCGGCATCTAAAGCGTCTCCCCCTCAAGACTAGGTCCAGCCCAGAGGTGTC-biotin-3

斜体部分是模板的杂交部位

B链引物：

S：5-GTG TGA AGC GGC ATC TAA AGC-3(21bases)

A：5-GAC ACC TCT GGG CTG GAC C-3  (19bases)

实验步骤：

一、金电极的处理

1、首先滴一滴分离试剂在金电极上，15min后，用双蒸水冲掉。

分离试剂：H₂O₂：浓H₂SO₄＝7：3(体积比)

2、用Al₂O₃泥浆对金电极进行抛光。磨金电极时要用力均匀，金电极一定要垂直。

3、用双蒸水将金电极冲洗干净，用滤纸和洗耳球吹干电极。

4、用银/氯化银电极、铂电极、金电极在铁氰化钾标准液中表征，得到的循环伏安图(后面简称CV图)上显示的电压差70-85mv时，表示电极已磨好。

5、表征时的参数：

初始电压：-0.2v  高位电压：0.5v

低电压：-0.2v    扫描速度：0.05

扫描段数：6      灵敏度：1.e-005

注：电极磨好后要立即使用，否则重磨。

二、将A链结合到金电极上

1、取2μL 1nM(相当于1.2*10⁹个)的A链于1.5mL的EP管中，然后向EP管中加入298μL 1.0M KH₂PO₄缓冲液，使EP管中溶液总体积为300μL

2、将金电极垂直悬于EP管溶液中

3、将步骤2的装置放置在室温下孵育8-12h

4、用10mM PBS(pH＝7.3)冲洗电极3次，每次200μL

5、用约3-4mL双蒸水浸泡电极5min，用洗耳球吹干电极，测CV图

6、测完CV图，再用10mM PBS(pH＝7.3)冲洗3次，吹干

7、将金电极垂直悬于300μL 1.0mM巯基乙酸中，室温1h

8、再用3-4mL双蒸水浸泡电极5min，取出电极，吹干，测CV图

9、测完CV图，将电极浸泡于10mM PBS(0.3M NaCl，pH＝7.3)中

注：1、用水浸泡电极，冲掉未与金电极作用的A链与巯基乙酸

2、Bare-Au电极CV图，Au-A链CV图，Au-A链-巯基乙酸CV图进行叠加，通过观察电极可逆性来判断结果是否正确。

理论上：裸金电极给出一个可逆对称峰图，组装了SH-aptamer链(A链)之后，电极的可逆性应该显著降低，这是因为A链是一段ssDNA，其带负电荷的磷酸骨架为电极表面引入了大量的负电荷，排斥〔Fe(CN)₆〕^3-/4-接近电极进行电子交换。当自组装了SH-(CH₂)-COOH之后，电极的可逆性又有所恢复。这是因为SH-(CH₂)-COOH填补了电极上的空位，使得原先整个横躺在电极表面上的A链除根部以外离开电极表面立起来。这样，电极表面的负电荷就大大减少，电极的可逆性得到部分恢复。

三、将B链和A链杂交

1、取2μL 10nM的B链于小烧杯中，再加入498μL 10mM PBS(0.3M NaCl pH＝7.3)混匀，总体系为500μL。

2、将步骤二中准备好的电极插入到上述溶液中，金电极既要接触溶液，又不能碰触烧杯底部，并在小烧杯上盖一塑料盖子，盖子要扣紧，以防电极接触烧杯底部。

3、将步骤2的装置放入40℃下孵育45min，且震荡使溶液混合均匀。

4、反应完成后，用10mM PBS(pH＝7.3)彻底冲洗金电极，以除去未杂交上的B链。

5、吹干电极，测CV图。

6、比较此次CV图与前三次的异同，可判断B链有没有与A链杂交。理论上：当B链与A链杂交之后，电极的可逆性也应该显著降低，这是因为B链也是一段ssDNA，其带负电荷的磷酸骨架为电极表面引入了大量的负电荷，排斥〔Fe(CN)₆〕^3-/4-接近电极进行电子交换。

四、与可卡因结合

1、将步骤三中准备好的电极其中一根依次插入到上述4个不同浓度的可卡因溶液中(浓度由低到高分别为10^-21M、10^-20M、10^-19M、10^-18M，10mM PBS，1M NaCI，pH＝7.0，溶液体积300μl)。

2、将步骤三中准备好的电极直接加入到含有可卡因的待检溶液中并在室温下孵育20min。

注：由于可卡因与A链可特异性结合，所以先前与A链结合的B链从杂交链

上脱落下来，可卡因结合的量跟B链脱落下来的量一一对应，所以可以通过检测脱落B链的量从而推出溶液中可卡因的量。

五、荧光定量PCR

1、荧光定量PCR仪器参数的设置：

第一个阶段：一共一个循环，条件是：50.0℃ 2min

第二个阶段：一共一个循环，条件是：95.0℃ 10min

第三个阶段：一共四十个循环，条件是：95.0℃ 15s；60.0℃ 1min

2、荧光定量PCR：(15μL体系)

取步骤四中孵育后的溶液(在实际检测中，需要先10000G离心10min，取上清)7.65μL于200μL的荧光定量PCR管中，再加入3.75μL ABI mix、0.3μL 10^-5M的上下游引物，最后用灭菌水补平体系，使体系体积为15μL。

3、将荧光定量PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照1中的程序进行反应，得到PCR图。

4、通过PCR得到的Ct值与B链浓度做Ct值-B链浓度的关系曲线。

5、通过实际样品的Ct值与标准曲线判断实际样品中可卡因的量。

实例2：用Aptamer based PCR进行血清中凝血酶的检测(蛋白质检测)

本实验所用的DNA序列：

A链序列：

5-HS-(CH2)₆-ATATAGGTTGGTGTGGTTGG-3

B链序列：

5-CAG TGA AGC GGC ATC TAA AGC ACG AGT CTG AGT CCA ACC ACA-3

B链的引物：A：5-TGT GGT TGG ACT CAG AC TCG-3

S：5-GTG TGA AGC GGC ATC TAA AGC-3

实验步骤：

一金电极的处理：

1首先滴一滴分离试剂在金电极上，15min后，用双蒸水冲掉。

分离试剂：H₂O₂:浓H₂SO₄＝7：3(体积比)

2用Al₂O₃泥浆对金电极进行抛光。磨金电极时要用力均匀，金电极一定要垂直。

3用双蒸水将金电极冲洗干净，用滤纸和洗耳球吹干电极。

4用银/氯化银电极、铂电极、金电极在铁氰化钾标准液中表征，得到的CV图上显示的电压差70-85mv时，表示电极磨好。

表征时的参数：

初始电压：-0.2v   高位电压：0.5v

低电压：-0.2v     扫描速度：0.05

扫描段数：6       灵敏度：1.e-005

注：电极磨好后要立即使用，否则重磨。

二将A链结合到金电极上

1取2μL 1nM(相当于1.2*10⁹个)的A链于1.5mL的EP管中，然后向EP管中加入298μL1.0MKH₂PO₄缓冲液，使EP管中溶液体积为300μL

2将金电极垂直悬于EP管溶液中

3将步骤2的装置放置在室温下孵育8-12h

4用10mM PBS(pH＝7.3)冲洗电极3次，每次200μL.

5将金电极垂直悬于300μL 1.0mM巯基乙酸中，室温1h，取出后将电极浸泡于10mM PBS(0.3M NaCl，pH＝7.3)中。

三B链和A链杂交

1取2μL 10nM的B链于小烧杯中，再加入498μL 10mM PBS(0.3M NaCl pH＝7.3)混匀，总体系为500μL。

2将步骤二中准备好的电极插入到上述溶液中，金电极既要接触溶液，又不能碰触烧杯底部，并在小烧杯上盖一塑料盖子，盖子要扣紧，以防电极接触烧杯底部。

3将步骤2的装置放入40℃下孵育45min，且要一直摇晃。

4反应完成后，用10mM PBS(pH＝7.3)彻底冲洗金电极，以除去未杂交上的B链。

四、与凝血酶结合

1、标准凝血酶溶液的配制：

将0.148mg凝血酶溶于460μL 10mM PBS(pH＝7.0)中，即可得到浓度为10^-5M的凝血酶母液。稀释此母液，依次得到浓度为10^-21M、10^-20M、10^-19M、10^-18M的凝血酶溶液(10mM PBS，2mM Mg²⁺，10mM K⁺，pH＝7.0，溶液体积300μl)。

3、将步骤三中准备好的电极依次插入到上述4个不同浓度的凝血酶溶液中(从浓度低到浓度高)。

4、电极与每个浓度的凝血酶均在室温下孵育20min

注：由于凝血酶与A链可特异性结合，所以先前与A链结合的B链从杂交链上脱落下来，凝血酶结合的量跟B链脱落下来的量一一对应，所以可以通过检测脱落B链的量从而推出溶液中凝血酶的量。

5、用另外一根电极和待检的含凝血酶的溶液在室温下孵育20min。

五、荧光定量PCR

1、荧光定量PCR仪器参数的设置：

Stage1           Stage2                         Stage3

Rep1             Rep1                           Reps40

50.0℃           95.0℃            95.0℃       60.0℃

2min             10min             15s          1min

2、荧光定量PCR：(15μL体系)

取步骤四中孵育后的溶液7.65μL(实际检测的样品，需要先10000G离心10min，取上清)于200μL的荧光定量PCR管中，再加入3.75μL ABI mix、0.3μL 10^-5M的上下游引物，最后用灭菌水补充体系，使体系体积为15μL。

3、将荧光定量PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照1中的程序进行反应。

4、通过PCR得到的Ct值与B链浓度做Ct值-B链浓度的关系曲线。

5、通过实际样品的Ct值与标准曲线判断实际样品中凝血酶的量。

Claims (9)

1.一种基于核酸适体和PCR(polymerase chain reaction)扩增来检测目标分子的方法。

包含目标分子的溶液中含有目标分子和核酸，步骤包括：

(a)固定能与目标分子结合的核酸片段或者核酸适体；

(b)将与步骤(a)中的核酸片段部分互补的另一核酸片段与步骤(a)中的核酸片段杂交；

(c)将步骤(b)中形成的杂交双链核酸与包含目标分子的样品混合；

(d)步骤(a)中的核酸片段与目标分子结合，形成核酸片段和目标分子复合物，这种结合，造成与步骤(a)中核酸片段互补的核酸片段的解离；

(e)如果在(b)中与步骤(a)中部分互补的核酸片段为RNA，则将其反转录为cDNA(complementary DNA)；

(f)用PCR或者荧光定量PCR方法扩增步骤(d)解离的核酸片段或者步骤(e)中反转录的cDNA；

(g)用扩增的DNA的量或者计算出的Ct(cycle threshold)值来间接的检测或者定量目标分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中的核酸片段上标记有生物素，可以和标记有链霉亲和素或者亲和素的支持物连接，或者步骤(a)中的核酸片段上连接硫基，可以和电极连接和固定。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中与步骤(a)中的核酸片段互补的核酸片段长30-10000碱基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(d)中的核酸片段上标记有生物素，可以用标记有链霉亲和素或者亲和素的磁珠或其他支持物进行富集。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：目标分子是一个无机化合物，分子量在10-500g/mol。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：目标分子是一个有机化合物，分子量在100-1000g/mol。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：目标分子是一个蛋白质或者蛋白质片段，分子量在500-50000g/mol。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包含目标分子的样品取自血液、血清、尿液、精液、脑脊髓、流体、支气管气体和器官组织。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用PCR扩增来检测和定量目标分子时，目标分子的浓度在0.005-5000pg/ml。

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