CN103842815A - 全细胞细菌生物电容器芯片和用该芯片检测毒性化学物质诱导的细胞应激的方法 - Google Patents

全细胞细菌生物电容器芯片和用该芯片检测毒性化学物质诱导的细胞应激的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用细菌检测毒性化学物质的方法和生物电容器感测装置。感测平台包括具有限定几何结构的金叉指电容器，固定有作为感测成分的活大肠杆菌细胞的羧基-CNT层。还包括制造生物电容器装置的方法和检测诱导细胞应激响应的毒性化学物质的方法。本发明公开对固定有羧基-CNT结合的大肠杆菌的生物电容器芯片的开发。另外，本发明还包括用包括频率和/或幅度作为控制参数的电场确定生物芯片上化学刺激细菌的行为和特征。

Description

全细胞细菌生物电容器芯片和用该芯片检测毒性化学物质诱导的细胞应激的方法
相关申请交叉引用
本申请要求2011年5月17日提交的美国临时申请61/487,225号和2011年5月20日提交的美国临时申请61/488,693号的优先权，各申请出于所有目的通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明总体上涉及全细胞细菌生物电容器芯片技术的开发。更具体地讲，涉及测定在细菌-电容器界面的毒性化学物质诱导的细胞应激的方法和全细胞大肠杆菌生物电容器芯片装置。
背景
微生物，例如细菌，可作为生物感测成分用于测定多种化学物质的毒性性质。感测化学物质对细菌细胞的毒性性质使得能够预测化学物质在包括人的其它存活物种中诱导毒性的潜力。大部分化学物质对活细胞为毒性性质。这些可在混合物中筛选和预测。来自医药制剂、药物、防御剂、受污染的环境和食品样品的化学物质一般通过诱导细胞损伤呈现有害的作用，例如氧化性的、基因毒性的和代谢的应激，因此，对活生物体有害。
一般已知利用活细胞，当其暴露时，潜在允许评估毒理学风险并测定化学物质的毒性性质。细菌细胞可以是作为生物识别成分的理想选择，因为已知它们响应外部应激(刺激)，例如通过导致改变细胞动力学(包括代谢、生长和细胞表面电荷分布)的毒性化学物质。可用这些响应预测化学物质的毒性。通常在不同的应激响应方面确定细菌细胞的毒性响应。一般地，根据用于诱导毒性的化合物的性质，细菌中的应激响应分成不同类型。例如，通过不同模式诱导各种细胞毒性响应的化学物质，例如通过(i)由以下化学物质诱导的代谢/酸毒性：例如乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐和影响阴离子细胞内积累的药物；(ii)由产生反应性氧物类(ROS)的以下化学物质诱导的氧化毒性：例如H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)和氧化氮(NO)；和(iii)由以下高浓度溶质诱导的渗透应激：包括高水平NaCl、经受渗透应激的细胞的细胞溶质中的渗透质，例如通过肉碱、海藻糖(trihalose)、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇和甘油-甜菜碱以及诱导基因毒性应激和各种细胞应激响应的其它化学物质。
有多种探测和检测毒物的毒性或细胞杀灭性质的已知方法。常规方法跟踪细胞代谢速率(例如，四唑鎓盐分解)和细胞质酶(例如，乳酸脱氢酶)的活性。中性红吸收测定(NR)和总细胞蛋白测定也是试验毒性的两种主要方法。其它细胞毒性方法包括通过硅微量生理测定仪检测培养细胞附近的pH变化和检测细胞层在暴露于试验化合物时的屏障功能(跨细胞电阻)。
虽然以上方法为显示定量检测的非侵害方法，但共同的限制是它们需要在培养基中膜插入物或悬浮体上生长的细胞层。这些技术一般不适合试验毒性气体(防御剂)，并且要在上面试验毒性化学物质的活细胞被牺牲或者需要在试验期间一直存在营养培养基。
其它方法包括通过细胞和视频成像分析研究细胞毒性。然而，这些不利地要求大量的数据处理，并且只提供半定量结果。市售可得的基于微生物的毒性筛选方法的一个实例可按名称Microtox®得到，这种方法用发光细菌检测毒物作用。这些技术可能更易受使发光显现的物理因素影响，例如热、分压和pH，且一般不适合试验毒性气体(防御剂)，并且这些也需要依赖表达发光基因产物的细菌细胞和发光计。
另一个实例包括利用Applied BioPhysics Inc.(ABP)(其生产Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)仪器)制造的市售可得的实验室仪器的方法。这种方法用通过培养基“连接”的电极和对电极测量阻抗响应。利用此类型系统有主要缺点，因为一般已知培养基或任何其它液体培养基改变细胞的行为响应。在这些情况下，可能难以区分在该背景下化学试剂诱导的响应与营养培养基中存在的其它化学物质的复杂混合物的响应。一般地，为了获得细胞响应，ABP的ECIS需要存在培养基/液体培养基，这可干扰营养混合物中靶化学物质的实际响应。
因此，虽然这些前述方法可用，但它们经常不利地不能在没有任何干扰性介质(例如培养基/液体培养基)存在下，通过监测由毒性化学物质(包括气体)特异诱导导致的细胞表面上的损伤，检测对活细胞的毒性。
目前，需要能够检测和探测化学物质的毒性和这些化学物质对人的影响的方法和装置。另外，有利的是，用这些方法和装置筛选各种化学物质、毒性气体、药物、药品、防御剂、环境和食品样品，用于测定化学物质产生细胞毒性的潜力。另外，这些方法和装置成本有效，具有高灵敏度和选择性，并且具有快响应。这些方法和装置将大量应用于医学和临床诊断、环境监测、食品工业、防御和保护，并且可应用于很多其它诊断、生物技术和科学用途。
概述
本发明涉及满足这些需要的高精度测定在细菌-电容器界面由毒性化学物质诱导的细胞应激的方法和装置。本发明的方法和装置可用于测定在细菌-电容器界面由毒性化学物质诱导的细胞应激。
本发明涉及一种用于检测靶化学物质的生物电容器感测装置，所述感测装置包括：电容器，所述电容器包括基片和在基片上的金属沉积层；羧化碳纳米管(羧基-CNT)层；和活细胞，其中活细胞固定到碳纳米管(CNT)层上。活细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，并且可不带有干扰性营养/培养基，针对靶化学物质对活细胞施加的应激来监测活细胞。
基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。优选基片为硅。
基片上的金属沉积层包括至少一个电极。电极为选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)的材料。更优选电极为金。
优选电容器为金叉指电容器。
碳纳米管层可以为羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)。
活细胞可选自哺乳动物细胞、细菌细胞和特异功能组织细胞。优选活细胞为细菌细胞。细菌细胞可以为任何细菌细胞株，包括大肠杆菌DH5α、K-12、沙门氏菌、假单胞菌和芽孢杆菌种。优选细菌细胞为大肠杆菌。
靶化学物质可选自乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐、影响阴离子细胞内积累的药物；由产生反应性氧物类(ROS)、H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)、氧化氮(NO)的化学物质诱导的氧化毒性；由高浓度溶质、NaCl、细胞的细胞溶质中的渗透质诱导的渗透应激；肉碱、海藻糖、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇、甘油-甜菜碱和诱导基因毒性应激的其它化学物质。
本发明涉及一种用于检测靶化学物质的生物电容器感测装置，所述感测装置包括：金叉指电容器，所述电容器包括基片和在基片上的金叉指层；羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)层；和活细菌细胞，其中活细菌细胞固定到碳纳米管(CNT)层上，其中活细菌细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，其中可在干燥条件下，不带有其它干扰性液体营养/培养基，针对靶化学物质对活细菌细胞施加的应激来监测活细菌细胞。
本发明涉及一种检测试样中关注的靶化学物质的存在、测定试样中关注的靶化学物质的量或鉴定试样中关注的靶化学物质的方法，其中该方法用生物电容器感测装置表征。
本发明涉及定量检测关注的靶化学物质的方法，所述方法包括以下步骤：使试样暴露于生物电容器装置，其中试样包含关注的靶化学物质，其中试样能够对生物电容器装置诱导细胞应激响应；对生物电容器装置施加具有交流(AC)频率的电势曲线；通过非法拉第电化学阻抗谱(nFEIS)检测生物电容器装置的表面阻抗/电容变化，监测来自生物电容器装置的细胞应激响应，其中没有营养/培养基干扰，细胞响应与关注的靶化学物质的存在相关。生物电容器装置可具有在装置上存在的细胞，并且试样能够对生物电容器装置上存在的细胞诱导细胞应激响应。
靶化学物质可以为应激剂，选自乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐、影响阴离子细胞内积累的药物；由产生反应性氧物类(ROS)、H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)、氧化氮(NO)的化学物质诱导的氧化毒性；由高浓度溶质、NaCl、细胞的细胞溶质中的渗透质诱导的渗透应激；肉碱、海藻糖、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇、甘油-甜菜碱和诱导基因毒性应激的其它化学物质。
本发明涉及一种定量检测关注的靶化学物质的方法，所述方法包括以下步骤：使试样暴露于生物电容器装置的方法，其中试样包含关注的靶化学物质，其中试样能够对生物电容器装置诱导细胞应激响应；对生物电容器装置施加具有交流(AC)频率的电势曲线；在没有干扰性培养基的情况下，通过nFEIS检测生物电容器装置的表面阻抗/电容变化，监测生物电容器装置的细胞应激响应，其中细胞响应与关注的靶化学物质的存在相关。
一种制造生物电容器感测装置的方法，所述方法包括以下步骤：提供基片；在基片上沉积金属层，以形成电容器，其中金属层包括至少一个电极；使金属层在二氧化硅基片上图案化为叉指形，制造电容器；使羧化碳纳米管(羧基-CNT)层结合到电容器上，以形成羧基-CNT活化的电容器；使活细胞固定到羧基-CNT活化的电容器上，其中活细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，其中可在干扰性培养/营养基不存在下针对靶化学物质对活细胞施加的应激来监测活细胞。
基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。优选基片为硅。
电极为选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)的材料。优选电极为金。电容器为金叉指电容器。
碳纳米管层为羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)。
活细胞可选自哺乳动物细胞、细菌细胞和特异功能组织细胞。优选活细胞为细菌细胞，包括大肠杆菌、K-12、沙门氏菌、假单胞菌和芽孢杆菌种。更优选细菌细胞为大肠杆菌。
在本文剩余部分中使本发明的这些特征、优点和其它实施方案对本领域的普通技术人员变得显而易见。
附图简述
参考以下说明、附带的权利要求和附图，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，其中：
图1图示说明根据本发明的实施方案带有羧基-CNT官能化的金叉指电极电容器芯片的活化的示例性示意图。
图2图示说明根据本发明的实施方案使羧基-CNT活化金叉指(GID)电容器芯片的生物官能化和固定大肠杆菌细胞以开发生物芯片的示例性示意图。
图3图示说明根据本发明实施方案的以下轻敲模式AFM图像(在4.2×4.2µm2扫描面积内)：(a)裸GID表面；(b)在裸GID表面的轻敲模式AFM高度图像中所选绿线区域(1μm长度)的线绘表面轮廓；(c)裸GID表面的3D AFM形貌图；(d)用羧基-CNT活化的GID表面的轻敲模式AFM高度图像；(e)在用羧基-CNT活化的电容器表面上GID电极的轻敲模式AFM高度图像中所选绿线区域(1μm长度)的线绘表面轮廓；(f)羧基-CNT活化的GID表面的3D AFM形貌图 ；和(g)显示固定的大肠杆菌细胞的生物芯片截面(扫描面积4.2µm2)的2D轻敲模式AFM图像。
图4图示说明根据本发明的实施方案在羧基-CNT固定之前和之后金叉指电容器芯片的示例性电容响应。
图5图示说明以下金叉指电容器表面的示例性光学显微相片：(I)用羧基-CNT活化(对照)和固定有(II)8.7×106个细胞和(III)1.7×107个细胞浓度的大肠杆菌的羧基-CNT活化芯片。这些行(a-c、d-f和g-i)分别显示本发明的实施方案的5X、10X和100X的光学分辨率。
图6图示说明在预先用羧基-CNT活化的GID表面上固定两种不同浓度大肠杆菌细胞的生物芯片的示例性电容响应。根据本发明的实施方案，在营养/培养基不存在下以50-600MHz频率扫描观察电容响应。
图7图示说明根据本发明的实施方案的以下示意性表示：(a)通过在具有限定几何结构和尺寸的各电容器的金叉指电极上结合羧基-CNT来固定活大肠杆菌细胞的电容器阵列生物芯片；和(b)显示在营养/培养基不存在下，在正常和化学应激条件中，在施加的AC频率下大肠杆菌的响应和表面电荷分布的图示。
图8图示说明，根据本发明在营养/培养基不存在下当暴露于不同浓度乙酸经历(a)1小时和(b)3小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。
图9图示说明，根据本发明在营养/培养基不存在下当暴露于不同浓度H2O2经历(a)1小时和(b)3小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。
图10图示说明，根据本发明在营养/培养基不存在下当暴露于不同浓度NaCl经历(a)1小时和(b)3小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。
图11图示说明，在营养/培养基不存在下在恒定AC电频率(350MHz)经历1和3小时处理时间，大肠杆菌细胞(固定在CNT活化的感测器芯片上)的响应作为不同浓度(a)乙酸(酸应激)、(b)H2O2(氧化应激)和(c)NaCl(盐应激)的函数。插表显示确定大肠杆菌细胞经历的应激水平的百分比相对变化的颜色编码值。应激颜色编码标度显示根据本发明的实施方案的应激水平的严重性，其中绿色表示适应/耐受，红色表示应激/毒性。
图12图示说明以下电容响应的示例性结果：只与羧基-CNT共价连接的裸GID表面(以黑色显示)；固定有活的8.7×106个细胞(红色)和1.74×107个细胞(蓝色)的生物芯片；以及在预先用羧基-CNT活化的GID表面上热杀灭的1.74×107个细胞(绿色)。根据本发明的一个实施方案，在营养/培养基不存在下在300-600MHz频率范围观察到电容响应。
图13图示说明根据本发明的实施方案由电荷云包围的典型细胞的示例性示意图，所述电荷云通过两个相等且相反、在外细胞表面上分隔距离“r”的单位电荷构成分子偶极“m”。
具体实施方案详述
根据本发明，为了检测化学物质造成的细胞应激，用羧基-CNT活化的固定有大肠杆菌细胞的金叉指(GID)电容器开发新的电容生物芯片。
根据一个实施方案，本发明描述开发用于测定在细菌-电容器界面由毒性化学物质诱导的细胞应激的全细胞大肠杆菌生物电容器芯片装置。开发的技术还描述与羧化碳纳米管(羧基-CNT)结合的固定有作为感测成分的活细菌细胞的电子金叉指电极(GID)电容器(生物电容器)的制造。所提出的新发明还描述用模型化学物质感测潜在毒性化学物质的生物电容器芯片的表面特征，例如，乙酸(CH3COOH)用于酸毒性，过氧化氢(H2O2)用于氧化毒性，氯化钠(NaCl)用于盐应激。生物电容器装置和检测方法基于非法拉第电化学阻抗谱(nFEIS)。所提出的发明/技术和其检测方法可用于筛选不同的化学物质、毒性气体、药物、药品、防御剂、环境和食品样品，用于测定化学物质产生细胞毒性的潜力。
根据一个实施方案，本发明涉及一种用于检测靶化学物质的生物电容器感测装置，所述感测装置包括：电容器，所述电容器包括基片和在基片上的金属沉积层；羧化碳纳米管(羧基-CNT)层；和活细胞，其中活细胞固定到碳纳米管(CNT)层。活细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，并且可在营养/培养基不存在下针对靶化学物质对活细胞施加的应激来监测活细胞。
一般地，基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。优选基片为硅。
基片上的金属沉积层包括叉指形式的至少一个电极。一般地，电极为选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)的材料。更优选电极为金。
根据本发明的实例实施方案，也可将以芯片形式制造的生物感测器称为生物芯片。生物电容器感测装置和生物芯片由始至终可互换使用。
优选电容器为金叉指电容器。优选生物电容器感测装置提供包括具有限定几何结构的金叉指电容器的感测平台。
根据本发明的一个实施方案，优选碳纳米管层为羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)。
根据本发明的另一个实施方案，活细胞可选自哺乳动物细胞、细菌细胞和特异功能组织细胞。优选活细胞为细菌细胞。细菌细胞可以为任何细菌细胞株，包括大肠杆菌DH5α、K-12、沙门氏菌、假单胞菌和芽孢杆菌种。优选细菌细胞为大肠杆菌。
在本发明的另一个优选实施方案中，细菌细胞可以是作为生物识别成分的理想选择，因为已知它们响应外部应激(刺激)，例如通过导致改变细胞动力学(包括代谢、生长和细胞表面电荷分布)的毒性化学物质。可用这些响应预测化学物质的毒性。通常在不同的应激响应方面确定细菌细胞的毒性响应。一般地，根据用于诱导毒性的化合物的性质，细菌中的应激响应分成不同类型。
根据本发明，靶化学物质一般为作为应激剂的化学物质，其可通过不同膜式诱导各种细胞毒性响应，例如通过(i)由以下化学物质诱导的代谢/酸毒性：例如乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐和影响阴离子细胞内积累的药物；(ii)由产生反应性氧物类(ROS)的以下化学物质诱导的氧化毒性：例如H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)和氧化氮(NO)；和(iii)由以下高浓度溶质诱导的渗透应激：包括高水平NaCl、经受渗透应激的细胞的细胞溶质中的渗透质，例如通过肉碱、海藻糖、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇和甘油-甜菜碱以及诱导基因毒性应激和各种细胞应激响应的其它化学物质。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于检测靶化学物质的生物电容器感测装置，所述感测装置包括：金叉指电容器，所述电容器包括基片和在基片上的金叉指层；羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)层；和活细菌细胞，其中活细菌细胞固定到碳纳米管(CNT)层上，其中活细菌细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，其中可在营养/培养基不存在下，针对靶化学物质对活细菌细胞施加的应激来监测活细菌细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种检测试样中关注的靶化学物质的存在、测定试样中关注的靶化学物质的量或鉴定试样中关注的靶化学物质的方法，其中该方法用生物电容器感测装置表征。
在另一个实施方案中，本发明涉及定量检测关注的靶化学物质的方法，所述方法包括以下步骤：使试样暴露于生物电容器装置，其中试样包含关注的靶化学物质，其中试样能够对生物电容器装置诱导细胞应激响应；对生物电容器装置施加具有交流(AC)频率的电势曲线；在没有干扰性营养/培养基的情况下，通过nFEIS检测生物电容器装置的表面阻抗/电容变化，监测来自生物电容器装置的细胞应激响应，其中细胞响应与关注的靶化学物质的存在相关。
本领域的技术人员熟知，可将阻抗生物芯片分成两类：非法拉第型和法拉第型。在此，非法拉第生物芯片一般被称为电容生物芯片或生物电容芯片，并且在通篇说明书可互换使用。
本领域的技术人员已知，在GHz频率的辐射对鼠嗜碱粒细胞白血病细胞的作用主要显示为热性质。因此，考虑这种作用，优选只用确保在电容测量期间不发生热效应的低于600MHz的施加AC电频率来监测大肠杆菌生物芯片感测器的应激响应。更优选以约50-约600MHz的频率扫描观察电容响应。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种定量检测关注的靶化学物质的方法，所述方法包括以下步骤：不带有干扰性营养/培养基，使试样暴露于生物电容器装置，其中试样包含关注的靶化学物质，其中试样能够对生物电容器装置诱导细胞应激响应；对生物电容器装置施加具有交流(AC)频率的电势曲线；通过nFEIS检测生物电容器装置的表面阻抗/电容变化，监测生物电容器装置的细胞应激响应，其中在干燥条件下不带有干扰性营养/培养基，细胞响应与关注的靶化学物质的存在相关。
根据本发明的优选实施方案，平面电容器阵列由叉指微电极制成，优选用羧化碳纳米管(CNT)预活化，与例如置于包含液体培养基的隔离培养容器中的电极对相反。
根据本发明的最优选实施方案，优选在没有任何营养/培养基存在下在干燥条件下进行电容器电极上存在的细菌的细胞活性的测量。一般已知培养基或任何其它液体培养基改变细胞的行为响应，因此使得难以区分在该背景下化学试剂诱导的响应与营养培养基中存在的其它化学物质的复杂混合物的响应。为了获得细胞响应，在本领域中的先前方法一般需要存在培养基/液体培养基，然而，这可能干扰营养混合物中靶化学物质的实际响应。
在本发明的另一个优选实施方案中，细菌细胞共价键合到电容器上存在的CNT上，与在分散体或悬浮体中生长或物理结合在电极上的细胞相反。
根据本发明，与“电阻变化”或“电压变化”相反，测量电容或频率变化，以探测细胞活性。
如果偶合到电子转换器，例如金叉指(GID)电容器(生物电容器)，活细菌细胞可通过由毒性化学物质在提供的细菌-电容器界面造成的细胞表面电荷分布和表面电容/阻抗来传送非侵害性细胞毒性信息，不存在干扰性液体营养/培养基。通常在不同的应激响应方面确定细菌细胞的毒性响应。根据诱导毒性的化合物的性质，细菌中的应激响应分成不同类型。例如，诱导氧化应激的化学物质(例如，产生反应性氧物类(ROS)的药物)和诱导渗透应激、基因毒性应激和其它细胞应激响应的其它物质。
细菌可在交流(AC)电场下响应不同的细胞应激，并且可在干燥条件(没有液体营养/培养基)通过非法拉第电化学阻抗谱(nFEIS)记录或监测细菌对外部应激的电响应变化。根据本发明的实施方案，通过在GID电极上结合活细菌细胞作为生物感测表面(生物芯片)来检测毒性化学物质的影响。在干扰性营养/培养基不存在和干燥下，毒性化学物质暴露于感测器表面上的细菌细胞时，细胞响应这些化学物质，并产生通过nFEIS相对于AC电频率扫描而测量的表面电荷分布变化。因此，在感测器/细菌表面上存在的总电荷极化并弛豫，这取决于具体频率。可监测感测器表面上细菌细胞对毒性/应激化学物质的响应变化。通过特定的表面化学性质也提高电容器感测器表面的灵敏度，包括用高反应性纳米材料改性，例如，碳纳米管(CNT)，因为CNT对于电化学感测中的宽范围应用具有独特的结构、电子和机械性质。
根据本发明的优选实施方案，公开一种检测化学物质对活细菌的毒性的新方法，以预测这些化学物质对人的影响，顺应避免使用人细胞的道德价值。根据实施方案，通过在与羧基-CNT结合的电子电容器芯片上简单地固定细菌细胞以增强信号，所提出的发明简化与用于检测化学物质诱导的毒性的先前可得技术相关的所有问题。在危险化学物质(例如，致癌化学物质(致癌物)、人造化学物质(异型生物质))快速短期暴露后的毒性检测或监测是简单地检测在电容器-细菌界面处在快速过程中表面电容/阻抗变化，而不实际伤害细胞。在本发明的优选实施方案中，生物电容器装置在数分钟内给出可疑化学物质的毒性信息，不需要液体营养/培养基，也顺应道德规范。这使生物电容器装置更优于传统毒性检测技术。另外，这种生物电容器装置有利地无标记，由于小尺寸和廉价因此是适合的。
本领域的技术人员已知，细菌可在AC电场下响应不同的细胞应激，并且可通过nFEIS记录或监测细菌对外部应激的电响应变化。这可通过在GID电极上结合活细菌细胞作为生物感测表面(生物芯片)而实现。在毒性化学物质暴露于感测器表面上的这些细菌细胞时，细胞响应这些化学物质，产生表面电荷分布，这可通过nFEIS相对于AC电频率扫描来检测。因此，在感测器表面上存在的总电荷极化并弛豫，这取决于具体频率。可监测感测器表面上细菌细胞对毒性/应激化学物质的响应变化。可通过各种表面化学性质提高感测器表面的灵敏度，包括用高反应性纳米材料改性，例如，碳纳米管(CNT)，因为它们具有独特的结构、电子和机械性质，使它们对于电化学感测中的宽范围应用是很有吸引力材料。近来，CNT已用作超级电容器的电极材料，也吸引更多的注意，因为其微观和宏观多孔结构、电化学性能、尺寸和表面积，这对于丰富反应位点是重要的，并且提供大电荷储存容量和电容。CNT在施加的AC电频率下在电极-纳米管界面处呈现空间电荷极化，并且由于快速充电/放电能力而具有优良的功率密度。
在本发明的优选实施方案中，测定化学物质毒性的新方法，即无标记和非侵害方法，利用羧基-CNT活化金叉指电容器，其固定有在GID电容器上活化的作为生物感测成分的大肠杆菌细菌，并且由于nFEIS而不需要任何介质参与。根据本发明的实施方案，一般通过利用与单壁CNT相比通常毒性较小的羧基官能化多壁CNT在电容器上共价活化，提高感测器表面的灵敏度。可在生物电容器的细菌-电容器界面快速检测毒性化学物质(例如，致癌化学物质(致癌物)和人造化学物质(异型生物质))的毒性性质。提出的检测方法基于nFEIS，nFEIS可用于筛选不同化学物质、毒性气体、药物、药品、防御剂、环境和食品样品，用于测定化学物质产生细胞毒性的潜力。
根据本发明的典型实施方案，方法和装置能够筛选不同化学物质、毒性气体、药物、药品、防御剂、环境和食品样品，用于测定化学物质产生细胞毒性的潜力。
根据本发明的一个实施方案，优选用乙酸、H2O2和NaCl作为模型化学物质试验生物芯片，并且它们的响应由nFEIS在AC电场下监测。以无标记和非侵害方式，根据作为施加频率(300-600MHz)的函数的表面电容变化，研究在不同应激下大肠杆菌细胞的电性质。在正常条件下大肠杆菌生物芯片的电容响应显示在463和582MHz频率处的特征分散峰。这些标志峰的变形确定在液体营养/培养基不存在下化学物质对电容生物芯片上大肠杆菌的毒性。大肠杆菌细胞对166-498mM(1-3%)乙酸灵敏，并且严重受其影响，伴有下降的电容响应。暴露于H2O2的大肠杆菌生物芯片在较低浓度(<2%)显示适应性响应，而在较高水平(882mM，3%)，由于细胞中的氧化毒性，电容响应下降。然而，大肠杆菌细胞不受高NaCl水平(513-684mM，3-4%)严重影响，因为细胞倾向于耐抗盐应激。我们的结果证明，生物芯片在特定频率响应能够确定化学物质施加的应激的严重性，并且可作为细胞毒性的指标潜在用于监测未知化学物质。
在本发明的另一个优选实施方案中，公开一种制造生物电容器感测装置的方法。所述方法包括以下步骤：提供基片；在基片上沉积金属层以形成电容器，其中金属层包括至少一个电极；使电容器上的金属层图案化；使羧化碳纳米管(羧基-CNT)层结合到电容器上，以形成羧基-CNT活化的电容器；使活细胞固定到羧基-CNT活化的电容器上，其中活细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，其中可针对靶化学物质对活细胞施加的应激来监测活细胞。
一般地，基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。优选基片为硅。
根据本发明的一个实施方案，电极一般为导电材料，例如，选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)的材料。优选电极为金。电容器为金叉指电容器。
碳纳米管层优选为羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)。
根据本发明的一个实施方案，活细胞一般可选自哺乳动物细胞、细菌细胞和特异功能组织细胞。优选活细胞为细菌细胞，包括大肠杆菌、沙门氏菌和K-12。更优选细菌细胞为大肠杆菌。
GID 阵列的图案化，电容器阵列的图案化和制造。根据本发明，基片可选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。GID阵列电极在SiO2基片表面上用负性光刻技术图案化。在此方法中，金属层应当用双色调光致抗蚀剂AZ5214E图案化。使2µm厚AZ5214E光致抗蚀剂图案化，借助于掩模，用于纯丙酮作为溶剂的剥离过程。在此步骤后，使很薄的50-60nm尺寸的钨层成层，以改进金通过DC溅射沉积在SiO2薄膜上的附着，并沉积约200-210nm厚的金层。各电极的尺寸应为800µm长、40µm宽，并且两个电极之间的距离为40µm。各电容器感测器在3mm2总面积内包含24叉指金电极。使用原子力显微法(AFM，Nanoscope)利用轻敲模式并通过光学显微照片进行表面表征。
在本发明的一个实施方案中，图1图示说明利用羧基-CNT官能化的金叉指电极电容器芯片的活化的示例性示意图。根据图1，显示了根据本发明的实施方案在GID电极电容器阵列上固定羧基-CNT的方法。
在 GID 电极电容器阵列上固定羧基 -CNT。使叉指金电极阵列电容芯片经受等离子清洗，用乙醇彻底清洗，并在N2气流下干燥。
可用于本发明的CNT不受特别限制，可以为市售可得产品，或者通过本领域的技术人员已知的任何常规方法来制备。一般地，CNT应在其表面和/或两端羧化以用于本发明。
本领域技术人员已知的关于在电容器芯片上共价固定羧基-CNT的任何方法都可使用，并且通过引用结合到本文中。
使裸GID电极电容器阵列芯片浸入1mM 95%半胱胺(Sigma-Aldrich)的乙醇溶液中经历24小时。移出芯片，用乙醇洗涤，并在N2气流下干燥。通过–SH基团在金表面上形成的半胱胺的自组装单层(SAM)包含用于共价结合羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)的游离-NH2基团。为此，将100µL在99.9%二甲亚砜(Sigma-Aldrich)中的1mg/mL羧基-CNT(Arry®，德国)与200mM 1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物等体积混合，并用每10秒间隔后10秒脉冲的交替循环超声处理5分钟，使用超声发生器探头(Vibra cell 75043)。在室温培育羧基-CNT悬浮体4小时。将约5µL这种悬浮体滴到各GID电极上，覆盖各电容器的3mm2面积，在SiO2片上预先用半胱胺自组装单层活化的电容器阵列中。然后，将电容器芯片在不透气湿室培育24小时，用于共价结合羧基-CNT。然后，先用水中的50% DMSO洗涤电容器阵列，随后用丙酮洗涤，以去除微量的未结合羧基-CNT，并经过N2气干燥。用没有羧基-CNT固定的电容器阵列作为对照用于比较。
在本发明的实施方案中，图2图示说明使羧基-CNT活化GID电容器芯片生物官能化和使大肠杆菌细胞固定以开发生物芯片的示例性示意图。就图2而言，显示了根据本发明的优选实施方案在羧基-CNT活化的GID电容器阵列上固定大肠杆菌细胞的方法。一般地，可根据本发明使用本领域技术人员已知的任何菌株。优选菌株为大肠杆菌DH5α。
在羧基 -CNT 活化的 GID 电容器阵列上固定大肠杆菌细胞的方法。将活性生长的大肠杆菌细胞接种到新鲜的Luria Bertani(LB)培养基，并允许生长到中对数生长期。然后，通过在1000×g离心3分钟采收细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS) pH 7.2洗涤三次，并使细胞重新悬浮于相同的缓冲剂中。通过系列稀释随后装到LB-琼脂板上后作菌落计数，测定细胞浓度。
将羧基-CNT活化的GID电容器阵列芯片首先在灭菌蒸馏水中清洗，用纯氮干燥，并用100mM EDC和50mM NHS的混合物培育2小时。然后移出芯片，彻底用蒸馏水洗涤，并用包含两种不同浓度8.7×106和1.74×107个菌落形成单位(CFU)的在PBS缓冲剂中的5µL细菌悬浮液分别培育2小时。在固定不同浓度细菌细胞后拍摄光学显微相片。
应激化学物质暴露到固定有大肠杆菌的 GID 电容器芯片 ( 生物芯片 ) 上。首先用PBS缓冲剂洗涤生物芯片，并在湿室中在37℃预培育1小时。对于一系列生物芯片电容器阵列，在用羧基-CNT预先活化并固定有大肠杆菌细胞的电容器阵列中，将5µL不同浓度的三种应激化学物质(例如，乙酸(0-498mM)、过氧化氢(0-882mM)和氯化钠(0-684mM))作为模型在各电容器上在37℃分别培育1小时和3小时。在此步骤后，将生物芯片用PBS缓冲剂pH 7.2洗涤，快速干燥，以去除细胞周围的缓冲剂和水分，在没有任何液体营养/培养基存在下直接监测细胞的响应。
阻抗 / 电容测量。在生物芯片表面上化学处理之前和之后，通过nFEIS测量阻抗/电容响应。首先，在每个步骤后依次测量电容/阻抗，所述步骤包括：(a)裸GID电容器(空白)；(b)在用羧基-CNT活化后；(c)在与大肠杆菌细胞生物结合后；和最终(d)生物芯片以不同时间暴露于不同浓度的不同应激化学物质后。
根据本发明的另一个优选实施方案，图3图示说明以下轻敲模式AFM图像(在4.2×4.2µm2扫描面积内)：(a)裸GID表面；(b)在裸GID表面的轻敲模式AFM高度图像中所选绿线区域(1μm长度)的线绘表面轮廓；(c)裸GID表面的3D AFM形貌图；(d)用羧基-CNT活化的GID表面的轻敲模式AFM高度图像；(e)在用羧基-CNT活化的电容器表面上GID电极的轻敲模式AFM高度图像中所选绿线区域(1μm长度)的线绘表面轮廓；(f)羧基-CNT活化的GID表面的3D AFM形貌图 ；和(g)显示固定的大肠杆菌细胞的生物芯片截面(扫描面积4.2µm2)的2D轻敲模式AFM图像。
用于对照，用仅PBS缓冲剂代替应激化学物质处理生物芯片(空白)，用包含热杀灭大肠杆菌细胞的生物芯片进行阴性对照试验。为此，使包含固定的大肠杆菌细胞(1.74×107)的生物芯片在不透气预热湿室在95℃下经受热处理5分钟，随后在-70℃快速冷冻5分钟，并在25℃解冻15min。重复以上处理过程三次，最后将生物芯片在N2气体下干燥。使用Network Analyzer(Karl-Suss PM-5 RF Probe Station和Agilent-8720ES)，在50MHz至1GHz频率范围内检测金叉指电极之间的电容响应。Network Analyzer用SOLT(短路-开路-负载-通路)方法校准。将阻抗值输出到MATLAB®软件用于分析。在有效频率(f)范围(300-600MHz)提取三次相同实验的绝对电容值，标准偏差显示为误差。
通过 AFM 图像和光学显微相片表征生物芯片感测器表面 。根据本发明的另一个优选实施方案，图4图示说明在羧基-CNT固定之前和之后金叉指电容器芯片的示例性电容响应。在羧基-CNT共价连接之前和之后GID电极电容器的表面形貌AFM图像显示于图3a-f中。裸GID电极表面显示具有不同直径(~100-200nm)尺寸的纳米颗粒分布(图1a和1b)。金纳米颗粒的AFM 3D高度图图像显示在扫描的4.2×4.2µm2 GID电极表面积内不同的高度(图1c)。AFM图像证明通过共价固定羧基-CNT活化的裸GID电极表面(图3d-f)。在GID表面上共价固定CNT后，确定羧基-CNT的直径为50-70nm(图3e)。羧基-CNT活化GID电极表面的AFM 3D高度图图像显示固定的羧基-CNT的分布和不同高度。裸GID电容器表面的响应微弱带电，而利用羧基-CNT的感测器表面活化转变成相当高带电的表面(图4)。然后，为了开发生物芯片，使活化的感测器表面经受生物官能化。
在本发明的另一个优选实施方案中，图5图示说明以下金叉指电容器表面的示例性光学显微相片：(I)用羧基-CNT活化(对照)和固定有(II)8.7×106个细胞和(III)1.7×107个细胞浓度的大肠杆菌的羧基-CNT活化芯片。这些行(a-c、d-f和g-i)分别显示5X、10X和100X的光学分辨率。
通过固定两种不同浓度大肠杆菌DH5α细胞(8.7×106和1.74×107CFU)，使羧基-CNT活化的GID电容器表面生物官能化。检验在大肠杆菌细胞固定之前和之后羧基-CNT活化电极表面的光学显微相片(图5a-i)。芯片的显微观察显示在GID表面上密集和共价固定的大肠杆菌细胞。还观察到在芯片SiO2表面上的非特异性吸附，即使在用PBS缓冲剂重复洗涤芯片后也保持一致。较高细胞浓度得到可与固定的较低细胞密度明显区别的密集固定的金电极表面(图5d-i)。显示固定的大肠杆菌细胞的生物芯片截面的2D AFM图像在图3g中给出。
在本发明的另一个实施方案中，图6图示说明在预先用羧基-CNT活化的GID表面上固定两种不同浓度大肠杆菌细胞的生物芯片的示例性电容响应。以50-600MHz频率扫描观察电容响应。活大肠杆菌细胞的电容响应作为扫描AC电频率(50MHz至1GHz)的函数测量，观察到电容响应依赖于细胞密度而增加(图6)。在低频率(50-200MHz)，电容响应较小依赖于细胞浓度，而在超出200MHz的施加频率下变得更加依赖于细胞浓度(图6)。另外，高于1.74×107CFU的较高细胞浓度显示在SiO2表面上更多的非特异性吸附。1.74×107CFU细胞浓度得到显著增强的响应，伴有在SiO2表面上最小的非特异性吸附，选择此浓度研究在AC电场下对不同应激的细胞响应。随着频率从50MHz增加到600MHz，电容减小。在先前的研究中，在GHz频率的辐射对鼠嗜碱粒细胞白血病细胞的作用主要显示为热性质。因此，仅用确保在电容测量期间不发生热效应的低于600MHz的施加AC电频率来监测大肠杆菌生物芯片感测器的应激响应。更优选以约50-约600MHz的频率扫描观察电容响应。
在本发明的另一个优选实施方案中，图7图示说明以下示意性表示：(a)通过在具有限定几何结构和尺寸的各电容器的金叉指电极上结合羧基-CNT来固定活大肠杆菌细胞的电容器阵列生物芯片；和(b)显示在正常和化学应激条件中，在施加的AC频率下大肠杆菌的响应和表面电荷分布的图示。图7图示说明下列的示意图：(a)通过在具有限定几何结构和尺寸的各电容器的金叉指电极上结合羧基-CNT用活大肠杆菌细胞固定的电容器阵列生物芯片；和(b)显示在正常和化学应激条件在施加的AC频率下大肠杆菌的响应和表面电荷分布的图解。
在培养基不存在下 ( 在干燥条件下 ) 在生物芯片表面上固定的大肠杆菌细胞对化学应激的电响应 。利用不同浓度的三种模型应激诱导性化学物质，例如乙酸(酸或代谢应激)、H2O2(氧化应激)和NaCl(盐应激)，经1和3小时处理固定有大肠杆菌细胞(1.74×107CFU)的羧基-CNT活化的电容器表面。洗涤经化学处理的生物芯片，并在测量电响应之前柔和干燥，以去除生物芯片上细胞周围的微量水分。这允许只考虑由细胞结合或吸收的化学物质。在施加300-600MHz的AC电频率扫描后，用nFEIS监测细胞对不同应激的电响应。在没有任何液体介质存在，只有化学-细胞相互作用的背景下分析细胞对不同应激的依赖于浓度和时间的响应。用诱导细胞应激响应的高于正常生理水平的模型化学物质浓度来试验生物芯片响应。在本发明的另一个优选实施方案中，图8图示说明根据本发明在暴露于不同浓度的乙酸(a)1小时和(b)3小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。图8a和b显示用试验化学物质培育的电容器生物芯片阵列和大肠杆菌细胞对毒性化学物质的响应的示意图。
首先通过施加AC电频率扫描试验生物芯片，并在有效频率(300-600MHz)提取数据。作为施加的频率的函数的电容响应在正常条件下(未处理细胞)在463和582MHz频率得到两个特异性分散峰(图8a)。利用带有热杀灭大肠杆菌的生物芯片进行独立的对照试验，未在463和582MHz显示特征分散峰，表明只有活细胞显示分散峰(图12)。这两个峰代表在对照/正常条件下固定的大肠杆菌的细胞活性的标志。
用不同浓度的乙酸处理大肠杆菌生物芯片，以探测感测器响应。由于在初始1小时处理时由乙酸施加的应激，特征分散峰变小。细胞的电容响应倾向于随增加的乙酸浓度和暴露时间(1小时和3小时)而减小(图8a和b)。此电容减小可归因于乙酸跨细胞膜的输送活性与乙酸的低pH相组合，这削弱细胞膜功能，进而可降低细胞的生长潜力和活力。
细胞的响应在初始1小时在较低频率(<350MHz)独立于乙酸浓度，而在较高频率可辨别电容响应的幅度。由于在初始1小时处理时的乙酸应激，观察到未处理细胞(对照)在463和582MHz频率的特征分散峰变小。然而，在3小时乙酸应激后，细胞显示明显的响应模式，其中高于166mM(1%)乙酸的浓度显示类似响应，具有在463MHz的持续的分散峰，并具有变小的582MHz峰(图8b)。这些结果表明，细胞倾向于适应乙酸随时间(3小时)施加的应激，如在463MHz和582MHz的持续的分散峰所证明。在3小时乙酸暴露后，细胞对高于166mM(1%)的乙酸更敏感，与在初始1小时暴露不同（由于毒性）。
在本发明的另一个实施方案中，图9图示说明在暴露于不同浓度H2O2 (a)1小时和(b)3h小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。根据本发明，监测大肠杆菌生物芯片对氧化应激的响应。分别用不同浓度的H2O2(0-882mM，0-3%)处理生物芯片感测器表面1小时和3小时。不论暴露时间如何，用294mM(1%)H2O2处理的大肠杆菌细胞引起电容响应可忽略的变化，但在1小时观察到在463和582MHz处特征分散峰消失，而它们在3小时时持续，这与细胞经3小时时间间隔以适应应激是一致的(图9a和b)。从图9b观察到，细胞对588mM(2%) H2O2显示较高电容响应，对于882mM(3%)的3小时暴露，此响应倾向于明显减小，并且582MHz的特征分散峰消失。此结果表明，大肠杆菌细胞耐抗由294mM(1%) H2O2产生的低水平氧化毒性。而在588mM(2%)H2O2浓度，细胞对氧化剂显示适应性响应，这表明暴露于低水平H2O2使细菌细胞耐抗暴露于更多毒性剂量的H2O2(图9b)。然而，在甚至更高水平(882mM，3%H2O2)，感测器芯片显示显著减小的电容响应，表示与588mM(2%)H2O2的3小时暴露相反，细胞不能应付882mM(3%)导致的在更高水平氧化毒性下的应激。
在本发明的另一个优选实施方案中，图10图示说明在暴露于不同浓度NaCl (a)1小时和(b)3小时时，大肠杆菌电容器生物芯片的电容变化作为施加的频率(300-600MHz)的函数。通过用对细胞非毒性但在较高水平可诱导盐/渗透应激的另一种化学物质处理，进一步试验CNT活化的感测器生物芯片。在生物芯片上培育不同浓度的NaCl(0-684mM，0-4%)以研究盐应激响应。细胞对0-513mM NaCl(0-3%)浓度在初始1小时处理经历轻微的适应性响应，并且对于684mM(4%) NaCl浓度，细胞倾向于经历盐应激(图10a)。另外，在1小时盐暴露时，特征分散峰不显著。在从1延长至3小时的细胞暴露时，发现高于342mM(2%)的盐浓度诱导盐应激，而在较低浓度(171-342mM，1-2%)细胞不受盐应激影响(图10b)。
在本发明的另一个实施方案中，图11图示说明，在恒定AC电频率(350MHz)经历1和3小时处理时间，大肠杆菌细胞(固定在CNT活化的感测器芯片上)的响应作为不同浓度(a)乙酸(酸应激)、(b)H2O2(氧化应激)和(c)NaCl(盐应激)的函数。插表显示确定大肠杆菌细胞经历的应激水平的百分比相对变化的颜色编码值。应激颜色编码标度显示应激水平的严重性，其中绿色表示适应/耐受，红色表示应激/毒性。
对 化学物质施加应激的严重性的识别和颜色编码 。对化学物质施加的应激的严重性进行颜色编码用于目视检查(图11)。红色和绿色分别表示毒性和非毒性性质。颜色强度表示毒性的严重性。例如，强烈红色表示严重毒性，而绿色表示适应性响应。结果显示，用乙酸处理导致下降的电容响应，这表明细胞随时间(1-3小时)受乙酸严重影响(在图11a中显示红色)。相反，对初始1小时的H2O2暴露显示适应性响应(在图11b中显示绿色)，而在3小时在较高浓度下(882mM，3%)，细胞倾向于受高H2O2施加的氧化应激影响(图11b)，表明882mM(3%)H2O2对细胞为毒性。对于用不同盐浓度处理的细胞，观察到类似响应。已发现，在NaCl暴露的初始1小时，细胞倾向于通过增加表面电荷分布并因此增加电容来适应。然而，对于高于342mM(2%) NaCl的更高水平，在3小时暴露后，由于盐应激，电容倾向于减小(图11c)。从结果明显看到，与用乙酸或H2O2观察到的比较，细胞不受NaCl严重影响，表明细胞可耐受高盐水平。该结果与先前的研究一致，在先前的研究中，已报告大肠杆菌的盐耐受水平高达1.1M(~6.5%)NaCl，并且对于耐渗性，细胞倾向于适应高盐浓度。
在本发明的另一个实施方案中，图12图示说明以下电容响应的示例性结果：只与羧基-CNT共价连接的裸GID表面(以黑色显示)；固定有活的8.7×106个细胞(红色)和1.74×107个细胞(蓝色)的生物芯片；以及在预先用羧基-CNT活化的GID表面上热杀灭的1.74×107个细胞(绿色)。在300-600MHz频率范围观察到电容响应。根据本发明的另一个实施方案，图13图示说明由电荷云包围的典型细胞的示例性示意图，所述电荷云通过两个相等且相反、在外细胞表面上分隔距离“r”的单位电荷构成分子偶极“m”。结果显示通过细菌生物芯片在AC电场下细菌细胞对应激化学物质的改变的行为。开发的基于大肠杆菌的电容生物感测器的基本假设如下：复杂的细菌细胞表面由正电荷和负电荷组成，所述电荷由外膜的表面和菌毛蛋白的可离子化侧链构成。典型的细菌细胞，例如球状蛋白，一般呈现构成电偶极的表面电荷。细菌细胞(大肠杆菌)的最简单分子偶极一般由具有+q和–q大小的一对相反电荷组成，这一对相反电荷由矢量距离r分隔。分子偶极矩m由公式m=qr给出(图13)。根据本发明的一个实施方案，在暴露于任何毒性化学物质时，细菌细胞固定在固体表面上，这些细胞可经历应激条件，因为在与毒性化学物质相互作用后外膜可变脆或甚至碎裂，因此显示改变的表面电荷分布。
根据本发明，开发了一种与作为生物识别成分的活大肠杆菌细胞结合的非侵害、无标记电容生物芯片(生物芯片)，用于通过nFEIS确定化学物质对诱导细胞应激的影响。根据本发明，用模型化学物质试验大肠杆菌生物芯片的应激，例如，(a)乙酸，其诱导代谢应激或酸冲击；(b)过氧化氢，通过产生•OH促成氧化毒性；和(c)氯化钠，诱导盐/渗透应激。大肠杆菌生物芯片以依赖于浓度的方式对不同化学物质的区别响应对给定的化学物质提供关于毒性的知识。
活细胞可由具有不同电性质的物质的复杂空间排布组成。一般地，细菌具有细胞膜，氧化磷酸化在细胞膜中发生(在线粒体不存在下)。本领域的技术人员已知，细菌的细胞膜由细胞壁包围，细胞壁为刚性，并且保护细胞免遭渗透溶解或外部环境干扰。在格兰氏阴性菌中，外膜由脂多糖和蛋白质组成。细胞膜由包含很多蛋白质的脂双层组成，其中脂分子以其极性基团朝向外取向进入水性环境，其疏水烃链向内指向，以形成膜内部。细胞的内侧包含被膜覆盖的微粒和很多溶解的带电分子。虽然细胞膜一般高度绝缘，但细胞的内部高度导电。细菌细胞的观察介电性质可根据模型解释，该模型由以下组成：导电胞质核，其包含于薄的绝缘膜，该薄绝缘膜进而由多孔导电细胞壁包围。
一般用裸GID电容器感测器试验电容器感测器表面的灵敏度。根据本发明的一个优选实施方案，通过由本文所述的羧基-CNT活化的GID表面，提高这些感测器的灵敏度。已观察到，电容响应水平提高数个数量级(图4)。因此，用固定有大肠杆菌的羧基-CNT活化的感测器芯片进行所有试验。在此选择固定两种大肠杆菌浓度(8.7×106和1.74×107)，因为在这些浓度下，在SiO2表面上有最小的非特异性吸附。另外，细胞浓度增加只在感测器表面上产生更多的非特异性吸附。为此，在芯片制造过程期间可需要另外的步骤以防止非特异性吸附，例如，通过光致抗蚀剂聚合物(例如，SU-8)钝化SiO2表面，并且留下仅GID区域开放，这可以能够有效地固定细菌细胞，并提高灵敏度。
在本发明的另一个实施方案中，虽然此方法举例说明使用细菌，但此方法可扩展到其它细胞(细菌或哺乳动物)或特异功能组织，以探测对外部刺激的响应。
在低频率，电容响应一般较少依赖于细胞浓度/应激，而在高于300MHz施加频率变得更具依赖性。本领域的技术人员熟知，暴露于AC频率电场的细胞可有效地导致细胞壁表面内侧和外侧离子层的移动，并且变得电极化。这种极化一般采取的形式为在外部和界面表面上产生的电荷(图7b)，这在300MHz以外影响电容降低水平，因此，观察到弛豫行为(图8-10)。
在暴露于AC电场(300-600MHz)时，从未处理细胞(对照，在463和582MHz频率下)观察到特征分散峰。这些特征分散峰的出现是在对照条件下活大肠杆菌的存在/连接的明显标志。当用乙酸、H2O2和NaCl以不同应激处理细胞时，细胞表面与这些应激相互作用，并显示对适应性/有害响应的灵敏度。细菌细胞与应激的相互作用最可能引起净表面电荷的减少，这导致特征分散峰消失。这最可能是由于在暴露于应激环境时细胞膜功能的损失，因此，膜对于离子变得更加多孔，并且还导致额外的细胞质蛋白错折叠。由于响应对300-600MHz频率扫描为动态，可在特定频率监测生物芯片的响应。因此，任意选择350MHz的频率，并提取绝对电容值，以说明大肠杆菌细胞对模型应激化学物质相对于其浓度和时间的不同响应。对由化学物质施加的应激的严重性进行颜色编码用于目视检查(图11a-c)。
结果显示，用乙酸处理导致降低的电容响应，这表明细胞随时间(1-3小时)受乙酸严重影响(在图11a中显示红色)。相反，在初始1小时的H2O2暴露显示适应性响应(在图6b中显示绿色)，而在3小时对于882mM(3%)，细胞受高H2O2施加的氧化应激影响(图11b)，表明882mM(3%)H2O2对细胞为毒性。对于以不同盐浓度处理的细胞观察到类似响应。已发现，在NaCl暴露的初始1小时，细胞倾向于通过增加表面电荷分布并因此增加电容来适应。然而，在3小时暴露后，由于盐应激，电容倾向于随高于342mM(2%) NaCl的较高水平减小(图11c)。从这些结果明显看到，与用乙酸或H2O2所观察到的相比，细胞不受NaCl严重影响，表明细胞可耐受高盐水平，但不耐受高乙酸或H2O2。该结果与先前的研究一致，在先前的研究中，已报告大肠杆菌的盐耐受水平高达1.1M(~6.5%)NaCl，并且对于耐渗性，细胞可适应高盐浓度。
一般地，大肠杆菌在对各种应激物的响应中涉及细菌包膜的保持、适应和保护。本领域的技术人员已知，大肠杆菌中的包膜应激响应一般通过由膜定位蛋白(例如BaeS和BaeR(BaeSR调节子))构成的双组分系统调节，膜定位蛋白通过毒性化合物的流出来控制适应性响应，并通过未识别的机制以防止其它包膜干扰物。
在本发明的另一个优选实施方案中，在生物芯片上作为生物识别成分的大肠杆菌细胞的行为用于监测在非侵害方法中应激诱导性化学物质的影响。
用固定有大肠杆菌的羧基-CNT活化的GID电容器阵列芯片检测化学物质对生物系统的毒性的新方法的开发。检测方法基于nFEIS技术，用于监测化学物质对细菌细胞施加的应激。使用在此研究中开发的生物芯片是了解和区分毒性化学物质与非毒性化学物质的有效方法。生物电容器感测装置提供感测器平台，所述平台还可用于表征靶化学物质(包括毒性气体)诱导应激/毒性响应的性质。开发的大肠杆菌生物芯片的受关注特征是作为大肠杆菌活性标志的在463和582MHz的分散峰，并且在这些频率的电容水平变化决定应激化学物质的毒性性质。
前述本发明有很多优点。使用开发的生物芯片的主要优点之一是，在通过用适合的缓冲剂简单洗净生物芯片表面来处理并且在干燥条件下或在没有干扰性液体营养/培养基下测量电容后，可立即避免非特异信号。因此，开发的检测方法和生物芯片有利于试验应激剂(包括气相、固相或液相)的不同物理形式，使这些方法和装置特别有价值，并且可扩展到测定潜在毒性和筛选，用于监测环境污染物和食品样品。然而，为了改善灵敏度，还需要通过下列解决几个挑战：(a)金叉指电极的更佳设计；(b)几何结构；(c)在芯片制造期间需要在SiO2表面上形成沉积钝化层的另外步骤防止细胞在SiO2表面上非特异性吸附；(d)表面化学性质；(e)信号-噪声比；和(f)生物化学测定条件。
本发明文献的以上和以下说明和附图集中在本发明的一个或多个目前优选实施方案，也描述一些示例性任选特征和/或备选实施方案。说明和附图为了说明目的而非限制。本领域的普通技术人员应认识变体、修改和变动。这些变体、修改和变动也在本发明的范围内。节标题是简明的，仅为方便。

Claims (20)

1. 一种用于检测靶化学物质的生物电容器感测装置，所述感测装置包括：
a) 电容器，所述电容器包括基片和在该基片上的金属沉积层；
b) 羧化碳纳米管(羧基-CNT)层；和
c) 活细胞，其中所述活细胞固定到碳纳米管(CNT)层上，
其中所述活细胞为能够适于响应所述靶化学物质的感测成分，
其中可针对所述靶化学物质对所述活细胞施加的应激来监测所述活细胞。
2. 权利要求1的装置，其中所述基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。
3. 权利要求2的装置，其中所述基片为硅。
4. 权利要求1的装置，其中所述基片上的金属沉积层包括采用叉指结构的至少一个电极。
5. 权利要求4的装置，其中所述电极中的材料选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)。
6. 权利要求5的装置，其中所述电极为金。
7. 权利要求1的装置，其中所述电容器为金叉指电容器。
8. 权利要求1的装置，其中所述碳纳米管层为羧化多壁碳纳米管(羧基-CNT)。
9. 权利要求1的装置，其中所述活细胞可选自哺乳动物细胞、细菌细胞和特异功能组织细胞。
10. 权利要求9的装置，其中所述活细胞为细菌细胞。
11. 权利要求10的装置，其中所述细菌细胞可以为任何细菌细胞株，包括大肠杆菌DH5α、K-12、沙门氏菌、假单胞菌和芽孢杆菌种。
12. 权利要求1的装置，其中所述细菌细胞为大肠杆菌。
13. 权利要求1的装置，其中所述靶化学物质可选自乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐、影响阴离子细胞内积累的药物；由产生反应性氧物类(ROS)、H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)、氧化氮(NO)的化学物质诱导的氧化毒性；由高浓度溶质、NaCl、细胞的细胞溶质中的渗透质诱导的渗透应激；肉碱、海藻糖、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇、甘油-甜菜碱和诱导基因毒性应激的其它化学物质。
14. 一种定量检测关注的靶化学物质的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 使试样暴露于权利要求1的生物电容器装置，其中所述试样只包含关注的靶化学物质，其中所述试样能够对所述生物电容器装置诱导细胞应激响应；
b) 对所述生物电容器装置施加具有交流(AC)频率的电势曲线；
c) 在干扰性液体营养/培养基不存在下，通过nFEIS检测生物电容器装置的表面阻抗/电容变化，监测所述生物电容器装置的细胞应激响应，其中所述细胞响应只与关注的靶化学物质的存在相关。
15. 权利要求14的方法，其中所述靶化学物质为选自以下的应激剂：乙酸、乳酸有机钙盐、丙酸盐、甲酸盐、影响阴离子细胞内积累的药物；由产生反应性氧物类(ROS)、H2O2、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(O2 -)、有机过氧化氢(ROOH)、过氧亚硝酸盐(OONO)、氧化氮(NO)的化学物质诱导的氧化毒性；由高浓度溶质、NaCl、细胞的细胞溶质中的渗透质诱导的渗透应激；肉碱、海藻糖、甘油、蔗糖、脯氨酸、甘露糖醇、甘油-甜菜碱和诱导基因毒性应激的其它化学物质。
16. 一种制造生物电容器感测装置的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供基片；
b) 在所述基片上沉积金属层， 以形成电容器， 其中所述金属层包括为叉指结构的至少一个电极；
c) 使所述电容器上的金属层图案化；
d) 使羧化碳纳米管(羧基-CNT)层共价结合到所述电容器上，以形成羧基-CNT活化的电容器；
e) 使活细胞固定到所述羧基-CNT活化的电容器上，
其中所述活细胞为能够适于响应靶化学物质的感测成分，
其中可针对所述靶化学物质对所述活细胞施加的应激来监测所述活细胞。
17. 权利要求16的方法，其中所述基片选自硅、玻璃、熔融二氧化硅和塑料。
18. 权利要求16的方法，其中所述电极中的材料选自金、银、铂、钯、铜和氧化铟锡(ITO)。
19. 权利要求16的方法，其中所述电容器为金叉指电容器。
20. 权利要求16的方法，其中所述活细胞为大肠杆菌。
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