CN110568037A - 用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法及其应用,属于细胞的检测技术领域。其首先制备尺寸可控的Ag/His‑GQD/rGO三维复合材料,复合材料修饰到玻碳电极上后,L‑半胱氨酸通过巯基结合到复合材料上,再将已经活化的叶酸通过酰胺键与L‑半胱氨酸结合,固定细胞,通过电化学阻抗技术进行测定,制得电化学细胞传感器。本发明通过与三维复合材料的结合,可以提供更多的结合位点,提高传感器的灵敏度。构建的传感器结合电化学阻抗技术可以快速用于Hep G2细胞的测定,且成本比较低。本发明通过Hep G2细胞传感器的构建,可用于农药毒性的评价,在农药联合毒性评价方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法及其应用,具体涉及一种尺寸可控的银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨烯三维复合材料的制备方法及其应用,属于细胞的检测技术领域。
背景技术
随着农业的发展,各种农药不断出现,比如有机磷类、氨基甲酸酯类、氯化烟酰类等,其中氯化烟酰类农药作为一类新型农药被广泛用于农业的防虫抗害中。它是通过控制存在于昆虫神经系统中的烟碱型乙酰胆碱受体,阻断昆虫中枢神经系统正常传导,使神经突触膜电势平衡遭到破坏,诱导昆虫麻痹,从而死亡。目前我国登记的氯化烟酰类农药由11种,其中吡虫啉、啶虫脒和噻虫嗪登记数量位于前三。农药的过度、频繁的使用,特别是多种农药联合的使用,势必会对生态环境和人类的健康造成很大的影响。因此有关农药联合毒性评价及分析的方法则显得日益重要,尤其是关于判定混合农药的联合毒性是否因组分之间的相互作用而增强(协同作用)、减弱(拮抗作用)或未受到影响(相加作用)。
电化学传感器由于具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好、小型化潜力大、性价比高等优点,其广泛的用于细胞的检测。为了提高传感器的灵敏度,出现了各种信号放大策略,其中纳米材料放大策略被广泛的用于传感器的构建。石墨烯由于具有良好的机械性能、高的电导率以及高的比表面积等优点而被广泛关注。然而二维石墨烯通过π-π叠加团聚,从而导致其比表面积减少和导电性变差,这大大限制了石墨烯在传感器中的应用。气凝胶、海绵和泡沫等三维石墨烯具有大的比表面积和孔隙,而且可以加快电子转移速率,大大改善了石墨烯的团聚问题。为了进一步的提高传感器的灵敏度,通过石墨烯与其他纳米材料的结合所制备的复合材料得到广泛的研究。其中贵金属纳米粒子具有较大的表面积、独特的催化性能和良好的电化学性能,已被用于传感器的构建,如Au、Pt、Pd、Ag等。纳米粒子的催化性能往往取决于其粒径和分散性,通常粒径小、分散性高的纳米粒子具有更好的催化性能。迄今为止,通过不同的策略合成了许多形貌各异的纳米粒子,用来提高它们的催化性能,如三角形、六角形、花状和片状。然而,贵金属纳米粒子由于其表面电位不稳定,容易团聚,导致比表面积和催化能力下降,不能充分利用纳米粒子良好的催化性能。通过石墨烯与贵金属的结合不仅增加了比表面积,从而增加了分析物的固定容量,而且还表现出协同催化作用,比单独使用石墨烯或贵金属纳米颗粒产生更好的性能和更灵敏的反应。到目前为止,石墨烯和贵金属纳米粒子的复合材料已被广泛应用。两者结合的方式有很多种,比如首先分别制备贵金属纳米粒子和石墨烯,然后通过简单的物理混合得到复合材料。这种结合不仅导致了银纳米粒子在洗涤过程中的浸出,而且由于石墨烯与纳米粒子之间的结合力较弱,导致了纳米粒子的团聚。还有,将氧化石墨表面带负电荷的含氧基团与带正电荷的金属盐结合,用还原剂还原,得到了原位还原方法。虽然这种方法提高了石墨烯与纳米颗粒之间的结合强度,但纳米颗粒的尺寸在此过程中难以控制,导致不同尺寸的纳米颗粒分散在石墨烯片上。还有其他的策略,例如氮掺杂,胺类化合物功能化等。尽管做出了这些努力,但这些方法仍然无法实现大小可控的纳米粒子在石墨烯上的均匀分散。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处,提供一种用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法及其应用,该电化学细胞传感器基于尺寸可控银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨(Ag/His-GQD/rGO)三维复合材料构建,实现了吡虫啉和啶虫脒对Hep G2细胞的联合毒性评价。
本发明的技术方案,一种用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法,首先制备尺寸可控的银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨烯Ag/His-GQD/rGO三维复合材料,复合材料修饰到玻碳电极上后,L-半胱氨酸通过巯基结合到复合材料上,再将已经活化的叶酸通过酰胺键与L-半胱氨酸结合,固定细胞,通过电化学阻抗技术进行测定,制得电化学细胞传感器。
进一步地,所述尺寸可控的三维复合材料的制备方法如下:称取氧化石墨分散于水中,超声得到分散液,搅拌条件下加入组氨酸功能化石墨烯量子点,得到均匀的分散液;使用NaOH调节溶液至中性,缓慢的加入硝酸银溶液,随着硝酸银量的增加,出现沉淀,离心,洗涤,获得Ag/His-GQD/GO;对样品进行冷冻干燥,最后在氮气保护下,高温还原后获得Ag/His-GQD/rGO三维复合材料。
进一步地,所述尺寸可控的三维复合材料的制备方法如下:配置不同浓度的硝酸银,根据硝酸银所加入的量来调控银纳米粒子的粒径及分布。
进一步地,用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的传感器的构建方法如下:
(1)所述的Ag/His-GQD/rGO三维复合材料,溶于DMF中,超声处理后,滴加壳聚糖,继续超声至分散均匀,使用微量进样器移取溶液滴于已处理好的玻碳电极表面,放置过夜;
(2)L-半胱氨酸通过自身的巯基结合到电极上;
(3)通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/(N-羟基琥珀酰亚胺,活化叶酸,然后通过与L-半胱氨酸发生酰胺反应,从而使叶酸修饰到电极表面,制得电化学细胞传感器。
本发明的另一目的,用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的应用,通过对电极上修饰细胞和孵育,来实现对细胞浓度的测定和对农药联合毒性的评价。
进一步地,所述细胞测定方法如下:取出已经构建的电化学细胞传感器放入已经啶虫脒和吡虫啉标准品刺激后的细胞,37℃下孵育7-9小时,通过测定阻抗值来考察电极界面的变化,从而实现对细胞的测定以及联合毒性的评价。
进一步地,所述细胞为Hep G2细胞。
本发明的有益效果:本发明通过与三维复合材料的结合,可以结合由更多的结合位点,提高传感器的灵敏度。构建的传感器结合电化学阻抗技术可以快速用于Hep G2细胞的测定,且成本比较低。
本发明通过Hep G2细胞传感器的构建,可用于农药毒性的评价,在农药联合毒性评价方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1-A为GO与GO/His-GQD不同质量比荧光光谱图。
图1-B为GO与GO/His-GQD不同质量比与荧光猝灭程度的关系图。
图2为Ag/His-GQD/rGO复合材料的SEM图。
图3为Ag/His-GQD/rGO复合材料的TEM和元素分析图。
图4-A为GO和GO/His-GQD红外谱图。
图4-B为Ag/His-GQD/rGO复合材料的XRD图谱。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步的描述。
本发明所用的CHI660D电化学工作站(上海辰华); HITACHI S4800场发射扫描电子显微镜;JEM-2100(HR)透射电子显微镜(日本JEOL 公司);Nicolet iS50 FT-IR 傅立叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司);CuKα辐射在D8 Advance上测量X射线衍射(XRD)(德国布鲁克);荧光分光光度计(美国瓦里安有限公司)。
本发明采用石墨、柠檬酸,组氨酸,氢氧化钠、硝酸银(AgNO3),制备磷酸盐缓冲盐水(PBS,0.01 M,pH 7.40),Hep G2细胞,L-半胱氨酸,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/(N-羟基琥珀酰亚胺),叶酸,啶虫脒和吡虫啉标准品。
一种基于尺寸可控银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨烯(Ag/His-GQD/rGO)三维复合材料构建细胞传感器的制备,包括如下步骤:
1、尺寸可控的银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨烯材料的合成,包括如下步骤:
(1)称取0.3 g氧化石墨烯分散于100 mL去离子水中,超声3h得到分散液,在700r/min搅拌下缓慢加入0.375 g His-GQD。接着用1mol/L NaOH溶液调节溶液酸度至pH至7.00;
逐滴向其中加入0.2 mol/L的AgNO3水溶液,逐渐出现沉淀,离心收集固体,并用去离子水多次洗涤,收集的固体。在60℃条件下真空干燥,得到Ag/His-GQD/GO。将样品冷冻干燥,干燥好的样品置于管式炉中,在氮气保护下,以2℃/min 速率升温至300℃,保持3h退火还原,室温冷却后获得Ag/His-GQD/rGO复合材料。
(2)取不同量的硝酸银与His-GQD/GO结合,通过加入硝酸银量的不同来实现对银纳米粒子尺寸的调控。
2、传感器的构建:
玻碳电极经Al2O3抛光处理,然后分别在去离子和乙醇溶液中超声10min,用氮气吹干后备用。将制备好的Ag/His-GQD/rGO复合材料分散到DMF溶液中,加入1.0 wt%壳聚糖(CS),超声1 h获得分散液(2 mg/mL)。取10 μL上述分散液滴至已处理好的GCE表面,室温放置直至干燥。接着修饰L-半胱氨酸,将已活化的叶酸修饰到电极上。
3、细胞测定:
将Hep G2固定到电极表面,通过电化学阻抗技术进行测定,获得Hep G2细胞传感器。构建的Hep G2细胞传感器,通过两种农药(啶虫脒和吡虫啉)的联合刺激Hep G2细胞,然后用电化学交流技术测定阻抗值的大小,来进行农药的联合毒性评价。
图1为1mg/mL氧化石墨烯与组氨酸功能化石墨烯量子点不同质量比的荧光光谱。随着GO/His-GQD质量比的增加,荧光强度不断减弱,这是由于能量共振转移导致荧光猝灭,这也证明了His-GQD与GO的成功结合。GO/His-GQD质量比达到0.8时,荧光强度无明显变化。因此,本发明采用质量比为0.8的GO/His-GQD。
图2显示了银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/氧化石墨复合材料SEM。
银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/氧化石墨复合材料SEM,由图可以看出,复合材料由褶皱薄片和银纳米颗粒组成的三维形貌,银纳米粒子均匀地分布在rGO薄片的两侧。这是由于His-GQDs作为稳定剂,将银纳米粒子牢牢固定在石墨烯薄片上。此外,银纳米粒子嵌入rGO片层间,增加了rGO片间的距离,形成三维网状结构,银纳米粒子可以均匀分散在石墨烯片上。
图3显示了银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/氧化石墨复合材料TEM和元素分析。
A图,银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/氧化石墨复合材料TEM,银纳米颗粒固定在rGO片上,银纳米颗粒的平均尺寸为25 nm。图B中插图是高分辨率TEM (HRTEM),0.205 nm的晶格间距对应于Ag晶体的(200)面。此外,使用元素映射图像(element mappingimages, EMIs)分析了元素的详细组成(C图),观察到Ag、N元素。
图4显示氧化石墨烯和氧化石墨烯/组氨酸功能化石墨烯量子点的红外光谱和银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/氧化石墨复合材料XRD。
A图,从上往下分别是GO和GO/His-GQD红外谱图, 对于氧化石墨,3400 cm - 1,1773 cm - 1, 1674 cm - 1, 1102 cm-1和1029 cm – 1分别对应的是-OH峰,C = O伸缩,C = C伸缩,C-O伸缩振动以及环氧振动。GO与His-GQD结合时,在-N-H、C=N、C-N振动对应的3134cm- 1,1587 cm- 1,1355 cm-1处出现了新的峰值,证明了His-GQD与GO表面成功结合。图B为Ag/His-GQD/rGO复合材料的XRD图谱,其衍射角分别为38.3°、44.4°、64.5°、77.5°,对应立方Ag晶体(JCPDS No. 65-2871)的反射峰(111)、(200)、(220)和(311)。
综上所述,成功地合成了Ag/His-GQD/rGO复合材料。
Claims (7)
1.用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法,其特征是:首先制备尺寸可控的银纳米粒子/组氨酸功能化石墨烯量子点/还原氧化石墨烯Ag/His-GQD/rGO三维复合材料,复合材料修饰到玻碳电极表面后,L-半胱氨酸通过巯基结合到复合材料上,再将已经活化的叶酸通过酰胺键与L-半胱氨酸结合,固定细胞,通过电化学阻抗技术进行测定,制得电化学细胞传感器。
2.如权利要求1所述用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法,其特征是所述尺寸可控的三维复合材料的制备方法如下:称取氧化石墨分散于水中,超声得到分散液,搅拌条件下加入组氨酸功能化石墨烯量子点,得到均匀的分散液;使用NaOH调节溶液至中性,缓慢的加入硝酸银溶液,随着硝酸银量的增加,出现沉淀,离心,洗涤,获得Ag/His-GQD/GO;对样品进行冷冻干燥,最后在氮气保护下,高温还原后获得Ag/His-GQD/rGO三维复合材料。
3.如权利要求2所述用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法,其特征是所述尺寸可控的三维复合材料的制备方法如下:配置不同浓度的硝酸银,根据硝酸银所加入的量来调控银纳米粒子的粒径及分布。
4.如权利要求1所述用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的构建方法,其特征是传感器的构建方法如下:
(1)所述的Ag/His-GQD/rGO三维复合材料,溶于DMF中,超声处理后,滴加壳聚糖,继续超声至分散均匀,使用微量进样器移取溶液滴于已处理好的玻碳电极表面,放置过夜;
(2)L-半胱氨酸通过自身的巯基结合到电极上;
(3)通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/(N-羟基琥珀酰亚胺,活化叶酸,然后通过与L-半胱氨酸发生酰胺反应,从而使叶酸修饰到电极表面,制得电化学细胞传感器。
5.用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的应用,其特征是:通过对电极上修饰细胞和孵育,来实现对细胞浓度的测定。
6.如权利要求5所述用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的应用,其特征是所述细胞测定方法如下:取出已经构建的电化学细胞传感器放入已经使用啶虫脒和吡虫啉标准品刺激后的细胞,37℃下孵育7-9小时,通过测定阻抗值来考察电极界面的变化,从而实现对细胞的测定,同时实现对啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价。
7.如权利要求5所述用于啶虫脒和吡虫啉联合毒性评价的电化学细胞传感器的应用,其特征是:所述细胞为Hep G2细胞。
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Joshi et al. | Recent advances in nanomaterial-based electrochemical detection of antibiotics: Challenges and future perspectives | |
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Bhardwaj et al. | Electrochemical Aflatoxin B1 immunosensor based on the use of graphene quantum dots and gold nanoparticles | |
Govindasamy et al. | Molybdenum disulfide nanosheets coated multiwalled carbon nanotubes composite for highly sensitive determination of chloramphenicol in food samples milk, honey and powdered milk | |
Yang et al. | Size controllable preparation of gold nanoparticles loading on graphene sheets@ cerium oxide nanocomposites modified gold electrode for nonenzymatic hydrogen peroxide detection | |
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Ge et al. | Phosphorene nanocomposite with high environmental stability and antifouling capability for simultaneous sensing of clenbuterol and ractopamine | |
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Zhang et al. | Functionalized nanocomposites with the optimal graphene oxide/Au ratio for amplified immunoassay of E. coli to estimate quality deterioration in dairy product | |
Ma et al. | Sensitive determination of nitrite by using an electrode modified with hierarchical three-dimensional tungsten disulfide and reduced graphene oxide aerogel | |
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Fujii et al. | First direct imaging of electrolyte-induced deswelling behavior of pH-responsive microgels in aqueous media using scanning transmission X-ray microscopy | |
Van Ho et al. | Three-Dimensional Hierarchical Flower-Like Fe3O4 Porous Microstructure Decorated with Au Nanoparticles: Synthesis and Application for Sensitive Electrochemical Detection of Chloramphenicol |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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