CN101982764A - 复合膜修饰的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体公开了一种复合膜修饰的生物传感器及其制备和应用，该生物传感器包括有一基体电极，其感应端包覆有一芳香族二胺聚合物膜，膜上修饰有碳纳米管-刚果红结合物层，结合物层上吸附有纳米金颗粒层。其制备方法为：先在基体电极感应端通过电聚合反应形成聚合物膜；再在膜上修饰碳纳米管-刚果红结合物层，最后在结合物层上电沉积纳米金即可。本发明的生物传感器可应用于检测目标基因，检测时的先设计探针，然后修饰捕获探针，经过一、二次杂交和酶催化反应后，即可判断待测杂交液中是否含有目标基因及目标基因的浓度大小。本发明的生物传感器具有导电性好、生物相容性好、灵敏度高、抗干扰性强、选择性好、制作成本低等优点。

Description

复合膜修饰的生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种经过复合膜修饰后的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

生物传感器是一个极具发展潜力的学科领域，其快速敏锐的检测性能给诸多学科提供不可或缺的信息。随着纳米科技的不断发展和检测手段的日新月异，基于纳米材料的多种生物传感器的集成是生物传感器发展的重要趋势。目前，国内外众多研究者对碳纳米材料、金属纳米材料在生物传感器方面的应用进行了大量的理论和实验研究，并取得了突破性的进展，为纳米材料在生物传感器方面的应用开创了新的局面。

碳纳米管(CNTs)是一种良好的传感及载体材料，其优良的导电性能会很好地促进生物电活性分子的电子传递，应用于电化学传感器上能显著提高对多种无机、有机和生物靶目标的响应程度。碳纳米管作为一种理想的电极材料，有着其独特的性能，例如比表面积大、表面活性高、催化效率高、表面带有较多的功能基团等，能提高生物识别分子(酶、DNA、抗原/抗体等)在碳纳米管电极上的固定效率。与常规的固态碳传感器相比，碳纳米管制作的传感器灵敏度高、反应速度快、检测范围广，必将为生物传感器的发展带来更大的进步。

纳米金颗粒是最稳定的贵金属纳米粒子之一，其特殊的稳定性、小尺寸效应、量子效应、表面效应及生物亲和性等，使它成为在光学、电子、催化和生物医药等方面研究和应用的热点。在生物分析中，金纳米颗粒已用于DNA检测以及免疫检测等。金纳米金颗粒直径小，比表面积大，且具有良好的生物兼容性，可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的Au-S共价键，这使得纳米金与生物活性分子之间的结合能力大大提高，且不会影响生物活性分子的结构和活性。因此，纳米金颗粒在生物传感器的制作方面同样具有潜在而广泛的应用价值。

应用生物传感器进行靶基因的痕量分析，这对于疾病诊断和治疗以及污染物的监测和控制来说是十分关键的。由于常规的紫外分光光度法对待测样品的浓度和纯度要求较高，因此对低浓度或者浊度较大的基因序列进行分析检测比较困难，且不能进行在线监测。而现有的基因传感技术由于其灵敏度有限，对低于皮摩尔级(pM，10^-12M)的基因序列也难以进行检测。因此，研制一种灵敏度极高、选择性好、操作简便、成本低的在线检测技术是生命科学研究、临床医学以及环境污染控制领域的一项重要的研究课题，而基于上述纳米材料修饰的基因传感器是目前生物传感器发展的一个重要方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种具有良好导电性、生物相容性、灵敏度高、抗干扰性强、选择性好、制作成本低的复合膜修饰的生物传感器，还提供一种该生物传感器相应的制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种复合膜修饰的生物传感器，所述生物传感器包括有一基体电极，所述基体电极的感应端包覆有一芳香族二胺聚合物膜，所述芳香族二胺聚合物膜上修饰有碳纳米管-刚果红结合物层，所述碳纳米管-刚果红结合物层上吸附有纳米金颗粒层。

上述的复合膜修饰的生物传感器中，所述基体电极可以为现有电化学反应体系中用到的各种常规电极，但经过我们的实验，其优选为玻碳电极、金电极或铂电极。

上述的复合膜修饰的生物传感器中，所用到的芳香族二胺聚合物是一种较理想的有机导电材料，其良好的环境稳定性、优良的导电率及相对简单的制膜方法等都吸引着研究者的关注；芳香族二胺单体可以通过分子内一个或两个胺基的氧化而合成线形或梯形结构聚合物，这类特殊的结构使得芳香族二胺聚合物表现出比聚苯胺和聚吡咯更多的功能。由于芳香族二胺单体经电化学氧化聚合后，能直接在基体电极上形成性能良好的聚合物膜，该聚合物膜结构中的自由氨基还能与其他官能团结合而稳定存在，因此本发明选用芳香族二胺聚合物对基体电极首先进行修饰，这对本发明生物传感器功能的有效发挥起到了不可忽视的作用。经过我们的实验，所述芳香族二胺聚合物优选为1，5-萘二胺、1，8-萘二胺或对二氨基联苯。

上述的复合膜修饰的生物传感器中，所用到的碳纳米管(CNTs)可以为单壁碳纳米管，也可以为多壁碳纳米管。碳纳米管本身具有优良的物理化学性质(如较大的比表面积)，将其修饰在芳香族二胺聚合物膜表面，可增加DNA在生物传感器表面的固定量；同时，CNTs优良的导电性可使其作为固定DNA载体时的电信号明显增强，从而提高DNA修饰电极的灵敏度。

上述的复合膜修饰的生物传感器中，所用到的纳米金具有很好的生物相容性，其颗粒直径小，比表面积大，可使其与生物分子之间的结合能力大大提高；同时纳米金的放大效应也可以很好的提高本发明生物传感器的敏感度。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)材料准备：准备一经过预处理的基体电极，并配制碳纳米管-刚果红溶液和氯金酸溶液；

(2)电聚合芳香族二胺单体：以所述的基体电极作为工作电极，在添加有芳香族二胺单体的电解液中建立三电极系统，通过控制扫描电位(优选控制在-0.2V～0.8V)和扫描速率(优选控制在40mV·s^-1～60mV·s^-1)将芳香族二胺单体电聚合至所述基体电极的感应端，形成所述的芳香族二胺聚合物膜(该膜带自由氨基且相对致密)；

(3)修饰碳纳米管：向配制好的碳纳米管-刚果红溶液中滴加活化剂，再向所述芳香族二胺聚合物膜上滴涂添加了活化剂的碳纳米管-刚果红溶液(碳纳米管-刚果红溶液可以是利用酸处理后羧基化的碳纳米管与刚果红所带的氨基通过物理研磨共价结合制成)，自然晾干后在所述芳香族二胺聚合物膜上形成碳纳米管-刚果红结合物层；

(4)电沉积纳米金：以上述修饰有碳纳米管-刚果红结合物层的基体电极作为工作电极，以氯金酸溶液作为电解液，并建立三电极系统，通过控制扫描电位(优选控制在0V～0.9V)和扫描速率(优选控制在10mV·s^-1～15mV·s^-1)在碳纳米管-刚果红结合物层上电沉积纳米金颗粒，得到基于芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金的复合膜修饰的生物传感器。

上述制备方法的电聚合芳香族二胺单体步骤中，所述电解液优选为0.1M～0.2M的HCl溶液，所述芳香族二胺单体在电解液中的浓度优选为10mM～15mM。

上述制备方法的修饰碳纳米管步骤中，所述碳纳米管-刚果红溶液的浓度优选为3.0mg/mL～4.0mg/mL，滴加量优选为4μL～6μL，所述活化剂优选为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度分别优选为3mM～5mM和8mM～10mM。

上述制备方法的电沉积纳米金步骤中，所述氯金酸溶液的质量分数优选为0.1％～0.2％。

上述本发明的生物传感器主要是基于以下原理和思路：首先，在裸基体电极表面形成一层芳香族二胺聚合物，由于芳香族二胺聚合物具有良好的导电性，且带有大量的自由氨基基团，这使得酸处理后带有羧基基团的碳纳米管-刚果红结合物能通过共价键牢固结合在芳香族二胺聚合物膜层表面，该碳纳米管-刚果红结合物的水溶性很好，滴于芳香族二胺聚合物膜层表面干燥后便可形成一层致密、均匀、稳定的碳纳米管-刚果红结合物薄膜；由于刚果红又带有氨基基团，这使得纳米金颗粒能均匀致密地电沉积于碳纳米管-刚果红结合物薄膜表面，纳米金颗粒与碳纳米管之间通过刚果红上所带的氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，由于纳米金具有较高的稳定性和电导率，因此将纳米金颗粒电沉积于碳纳米管-刚果红结合物薄膜表面能给整个生物传感器带来一系列性能上的优化，大大降低或消除碳纳米管价带传输电子时的势垒；而后续检测应用时用到的一端修饰有巯基的捕获探针恰能与纳米金颗粒紧密结合，由于纳米金颗粒较大的比表面积和较好的生物相容性，使得纳米金颗粒与生物活性分子之间的结合能力大大提高，且能长时间保持生物分子的活性，大大提高了后续靶基因检测的灵敏度。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的复合膜修饰的生物传感器在检测目标基因中的应用，具体包括以下步骤：

(1)设计探针：根据目标基因的序列，利用现有的设计软件设计目标基因的捕获探针和响应探针；

(2)修饰捕获探针：在所述捕获探针5’端修饰巯基，并将修饰有巯基的捕获探针滴加到所述复合膜修饰的生物传感器的感应端进行自组装，然后用巯基己醇封闭剩余的结合位点；

(3)一次杂交：再将修饰捕获探针后的生物传感器浸入到待测杂交液中，通过碱基互补配对进行一次杂交；

(4)修饰响应探针：在所述响应探针3’端修饰生物素，并将一次杂交后的生物传感器浸入到修饰有生物素的响应探针溶液中，使其通过碱基互补配对(与目标基因的另一端互补配对)进行二次杂交，完成响应探针的固定；

(5)酶催化反应：将二次杂交后的生物传感器浸入到酶标后的链霉亲和素溶液中(利用亲和素与生物素之间极强的亲和力使酶结合在生物传感器上)，通过酶与其底物的催化反应使杂交信号放大，最后根据杂交信号的大小和已经建立的线性回归方程即可判断待测杂交液中是否含有目标基因及目标基因的浓度大小。

上述的复合膜修饰的生物传感器在检测目标基因中的应用，所述目标基因可以为木质素降解酶编码基因；所述的木质素降解酶可以为纤维二糖脱氢酶(CDH)；所述的CDH一般是指由黄孢原毛平革菌合成(但不限于此)，黄孢原毛平革菌是目前研究得最多的一种高效木质素降解菌，由于其能分泌多种木质素降解过程中的关键酶，CDH便是其中一种十分重要的酶。

针对上述的木质素降解酶编码基因，所述目标基因的目标链序列为：5’-TTGTTTCCTCCACTCGCTGT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT ACGGGAACTG CCACTTTGACA-3’；

针对该目标链序列，我们特别设计的所述目标基因的捕获探针序列可以为：5’-TGTCAAAGTG GCAGTTCCCG T-3’；

针对该目标链序列，我们特别设计的所述目标基因的响应探针序列可以为：5’-CAGCGAGTGG AGGAAACAA-3’。

上述优选技术方案中的捕获探针、目标链序列、响应探针等均是通过Blast N程序在NCBI的BLAST服务器上进行序列比对后，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0两个软件并针对CDH的编码基因自行设计出来，但并不仅限于上述的几种优选序列，以上述软件或其他公知的方法设计出的与上述序列相近似的其他DNA序列，均等同于本发明的上述技术方案。

上述的复合膜修饰的生物传感器在检测目标基因中的应用，所述酶优选为辣根过氧化物酶；所述底物则优选为对苯二酚和过氧化氢溶液。

如果第一次进行检测尚未建立线性回归方程时，可以先通过重复上述的步骤(2)～(5)检测一系列已知不同浓度的目标链杂交液，并根据每一特定浓度下的电流响应结果，得出目标链基因浓度与电化学杂交信号之间的线性关系，即可建立线性回归方程。当采用上述优选的技术方案对编码CDH的功能基因进行检测时，可直接采用线性回归方程：

I＝1.16851g(C)+3.6966

其中I的单位为μA，C的单位为10^-12M，该线性回归方程应用的线性检测范围为1.0×10^-15～1.0×10^-10M，相关系数r²为0.9957，检测下限为1.0×10^-16M。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用了纳米材料的尺度结构及其性能特异性，利用了不同材料之间修饰基团的共价结合或非共价吸附作用，将具备良好导电性的有机导电材料、具备良好生物相容性的碳纳米管和纳米金颗粒同时应用于电化学生物传感器中，进行核酸的固定、信号的检测和放大，使得本发明的生物传感器的检测灵敏度大幅提高。此外，本发明的生物传感器及应用还具有较强的抗干扰性，能够实时在线检测，选择性好，稳定性强，制作方便且成本低廉，在目标基因(尤其是木质素降解酶编码基因)的实时在线定量检测中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1的复合膜修饰的生物传感器的结构示意图。

图2为本发明实施例1的复合膜修饰的生物传感器在制作过程中，纳米材料修饰前后的扫描电镜图(SEM)；其中，(A)图为多壁碳纳米管酸处理前的扫描电镜照片，(B)图为多壁碳纳米管在酸处理后的扫描电镜照片，(C)图为多壁碳纳米管-刚果红结合物修饰后的扫描电镜照片，(D)图为纳米金颗粒修饰后的扫描电镜照片；且在每一幅图的右上角配有局部放大图。

图3为本发明实施例2中复合膜修饰的生物传感器的制作工艺流程及其在基因检测中的应用原理图。

图4为本发明实施例2中裸玻碳电极(裸GC电极)、多壁碳纳米管修饰电极(MCNTs/GC电极)、复合膜修饰的生物传感器(nano-Au/MCNTs/GC电极)及杂交后的复合膜修饰的生物传感器(dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极)经交流阻抗法扫描所得的电化学表征图；其中，a₁表示裸GC电极，b₁表示MCNTs/GC电极，c₁表示nano-Au/MCNTs/GC电极，d₁表示dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极。

图5为本发明实施例2中裸GC电极、纳米金直接修饰电极(nano-Au/GC电极)、nano-Au/MCNTs/GC电极及dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极经循环伏安法所得的电化学表征图；其中，a₂表示裸GC电极，b₂表示nano-Au/GC电极，c₂表示nano-Au/MCNTs/GC电极，d₂表示dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极。

图6为本发明实施例2中裸GC电极、dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极在加入底物前后经循环伏安法扫描所得的电化学表征图；其中，a₃表示裸GC电极，b₃表示加入底物前的dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极，c₃表示加入底物后的dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极。

图7为本发明实施例2中测得的电流值与编码CDH功能基因的目标链浓度的常用对数值之间的线性回归图。

图8为本发明实施例2中目标链和错配链在特异性测试条件下的电流响应对比图；其中，a₄表示捕获探针和响应探针与编码CDH功能基因的目标链完全杂交时的电流响应图，b₄表示捕获探针和响应探针与CDH目标链的两碱基错配链进行杂交时的电流响应图。

图9为本发明实施例2中的nano-Au/MCNTs/GC电极与nano-Au/GC电极的计时电流扫描对比图；其中，a₅表示nano-Au/MCNTs/GC电极，b₅表示nano-Au/GC电极。

图10为本发明实施例3中黄孢原毛平革菌培养品经纯化和PCR扩增出目标基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，(a)为样品纯化情形，(b)为PCR扩增后的情形。

图例说明：

1、基体电极

2、1，5-萘二胺聚合物膜

3、多壁碳纳米管-刚果红结合物层

4、纳米金颗粒层

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

一种如图1所示本发明的复合膜修饰的生物传感器，该生物传感器包括有一基体电极1，本实施例的基体电极1是选用玻碳电极，基体电极1的感应端包覆有一1，5-萘二胺聚合物膜2，该1，5-萘二胺聚合物膜2上修饰有多壁碳纳米管-刚果红结合物层3，该多壁碳纳米管-刚果红结合物层3上吸附有纳米金颗粒层4。

本实施例的生物传感器是通过以下步骤制备得到：

(1)玻碳电极预处理：用常规方法对玻碳电极进行预处理即可，具体到本实施例中，先将玻碳电极在抛光纸上依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浊液抛光至镜面，再依次用硝酸溶液(HNO₃∶H₂O＝1∶1)、无水乙醇、超纯水分别超声清洗5min；以清洗后的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，在0.5M的H₂SO₄溶液中建立三电极系统，在-0.4V～0.8V电位范围内进行循环伏安法扫描(CV)，直至获得稳定闭合的循环伏安图为止。

(2)电聚合1，5-萘二胺单体：取5mL25mM的1，5-萘二胺的乙醇溶液和5mL0.1M的HCl溶液充分混合，以此混合液作为电解液并控制1，5-萘二胺单体在电解液中的终浓度为12.5mM；再以经过预处理后的玻碳电极作为工作电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，在前述电解液中建立三电极系统，采用循环伏安法在-0.2V～0.8V的扫描电位和50mV·s^-1的扫描速率条件下进行电聚合，共进行5个循环，使基体电极的感应端上包覆一层1，5-萘二胺聚合物膜。

(3)碳纳米管-刚果红溶液的配制：称取0.50g多壁碳纳米管(MCNT)粉末，用2.6M的硝酸溶液回流6h，再置于2M的盐酸中浸泡12h，使多壁碳纳米管酸化并修饰上羧基；然后用超纯水反复清洗除去多余的酸液，3000rpm离心三次，每次5min，去除上清液后60℃真空干燥4h，称重。将酸化后的多壁碳纳米管与刚果红(即CR)按5∶1的质量比放入研钵中研磨2h，使二者充分混合，研磨过程中为防止干燥的刚果红粉末结块，需要加入少量超纯水；当研磨至结合物略带绿色时，立即将其置于离心管中，并溶于一定量的超纯水，同时盖紧管盖用力震荡混匀；最后将混合液置于1000rpm的条件下离心15min，收集上层黑色溶液，即得到多壁碳纳米管-刚果红溶液(即MCNT-CR)，经过测量可知，该多壁碳纳米管-刚果红结合物的溶解度为3.2mg/mL。

(4)修饰碳纳米管：向上述配制好的碳纳米管-刚果红溶液中滴加一定量的活化剂以活化氨基和羧基，活化剂为EDC溶液和NHS溶液，充分混匀后使得EDC和NHS的终浓度分别为5mM和10mM；用微量移液器取5μL添加了活化剂的碳纳米管-刚果红溶液，并滴于上述1，5-萘二胺聚合物膜表面，室温下自然干燥后在1，5-萘二胺聚合物膜上形成多壁碳纳米管-刚果红结合物层。

(5)电沉积纳米金：将上述修饰有碳纳米管-刚果红结合物层的玻碳电极用超纯水快速浸洗三次，以除去未结合的物质，干燥后以其作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，将此三电极系统置于质量分数为0.1％的氯金酸(HAuCl₄)溶液中进行电化学沉积，采用循环伏安法在0V～0.9V的扫描电位和10mV·s^-1的扫描速率条件下进行电沉积，共进行3个循环，得到基于芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金的复合膜修饰的生物传感器。

通过电子显微镜扫描仪(Hitachi S-4800)对本实施例生物传感器制备过程中的碳纳米管和纳米金颗粒在不同修饰阶段的形态进行表征，结果如图2所示。由图2的A图和B图可见，酸处理后的多壁碳纳米管管径更小，排列更加紧密，比表面积相应增大；由图2的C图可见，经过MCNT-CR修饰后的基体电极表面能明显看到刚果红颗粒较均匀地分布于多壁碳纳米管之间，其有利于纳米金颗粒的后续沉积；由图2的D图可见，沉积在基体电极表面的纳米金颗粒粒径约为50nm～100nm，且颗粒均匀较致密，明显增大了与后续核酸探针结合的比表面积，同时能更好的保持其生物活性。

实施例2：

一种如图3所示的本发明的复合膜修饰的生物传感器在检测木质素降解酶(本实施例具体是检测纤维二糖脱氢酶CDH)编码基因中的应用，具体包括以下步骤：

(1)设计探针序列、目标链及PCR扩增引物：在GenBank中选出黄孢原毛平革菌产生的CDH对应的全部编码基因序列，运用DNAMAN软件以及NCBI的BLAST服务器进行序列比对，确定出CDH对应的编码基因序列的保守区域，然后用Primer Premier 5.0及Oligo 6.0两个软件对编码CDH的功能基因进行捕获探针、响应探针、目标链、错配链以及PCR引物的设计，所有的基因序列均由上海生工生物工程公司合成。设计结果见下表1：

表1：针对CDH编码基因设计的探针序列、目标链、错配链及PCR引物

在设计的捕获探针5’端修饰有巯基，在设计的响应探针3’端修饰有生物素；

(2)捕获探针的固定：在捕获探针5’端修饰巯基后，用微量移液器取浓度为20μM的捕获探针溶液6μL滴加到实施例1所制备的生物传感器的感应端进行自组装，4℃下恒温自组装12h，自组装完成后依次用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、超纯水浸洗，以除去未组装的捕获探针。

(3)封闭剩余结合位点：将上述固定有捕获探针的生物传感器感应端浸入到400μL 1mM的巯基己醇中，室温(20℃±5℃)下对感应端表面剩余的结合位点进行封闭，封闭完成后依次用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、0.1M NaCl(pH 8.0)、超纯水浸洗。

(4)一次杂交：用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.98)配制成含上述目标链浓度为1.0×10^-9～1.0×10^-17M的混合待测杂交液，然后将上述封闭后的生物传感器的感应端浸入到400μL的混合待测杂交液中于37℃下杂交反应1h，杂交完成后用Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)、超纯水依次浸洗并干燥感应端表面。

(5)修饰响应探针：将上述一次杂交反应后的生物传感器感应端置于400μL浓度为1μM的响应探针溶液中，37℃下二次杂交反应1h，再用Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)、超纯水依次浸洗并干燥感应端表面。

(6)酶催化反应：将上述二次杂交反应后的生物传感器感应端浸入400μL浓度为2μg/mL的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液(HRP-SA)中，37℃下酶标记反应30min，再用Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)、超纯水依次浸洗并干燥感应端表面。

(7)电化学测定：采用电化学分析仪(上海辰华仪器公司，CHI660B)对上述生物传感器的各项性能及目标链浓度进行检测，用交流阻抗法、循环伏安法以及计时电流法来进行表征和分析：

交流阻抗法的表征和分析：分别将未经修饰的裸玻碳电极和不同程度的修饰电极在5.0mM Fe(CN)₆ ^3-溶液中，频率在0.01HZ～100k HZ范围内进行交流阻抗法扫描，结果如图4所示；由图4可见，表征裸GC电极的曲线在高频部分显示了一定的圆弧，说明裸GC电极对电极表面的电子传输有一定的阻碍作用；表征MCNTs/GC电极的曲线在高频部分的圆弧较裸GC电极明显减小，说明修饰了碳纳米管后电极表面的电子传输阻碍作用减少；而nano-Au/MCNTs/GC电极的阻抗图近似一条直线，表明nano-Au/MCNTs/GC上的阻抗很小，其感应端不会阻挡Fe(CN)₆ ^3-中氧化还原电子传递；固定DNA后的dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极表面，阻抗值显著增大，这是因为发生氧化还原的电子受到了DNA表面上负电荷的阻碍排斥作用。

循环伏安法的表征和分析：分别将未经修饰的裸玻碳电极和不同程度的修饰电极在5.0mM Fe(CN)₆ ^3-溶液中进行循环伏安法(CV)扫描，得到的曲线如图5所示。与裸GC电极的峰电流相比，nano-Au/GC电极的峰电流增大，而nano-Au/MCNTs/GC电极的峰电流增值较nano-Au/GC电极更明显，说明修饰两层纳米材料的生物传感器比只修饰单层纳米金的nano-Au/GC电极传导率更高，这是由于纳米金颗粒沉积在碳纳米管上比直接沉积在裸GC电极上的有效比表面积更大，从而提高了电子的转移速率；Fe(CN)₆ ^3-在固定DNA后的dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极表面的电子转移速率下降，阻碍了其向电极表面进一步扩散，使得其氧化还原峰电流差值显著减小。

循环伏安法的表征和分析：分别将未经修饰的裸玻碳电极和不同程度的修饰电极在1/15M PB(pH 6.98)的电解液中，扫描电位在-0.8V～0.8V范围内、扫描速度为100mV/s的条件下进行循环伏安法扫描，扫描结果如图6所示。由图6可见，裸GC电极在PB溶液中进行CV扫描，得到一条扁平偏“瘦”的曲线，没有任何峰的出现；电极表面经复合膜修饰及DNA杂交后，仍在PB溶液中进行CV扫描，出现一条比裸GC电极的CV曲线稍“胖”的闭合曲线，没有明显的峰出现；当在PB溶液中加入100μL0.1M对苯二酚和50μL0.1M过氧化氢后，用CV法继续扫描固定DNA后的dsDNA/nano-Au/MCNTs/GC电极，则出现一条有明显氧化还原峰的闭合曲线，这是由于对苯二酚在过氧化氢存在的条件下，经响应探针上修饰的辣根过氧化物氧化酶(HRP)的催化发生氧化还原反应，并生成了对苯二醌，这充分说明目标链和响应探针通过核酸杂交已成功固定在实施例1制备的生物传感器上。

计时电流法的表征和分析：采用计时电流法(i-t)对木质素降解酶功能基因的浓度进行定量分析。以图3所示的经两次杂交并进行酶标记后的生物传感器作为工作电极，以10mL1/15M PB(pH 6.98)为电解液，加入100μL0.1M对苯二酚混合均匀，还原电位在-0.08V～-0.04V条件下进行计时电流法扫描，待电流稳定后加入50μL 0.1M的过氧化氢，发现电流产生明显变化。通过改变编码CDH功能基因的浓度大小，我们发现产生的电流变化值(下简称电流值)I与编码CDH功能基因浓度C的常用对数值成线性关系，线性回归图如图7所示。使用本发明的生物传感器对不同浓度的编码CDH的功能基因进行测定，用辣根过氧化物酶产生的电流信号进行表征后，得出的定量分析结果如下：

电流值I与编码CDH的功能基因浓度C的线性关系可用以下线性回归方程表示：

I＝1.16851g(C)+3.6966

其中I的单位为μA，C的单位为10^-12M，该线性回归方程应用的线性检测范围为1.0×10^-15～1.0×10^-10M，相关系数r²为0.9957，检测下限为1.0×10^-16M。

特异性测试：

在本实施例的其他工艺条件、参数和步骤均不变的情况下，用计时电流法测定与目标链浓度为2.0×10^-10M的待测杂交液杂交后的电流值；另将目标链基因序列替换成浓度为2.0×10^-10M的两碱基错配链(见表1中的错配链)，同样用计时电流法测定其电流响应值，两种情形下的测定结果如图8所示。由图8可以看出，在相同浓度、相同条件下，两碱基错配序列得到的电流值明显低于完全互补序列的电流值，这是由于与碱基错配序列进行杂交会破坏共价π键，造成碱基堆积的混乱，从而降低了电子的传递效率。由此可见，本实施例1制备的基于芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金复合膜修饰的生物传感器对CDH编码基因的检测有着良好的选择性。

灵敏度测试：

取表面状况基本一致的两根玻碳电极，其中一根玻碳电极直接电化学沉积纳米金颗粒，另一根玻碳电极为按照本实施例1制备得到的生物传感器。两电极在相同条件下进行DNA的杂交(目标链浓度均为2×10^-13M)及酶标记过程，其计时电流扫描图如图9所示。由9图可知，本实施例1制备的复合膜修饰的生物传感器产生的电化学响应明显高于单层纳米金直接修饰的nano-Au/GC电极产生的电化学响应。由此可见，采用芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金复合膜修饰的生物传感器能得到更高的灵敏度和更低的检测下限。

重复性测试：

用实施例1制备的生物传感器对浓度为1.0×10^-10M、1.0×10^-11M和1.0×10^-12M的目标链杂交后连续三次测定其电流响应值，其相对标准偏差平均值(RSD)为3.07％，可见实施例1制备的生物传感器重复性较好。

稳定性测试：

在潮湿条件下，将实施例1制备的生物传感器置于4℃下存放15d，再按照本实施例的检测方法和步骤对浓度为5.0×10^-12M的目标链杂交液进行检测，电流值仍可达到初始电流值的84.12％，这说明实施例1制备的生物传感器具有良好的稳定性和使用寿命。

实施例3：

本发明的实施例3中接种并培养产木质素降解酶的菌种黄孢原毛平革菌，然后提取其总DNA，通过一对特异性扩增引物对含目标链基因的较短片段进行PCR扩增，其产物作为待测的目标链基因，然后应用实施例1的生物传感器和实施例2的具体方法考察本发明对实际培养品检测的特异性及灵敏度。

本实施例的复合膜修饰的生物传感器在含木质素降解酶编码基因的培养品检测中的应用，具体包括以下步骤：

(1)黄孢原毛平革菌的固态培养：配PDA培养基：土豆20g，葡萄糖2g，琼脂2g和蒸馏水100mL；将以上各组分充分溶解，120℃高压灭菌20min，倒平板三个，在无菌操作台下划线接种黄孢，30℃恒温培养7d。

(2)黄孢原毛平革菌孢子的液态培养：配液态土豆培养基：土豆40g，葡萄糖4g和蒸馏水200mL；将以上各组分充分溶解，分别装入两个250mL锥形瓶中，120℃高压灭菌20min，将步骤(1)中培养的固态黄孢孢子粉接种于两个锥形瓶中，转速200rpm，30℃振荡培养4d，得到黄孢液态培养的孢子；再将得到的孢子分别用超纯水、PBS(pH 6.98)、TE缓冲液(pH 8.0)以8000rpm速度离心清洗10min，弃上清液；将清洗后的孢子用滤纸吸干表面水分后，冷冻干燥4h，得到干燥的黄孢孢子菌丝体。

(3)样品提取及纯化：称取0.1g干燥后的菌丝体于研钵中，加入少量液氮迅速研磨，待样品变软后再加少量液氮研磨，如此三次；用酵母基因组DNA小量提取和DNA纯化试剂盒(上海莱枫生物公司)对样品进行提取及纯化，纯化后的DNA作为PCR反应中的模板DNA；将纯化后的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为0.7％，工作电压为120V，电泳时间为25min。以λDNA/Hind III(天根生化科技)作为DNA分子量标准，纯化后总DNA为23130bp，结果如图10中(a)所示。

(4)PCR反应液配制：在冰上将以下各成分加入PCR反应管(25μL体系)：

模板DNA 1μL，

上游引物(见上表1)5μM，1μL，

下游引物(见上表1)5μM，1μL，

PCR预混合液(上海莱枫生物公司)12.5μL，

超纯水9.5μL；

手指轻弹PCR反应管使之充分混匀，简短离心。

(5)PCR反应：反应条件为：①94℃，3min——②94℃，30s——③48℃，30s——④72℃，1min——⑤72℃，5min——⑥4℃，∞；其中，②～④步反应进行30个循环。

(6)琼脂糖凝胶电泳分析：将PCR扩增后长度为309bp的DNA产物用浓度为2.5％的琼脂糖进行电泳，工作电压为120V，电泳时间为25min；以Marker I(天根生化科技)作为DNA分子量标准，结果如图10(b)所示，此PCR产物即为CDH目标链基因序列，长度为309bp。

(7)检测分析：用本发明实施例1制得的生物传感器和实施例2的应用方法，对本实施例制得的未知浓度的经PCR扩增后的CDH目标链基因序列进行检测，根据实施例2中测得的线性回归方程可测定出本实施例培养品中的目标链的浓度值，并将其与传统的紫外分光光度法测定的浓度值进行比较，结果如下表2所示。

表2：本发明的生物传感器法和紫外分光光度法检测效果对比

紫外分光光度法(pM)	生物传感器法(pM)	回收率(％)
			1.35	1.22	90.37
6.72	7.06	105.06
			17.28	16.09	93.11
25.96	27.53	106.05
			34.18	32.75	95.82

45.63	43.51	95.35
			53.42	55.83	104.51
60.92	64.74	106.27
			78.81	73.85	93.71
86.73	81.68	94.18

由上表2可见，本发明研制的生物传感器对编码木质素降解酶CDH的功能基因的测定是准确有效的。本发明实施例1制备的基于芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金复合膜修饰的生物传感器是一种较为理想的生物活性物质检测装置，有望应用于生命科学、临床医学及环境污染控制领域中的实时、在线监测。

上述各实施例通过设计出黄孢原毛平革菌内编码纤维二糖脱氢酶的功能基因探针，运用本发明方法制备相应的生物传感器对靶基因序列进行特异性检测；同时设计一对特异性PCR引物，通过纯培养得到黄孢原毛平革菌的孢子并提取其总DNA，用上述设计的引物进行PCR扩增后得到的目标链基因的培养品，再用本发明的生物传感器对实际的培养品进行检测，以考察该生物传感器的灵敏度、特异性及稳定性等性能。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

<110>湖南大学

<120>复合膜修饰的生物传感器及其制备方法和应用

<160>6

<210>1

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgtcaaagtg gcagttcccg t                                           21

<210>2

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cagcgagtgg aggaaacaa                                              19

<210>3

<211>71bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttgtttcctc cactcgctgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt acgggaactg  60

ccactttgac a                                                       71

<210>4

<211>71bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttgtttcctc cactcactgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt acgggaactg  60

ccactttgat a                                                       71

<210>5

<211>17bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

attgtttcct ccactcg                                                  17

<210>6

<211>17bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccgccattgt tccactc                                                  17

Claims (10)

1.一种复合膜修饰的生物传感器，所述生物传感器包括有一基体电极，其特征在于：所述基体电极的感应端包覆有一芳香族二胺聚合物膜，所述芳香族二胺聚合物膜上修饰有碳纳米管-刚果红结合物层，所述碳纳米管-刚果红结合物层上吸附有纳米金颗粒层。

2.根据权利要求1所述的复合膜修饰的生物传感器，其特征在于：所述基体电极为玻碳电极、金电极或铂电极。

3.根据权利要求1或2所述的复合膜修饰的生物传感器，其特征在于：所述芳香族二胺聚合物为1，5-萘二胺、1，8-萘二胺或对二氨基联苯。

4.一种如权利要求1～3中任一项所述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)材料准备：准备一经过预处理的基体电极，并配制碳纳米管-刚果红溶液和氯金酸溶液；

(2)电聚合芳香族二胺单体：以所述的基体电极作为工作电极，在添加有芳香族二胺单体的电解液中建立三电极系统，通过控制扫描电位和扫描速率将芳香族二胺单体电聚合至所述基体电极的感应端，形成所述的芳香族二胺聚合物膜；

(3)修饰碳纳米管：向配制好的碳纳米管-刚果红溶液中滴加活化剂，再向所述芳香族二胺聚合物膜上滴涂添加了活化剂的碳纳米管-刚果红溶液，自然晾干后在所述芳香族二胺聚合物膜上形成碳纳米管-刚果红结合物层；

(4)电沉积纳米金：以上述修饰有碳纳米管-刚果红结合物层的基体电极作为工作电极，以氯金酸溶液作为电解液，并建立三电极系统，通过控制扫描电位和扫描速率在碳纳米管-刚果红结合物层上电沉积纳米金颗粒，得到基于芳香族二胺聚合物-碳纳米管-纳米金的复合膜修饰的生物传感器。

5.根据权利要求4所述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电聚合芳香族二胺单体步骤中，所述电解液为0.1M～0.2M的HCl溶液，所述芳香族二胺单体在电解液中的浓度为10mM～15mM。

6.根据权利要求4或5所述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电聚合芳香族二胺单体步骤中，所述扫描电位控制在-0.2V～0.8V，所述扫描速率控制在40mV.s^-1～60mV.s^-1。

7.根据权利要求4所述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述修饰碳纳米管步骤中，所述碳纳米管-刚果红溶液的浓度为3.0mg/mL～4.0mg/mL，滴加量为4μL～6μL；所述活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度分别为3mM～5mM和8mM～10mM。

8.根据权利要求4所述的复合膜修饰的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电沉积纳米金步骤中，所述氯金酸溶液的质量分数为0.1％～0.2％，所述扫描电位控制在0V～0.9V，所述扫描速率控制在10mV·s^-1～15mV·s^-1。

9.一种如权利要求1～3中任一项所述的复合膜修饰的生物传感器在检测目标基因中的应用，具体包括以下步骤：

(1)设计探针：根据目标基因的序列，利用现有的设计软件设计目标基因的捕获探针和响应探针；

(2)修饰捕获探针：在所述捕获探针5’端修饰巯基，并将修饰有巯基的捕获探针滴加到所述复合膜修饰的生物传感器的感应端进行自组装，然后用巯基己醇封闭剩余的结合位点；

(3)一次杂交：再将修饰捕获探针后的生物传感器浸入到待测杂交液中，通过碱基互补配对进行一次杂交；

(4)修饰响应探针：在所述响应探针3’端修饰生物素，并将一次杂交后的生物传感器浸入到修饰有生物素的响应探针溶液中，使其通过碱基互补配对进行二次杂交；

(5)酶催化反应：将二次杂交后的生物传感器浸入到酶标后的链霉亲和素溶液中，通过酶与其底物的催化反应使杂交信号放大，最后根据杂交信号的大小判断待测杂交液中是否含有目标基因及目标基因的浓度大小。

10.根据权利要求9所述的复合膜修饰的生物传感器在检测目标基因中的应用，其特征在于：所述目标基因为木质素降解酶编码基因；所述的木质素降解酶为纤维二糖脱氢酶；

所述目标基因的目标链序列为：5’-TTGTTTCCTC CACTCGCTGT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTT ACGGGAACTG CCACTTTGAC A-3’；

所述目标基因的捕获探针序列为：5’-TGTCAAAGTG GCAGTTCCCG T-3’；

所述目标基因的响应探针序列为：5’-CAGCGAGTGG AGGAAACAA-3’；

所述酶为辣根过氧化物酶；所述底物为对苯二酚和过氧化氢溶液。

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