CN103487483B - 基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于枝状金修饰掺硼金刚石膜(BDD)电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，涉及一种基于电化学手段的特殊形貌纳米枝状金/BDD电极的制备方法，以及利用该修饰电极的表面特性，进一步进行核酸适配体负载组装，构筑出17β-雌二醇适配体传感器，并用于对环境内分泌干扰物17β-雌二醇的高灵敏、高选择性的电化学分析方法。与现有技术相比，本发明采用一种简便新颖的双模板法在BDD基底电极上构筑具有多级活性位点的枝状金结构，同时采用能特异结合靶物质的核酸适配体，有效地降低了分析过程中的噪音，大大提高了传感器的检测灵敏度和选择性，检测限达到5×10^-15 mol/L，传感器具有良好的重现性。

Description

基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法

技术领域

本发明涉及属于纳米材料、电化学分析和环境检测技术领域，尤其涉及一种基于枝状金修饰掺硼金刚石膜(BDD)电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法。

背景技术

内分泌干扰物(EDCs)是一类人工制得或自然存在的外源雌激素,与内源雌激素有相似的功能。他们能干扰生物的正常行为以及体内正常激素的合成、贮存、分泌、体内输送、结合及清除等过程，导致生物体出现各种各样的机能障碍。如造成生物生殖功能损害，种群数量下降，人类男女出生比率失调，诱发各种癌症等。因此，对内分泌干扰物进行有效检测，对保护生态环境、保护人和动物健康不受损害等具有十分重要的意义。人类甾体雌激素主要有三种：17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)、雌三醇、雌酮．其中17β-雌二醇是雌效应最强的天然甾体雌激素，在极低的浓度时(0.1 ng/L)就能表现出极强的生物效应。因此，对17β-雌二醇的检测具有重要的环境意义。

目前对于17β-雌二醇的检测方法主要有光谱法，色谱法，液相色谱-质谱连用等方法。但这些方法尽管有一定的灵敏度，但所用仪器较为昂贵，操作复杂，样品需要严格的前期处理等，都限制了对17β-雌二醇的快速、灵敏检测。因此，建立一种成本低廉，操作简单，灵敏度高，适于实时检测的17β-雌二醇的分析手段具有重要的应用价值。

电化学分析与色谱分析法相比，样品预处理简单，不需要大型仪器，速度快；与光谱分析方法相比，不需要引入光学信号标记物质；与质量分析法相比，适用领域更广，更适用于小分子或者质量变化不甚明显的作用体系。然而，17β-雌二醇的电活性较弱，直接采用电化学手段检测，不能获得理想的检测效果。

核酸适配体(aptamer)是一种在核苷酸序列库中利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术( SELEX) 筛选得到的，功能类似于单克隆抗体，能与靶物质高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸DNA或RNA片段，具有特异性高、稳定性高、易修饰、合成速度快、与靶物质作用明显等优点。而17β-雌二醇的适配体早已被筛选出来 (Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 2525–2531)，因此开发一种针对17β-雌二醇的电化学适配体传感器有望获得良好的检测灵敏度和选择性。

掺硼金刚石膜(BDD)电极具有电势窗口宽，析氧电位高，背景电流低，化学、电化学稳定性高，耐腐蚀，表面自净能力强，电极表面终端基团可控等优异特性，同时具有大大高于其他常规电极的信噪比(S/B)，对分析检测的干扰小，可以提高检测的准确度和精度。

纳米金具有良好的导电性和生物催化性，同时可以通过Au-S键与适配体分子牢固结合，广泛用于生物传感器的构筑中。通过许多科研工作者的努力，许多具有大量活性位点的不同结构纳米金被合成。本发明中在BDD表面构筑的特殊形貌的纳米枝状金，就具有多级活性位点，大幅度地提高了BDD基底电极的导电性能，并能大量结合适配体分子，有力地提高了检测效果。

发明内容

本发明的目的就是针对现有检测17β-雌二醇技术的灵敏度不高、操作复杂等不足而提供一种基于纳米枝状金修饰BDD电极的17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，通过于基底电极修饰特殊结构的纳米枝状金，提高了电极导电性和负载适配体能力，实现了对17β-雌二醇的高灵敏、高选择性检测，检测灵敏度达到5×10^-15 mol/L，具有制备方法简单，操作简便，耗时短等优点。

本发明提出的一种基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，采用双模板法于掺硼金刚石膜表面修饰枝状金，并以其为基础构筑适配体传感器，实现对环境内分泌干扰物17β-雌二醇的高灵敏、高选择性检测，检测灵敏度达到5×10^-15 mol/L；具体步骤如下：

(1)以王水浸泡预处理后的BDD电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，1~2 mol/L 的H₂SO₄溶液为电解液，采用i-t方法，施加3.2~4.5 V电压于电极体系，保持30~45min，之后将BDD电极用去离子水淋洗干净，空气中干燥，即得到表面干净的BDD电极；之后在0.5 mol/L ZnCl₂、1~3 mol/L KCl和0.5 mol/L H₃BO₃的混合液中，控制混合液的pH值为4.0~5.5，恒电流沉积25~35 s，电流密度0.12~0.14 A/cm2；沉积结束后，将所得电极用去离子水小心冲洗后，迅速插入2.5~3 mmol/L HAuCl₄溶液中，置换6 h后，得到纳米枝状金修饰的BDD电极；

(2)将17β-雌二醇适配体离心后配制成2 μmol/L水溶液，经2 mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液（TCEP）打开二硫键后，直接滴涂于干燥的步骤(1)所得的纳米枝状金修饰的BDD电极上，于37 ℃生化培养箱中过夜组装；得到17β-雌二醇适配体传感器；

(3)配制一系列不同浓度的待测物质17β-雌二醇的标准溶液，并依次分别结合步骤(2)所得17β-雌二醇适配体传感器，常温培养15 min后，采用电化学交流阻抗法进行电化学检测，通过得到的阻抗值的变化率与待测物质17β-雌二醇的标准溶液浓度的线性关系绘制工作曲线，考察传感器的灵敏度。然后用含干扰物质的标准溶液，于同样条件下培养传感器，采用电化学交流阻抗法测定含干扰物质的标准溶液的阻抗值，以不含干扰物质的标准溶液引起的阻抗变化率作为比较标准，考察含有干扰物质的标准溶液引起的阻抗值变化情况，绘制柱状图，考察传感器的选择性能；每次测定后，将电极用50 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液淋洗2-3次，实现电极表面的再生。

本发明中，所述的含干扰物质的标准溶液是将1×10^-13 mol/L待测物质17β-雌二醇分别与100倍浓度于17β-雌二醇的干扰物质混合，用得到的混合液结合传感器，实现传感器的选择性能考察。

本发明中，所述干扰物质为雌三醇、双酚A、阿特拉津、壬基酚、间苯二酚或邻苯二甲酸二乙酯中任一种。

本发明中，所述的17β-雌二醇适配体的核苷酸序列为：

5’-SHGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1） 选用BDD电极作为基底电极，通过电沉积和置换反应，得到了具有特殊形貌的纳米枝状金/BDD电极，大大改善了电极的电化学性能和结合适配体分子的能力，适配体的结合量达到1.99×10¹³ 个/cm²，电极制备方法简单，性能优异。

(2)通过电化学阻抗法得到检测信号，信号变化灵敏、直观，同时基底BDD电极具有背景电流低，良好的自净功能等优异性能，降低了检测过程中的噪音，传感器对17β-雌二醇的检测灵敏度达到5×10^-15  mol/L，线性范围从5×10^-15 mol/L~1×10^-10  mol/L。

(3)检测后，电极可采用50 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液进行再生，使得电极可以多次重复使用，电极性能稳定，灵敏度高。

(4)本发明的适配体传感器电化学分析方法实现了对17β-雌二醇的高灵敏检测，每次检测只需将电极置于待测溶液中常温培养15 min，方法简单易行，灵敏度高，同时具有良好的选择性，即使待测液中同时含有六种100倍浓度于待测物的干扰物质，对信号的干扰也在15%以内，适用于环境监测中的在场分析。

附图说明

图1为实施例1制备的枝状金/ BDD电极的扫描电镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

(1)一种以特殊形貌枝状金纳米结构修饰掺硼金刚石膜(BDD)基底电极的17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，其工作电极通过以下步骤得到：

以王水浸泡预处理后的BDD电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，1 mol/L 的H₂SO₄溶液为电解液，采用i-t方法，施加3.2V电压于电极体系，保持30 min，之后将BDD电极用去离子水淋洗干净，空气中干燥，即得到表面干净的BDD电极；之后在0.5 mol/L ZnCl₂ 、3 mol/L KCl和0.5 mol/L H₃BO₃的混合液(pH=4.5)中，恒电流沉积30 s，电流密度0.13 A/cm2；沉积结束后，将所得电极用去离子水小心冲洗后，迅速插入2.5 mmol/L HAuCl₄溶液中，置换6 h后，得到纳米枝状金修饰的BDD电极。

纳米枝状金修饰的BDD电极的形貌通过场发射扫描电子显微镜(SEM)进行表征，见图1，从图中可以看出，BDD表面成功修饰了形貌清晰的枝状金纳米结构，主干平均长度约20 μm，最长约35 μm。

纳米枝状金修饰的BDD电极的电化学性质使用CHI660c电化学工作站，进行电化学表征。以制备得到的枝状金/BDD电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在5 mmol/L的[ Fe(CN)₆]^4-/[ Fe(CN)₆]^3-(含0.1 mol/L KCl)混合液中进行循环伏安和电化学阻抗测量。对比结果显示，枝状金/BDD电极的可逆性和导电性都得到了较大的改善。

(2)组装适配体后的传感器通过以下步骤得到：将商业购买的17β-雌二醇适配体离心后配制成2 μmol/L水溶液，经2 mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶液打开二硫键后，直接滴涂于干燥的制得的纳米枝状金/BDD电极上，于37 ℃生化培养箱中过夜组装，得到结合了适配体的17β-雌二醇的传感器。

该传感器选用的17β-雌二醇适配体序列为：

5’-SHGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’

(3)采用组装好的适配体传感器进行17β-雌二醇的检测。

将17β-雌二醇溶于pH=8.0的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，配成不同浓度的标准液。Tris-Hcl缓冲液的成为为200 mmol/L NaCl, 25 mmol/L KCl, 10 mmol /L MgCl₂ 以及5%乙醇。分别将不同浓度的标准液加入5 mmol/L的[ Fe(CN)₆]^4-/[ Fe(CN)₆]^3-(含0.1 mol/L KCl)的电解液中，与传感器常温培养15 min，然后以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在CHI660c电化学工作站上，进行电化学阻抗检测。根据得到的阻抗值的变化率与标准溶液浓度的线性关系绘制工作曲线，得到对17β-雌二醇的线性检测效果。检测结果表明传感器对17β-雌二醇的检测具有高度灵敏度，检测限达到5×10^-15 mol/L，线性范围从5×10^-15 mol/L~1×10^-10 mol/L。

(4)采用组装好的适配体传感器进行选择性能检测。

将1×10^-13 mol/L 17β-雌二醇分别与100倍浓度于17β雌二醇的干扰物质的混合液分别加入5 mmol/L的[ Fe(CN)₆]^4-/[ Fe(CN)₆]^3-(含0.1 mol/L KCl)的电解液中，与传感器常温培养15 min，然后以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在CHI660c电化学工作站上，进行电化学阻抗检测，通过含干扰物质的标准溶液引起的传感器的阻抗变化率与不含干扰物质的标准溶液引起的阻抗变化率的比较，得到传感器的选择性能。干扰物质包括雌三醇，双酚A，阿特拉津，壬基酚，间苯二酚和邻苯二甲酸二乙酯。结果显示，100倍浓度于17β-雌二醇的干扰物质对17β-雌二醇的阻抗变化造成的影响均小于10%，即使当选取的雌三醇，双酚A，阿特拉津，壬基酚，间苯二酚和邻苯二甲酸二乙酯六种干扰物质一起与17β-雌二醇混合，干扰物质浓度均为17β-雌二醇浓度的100倍，所引起的阻抗变化仍小于15%。体现了该纳米枝状金/BDD核酸适配体传感器的良好的选择性能。

实施例2

采用制备好的核酸适配体传感器进行实际水样中17β-雌二醇的含量分析。

实际水样取自于中国上海市杨浦区四平路的一处生活小区内。水样经0.22 μm滤膜过滤后进行检测。水样采用Tris-HCl缓冲液稀释25倍后，加入含有5 mmol/L的[ Fe(CN)₆]^4-/[ Fe(CN)₆]^3-(含0.1 mol/L KCl)的电解液中，与传感器常温培养15 min，然后以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在CHI660c电化学工作站上，进行电化学阻抗检测，得到水样所引起的传感器的阻抗的变化率。通过实施例1中得到的传感器灵敏度曲线可以反算出水样中所含17β-雌二醇的含量。实验中得出水样中17β-雌二醇的含量为3.02×10^-14  mol/L。

上述的对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  同济大学

 

<120>  基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法

      

 

<130>  11

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  78

<212>  DNA

<213>  人类

 

<400>  1

shgcttccag cttattgaat tacacgcaga gggtagcggc tctgcgcatt caattgctgc     　　　　　60

 

gcgctgaagc gcggaagc                                                   78

 

 

Claims (4)

1.一种基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，其特征在于，采用双模板法于掺硼金刚石膜BDD表面修饰枝状金，并以其为基础构筑适配体传感器，实现对环境内分泌干扰物17β-雌二醇的高灵敏、高选择性检测，检测灵敏度达到5×10^-15 mol/L；具体步骤如下：

(1)以王水浸泡预处理后的BDD电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，1~2 mol/L 的H₂SO₄溶液为电解液，采用i-t方法，施加3.2~4.5 V电压于电极体系，保持30~45min，之后将BDD电极用去离子水淋洗干净，空气中干燥，即得到表面干净的BDD电极；之后在0.5 mol/L ZnCl₂、1~3 mol/L KCl和0.5 mol/L H₃BO₃的混合液中，控制混合液的pH值为4.0~5.5，恒电流沉积25~35 s，电流密度0.12~0.14 A/cm2；沉积结束后，将所得电极用去离子水小心冲洗后，迅速插入2.5~3 mmol/L HAuCl₄溶液中，置换6 h后，得到纳米枝状金修饰的BDD电极；

(2)将17β-雌二醇适配体离心后配制成2 μmol/L水溶液，经2 mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液打开二硫键后，直接滴涂于干燥的步骤(1)所得的纳米枝状金修饰的BDD电极上，于37 ℃生化培养箱中过夜组装；得到17β-雌二醇适配体传感器；

(3)配制一系列不同浓度的待测物质17β-雌二醇的标准溶液，并依次分别结合步骤(2)所得17β-雌二醇适配体传感器，常温培养15 min后，采用电化学交流阻抗法进行电化学检测，通过得到的阻抗值的变化率与待测物质17β-雌二醇的标准溶液浓度的线性关系绘制工作曲线，考察传感器的灵敏度；然后用含干扰物质的标准溶液，于同样条件下培养传感器，采用电化学交流阻抗法测定含干扰物质的标准溶液的阻抗值，以不含干扰物质的标准溶液引起的阻抗变化率作为比较标准，考察含有干扰物质的标准溶液引起的阻抗值变化情况，绘制柱状图，考察传感器的选择性能；每次测定后，将电极用50 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液淋洗2-3次，实现电极表面的再生；采用电化学交流阻抗法进行电化学检测具体为：在5 mmol/L的[ Fe(CN)₆]^4-/[ Fe(CN)₆]^3-，其中含0.1 mol/L KCl的混合液中进行电化学阻抗测量。

2.根据权利要求1所述的一种基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，其特征在于，所述的含干扰物质的标准溶液是将1×10^-13 mol/L待测物质17β-雌二醇分别与100倍浓度于17β-雌二醇的干扰物质混合，用得到的混合液结合传感器，实现传感器的选择性能考察。

3.根据权利要求2所述的一种基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，其特征在于，所述干扰物质为雌三醇、双酚A、阿特拉津、壬基酚、间苯二酚或邻苯二甲酸二乙酯中任一种。

4.根据权利要求1所述的基于枝状金修饰BDD电极上构筑17β-雌二醇适配体传感器的电化学分析方法，其特征在于，所述的17β-雌二醇适配体的核苷酸序列为：

5’-SHGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’。