CN114829625A - 检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测方法，其具有：将靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入器件的孔内的工序，所述孔阵列具有大量的孔；以靶核酸不会在大量的孔间移动的方式封闭孔的工序，在孔内放大来自靶核酸的信号的工序，以及检测从孔发出的信号的工序；靶核酸含有第一核酸、作为第一核酸的互补链的第二核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸；在进行封闭的工序中，双链核酸以双链的状态封闭在孔内；在放大信号的工序中，第一特异性结合物质与第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与第二核酸结合而发出第二信号；第一信号与第二信号不同。

Description

检测方法
技术领域
本发明涉及检测方法。
本申请主张2019年12月9日在日本申请的日本特愿2019-222153号的优先权，其内容援引于此。
背景技术
通过定量地检测生物试样中的靶分子，进行疾病的早期发现和给药效果的预测。DNA、RNA等核酸的定量通过实时PCR法等进行。
近年来，出于更早期发现疾病等的目的，更高精度地检测靶分子的需求提高。作为高精度地检测靶分子的方法，例如在非专利文献1中记载了在大量微小分区内进行酶反应来检测荧光信号的技术。该方法被称为数字测量。
在数字测量中，将试样溶液分割成极大量的微小溶液。然后，将来自各微小溶液的信号2值化，仅判别是否存在靶分子来测量靶分子数。根据数字测量，与以往的实时PCR法等相比，能够显著提高检测灵敏度和定量性。
在作为数字测量的1种的数字PCR中，按照存在于微小分区内的1个微小液滴中的作为模板的核酸为0个至1个的方式将PCR反应试剂与核酸的混合物稀释。在数字PCR中，为了提高核酸扩增的灵敏度，并且为了对大量微小液滴同时进行核酸扩增，优选各微小液滴的体积小。例如，在非专利文献1中公开了使用了按照各孔的容积达到几纳升的方式形成的微尺寸的液滴的方法。
另外，作为数字测量的其他方法，有数字侵入裂解反应(Invasive CleavageAssay，ICA)。专利文献1中公开了如下方法：将包含DNA的样品、即通过PCR反应将DNA样品扩增、变性而得到的PCR产物导入至具有微孔的器件中，在检测时不扩增DNA而通过侵入(Invader)法检测DNA。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/115635号
非专利文献
非专利文献1：Olmedillas-Lopez S.,et al.,Current and EmergingApplications of Droplet Digital PCR in Oncology.Mol Diagn Ther.2017Oct；21(5):493-510
发明内容
发明所要解决的课题
图1是示意性地表示通过以往的检测方法即数字PCR检测靶核酸的方法的图。在通过数字PCR检测靶核酸的情况下，在检测靶核酸的工序中靶核酸被扩增。因此，如图1所例示的，靶核酸不经过扩增工序而被收容在微小分区内。从血液、细胞等生物试样精制的DNA、RNA即靶核酸包含单链的核酸(将其记为单链核酸1)、与单链核酸1互补的单链的核酸(将其记为单链核酸2)、和单链核酸1与单链核酸2互补地结合而成的双链的核酸(将其记为双链核酸3)。
例如，如图1所例示的，液滴化之前的试样溶液包含2分子的单链核酸1、2分子的单链核酸2、4分子的双链核酸3。例如，在使用以往的检测方法即数字PCR检测靶核酸的情况下，以液滴的状态、例如如液滴4、液滴5以及液滴6那样，不区分单链和双链地封闭。液滴4、液滴5和液滴6的靶核酸的PCR产物大致相同。即，如图1所例示的，在数字PCR中，如液滴7那样检测到8个检测信号。根据该检测结果，无法区别在试样溶液中，例如有8个分子的单链核酸1、有8个分子的单链核酸2、还是有8个分子的双链核酸3。即，在数字PCR法中，无法对溶液中的单链核酸1、单链核酸2和双链核酸3区别地进行定量。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种能够更高精度地对单链的核酸和双链的核酸区别地进行定量的技术。
用于解决课题的手段
本发明包括以下的方式。
[1]一种检测方法，其具有：使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，以所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及检测从所述孔发出的所述信号的工序；所述靶核酸含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、以及所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸；在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内；在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与所述第二核酸结合而发出第二信号，所述第一信号与所述第二信号不同。
[2]根据[1]所述的检测方法，其中，所述第一信号和所述第二信号为发光信号，所述第一信号的波长与所述第二信号的波长不同。
[3]根据[1]或[2]所述的检测方法，其中，所述放大信号的工序通过侵入裂解反应进行。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，在所述进行检测的工序中，对于仅检测到所述第一信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第一核酸，对于仅检测到所述第二信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第二核酸，对于同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔，判定为存在所述双链核酸。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其还具有对在所述进行检测的工序中检测到所述信号的所述孔的数量进行计数的工序。
[6]根据[5]所述的检测方法，其中，在所述进行计数的工序中，分别对仅检测到所述第一信号的所述孔的数量、仅检测到所述第二信号的所述孔的数量、以及同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量进行计数。
[7]根据[6]所述的检测方法，其中，根据仅检测到所述第一信号的所述孔的数量和同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量，算出所述液体中的所述双链核酸的数量占单链状的所述第一核酸和所述双链核酸的总数的比例。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的检测方法，其中，所述第一特异性结合物质与所述第一核酸的熔解温度Tm和所述第二特异性结合物质与所述第二核酸的熔解温度Tm之差为10℃以下。
[9]一种检测方法，其具有：使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，以使所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及检测从所述孔发出的信号的工序；所述靶核酸含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、以及所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸；在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内；在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号。
本发明的另一个方面包括以下的方式。
[10]一种液体中的靶核酸的检测方法，其具有：导入工序，使所述液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内；封闭工序，以使所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔；信号放大工序，在所述孔内进行来自所述靶核酸的信号的放大；以及检测工序，检测从所述孔发出的信号；所述靶核酸含有第一核酸和作为所述第一核酸的互补链的第二核酸；在所述信号放大工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与所述第二核酸结合而发出第二信号，所述第一信号与所述第二信号不同。
[11]根据[10]所述的检测方法，其中，所述第一信号和所述第二信号为发光信号，所述第一信号的波长与所述第二信号的波长不同。
[12]根据[10]或[11]所述的检测方法，其中，所述信号放大工序通过侵入裂解反应进行。
[13]根据[10]～[12]中任一项所述的检测方法，其中，在所述检测工序中，对于仅检测到所述第一信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第一核酸，对于仅检测到所述第二信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第二核酸，对于同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔，判定为存在所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链。
[14]根据[10]～[13]中任一项所述的检测方法，其还具有计数工序，对在所述检测工序中检测到所述信号的所述孔的数量进行计数。
[15]根据[14]所述的检测方法，其中，在所述计数工序中，分别对仅检测到所述第一信号的所述孔的数量、仅检测到所述第二信号的所述孔的数量、以及同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔进行计数。
[16]根据[15]所述的检测方法，其中，根据仅检测到所述第一信号的所述孔的数量和同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量，算出所述液体中的所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链在单链状的所述第一核酸和所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链中的比例。
[17]一种液体中的靶核酸的检测方法，其具有：导入工序，使所述液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内；封闭工序，以使所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔；信号放大工序，在所述孔内进行来自所述靶核酸的信号的放大；以及检测工序，检测从所述孔发出的信号；所述靶核酸含有第一核酸和作为所述第一核酸的互补链的第二核酸；在所述信号放大工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号。
发明效果
根据本发明，可以提供能够更高精度地对单链的核酸和双链的核酸区别地进行定量的技术。
附图说明
图1是示意性地表示通过数字PCR检测靶核酸的方法的图。
图2是说明向器件输液试剂液的方法的示意截面图。
图3是说明向器件输液油的方法的示意截面图。
图4是说明从器件内检测信号的方法的示意截面图。
图5是示意性地表示本实施方式的检测方法的图。
具体实施方式
以下，根据情况参照附图对本发明的实施方式详细地进行说明。其中，在附图中，对相同或相当部分标注相同或对应的附图标记，并省略重复的说明。需要说明的是，各图中的尺寸比存在为了说明而夸张的部分，未必与实际的尺寸比一致。
[检测方法]
本发明在一个实施方式中提供一种检测方法，其具有：使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入孔内的工序，以靶核酸不会在大量的孔间移动的方式封闭孔的工序，在孔内放大来自靶核酸的信号的工序，以及检测从孔发出的信号的工序；靶核酸含有第一核酸、作为第一核酸的互补链的第二核酸、以及作为所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链的双链核酸，在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内，在信号放大工序中，第一特异性结合物质与第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与第二核酸结合而发出第二信号，第一信号与第二信号不同。
根据本实施方式的检测方法，如后所述，通过检测来自靶核酸的信号，能够区分各孔中是仅含有第一核酸、仅含有第二核酸、还是仅含有第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链。其结果，能够更准确地定量液体中所含的第一核酸、第二核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸各自的分子数。
例如，在靶核酸来自生物试样的情况下，通过准确地定量第一核酸、第二核酸和双链核酸各自的分子数，有可能得到与癌的状态和伴随基因突变的疾病等相关的新见解。
更具体而言，如图5所例示的，含有靶核酸的液体含有第一核酸11、与第一核酸11互补的单链的第二核酸12、第一核酸11与第二核酸12互补地结合而成的双链的双链核酸13。进行液滴化前的试样溶液含有2分子的单链的第一核酸11、2分子的单链的第二核酸12、4分子的双链核酸13。例如，根据本实施方式的检测方法，通过导入工序、封闭工序，例如在液滴14中封闭双链核酸13，在液滴15中封闭第二核酸12，在液滴16中封闭第一核酸11。
接着，在信号放大工序中，从液滴18发出第一信号，从液滴19发出第二信号，从液滴17同时发出第一信号和第二信号。在此，由于第一信号与第二信号不同，因此在检测工序中，能够对液滴17、液滴18、液滴19进行区分。即，根据本实施方式的检测方法，能够区分各个液滴中所含的第一核酸11、第二核酸12和双链核酸13。其结果，能够判定为在含有靶核酸的液体中含有2分子的第一核酸11、2分子的第二核酸12和4分子的双链核酸13。
(器件)
在本实施方式的检测方法中，使用具有孔阵列的器件，所述孔阵列具有大量的孔。作为器件，例如可以使用以下列举的器件，但并不限定于此。
孔的形状、尺寸及配置没有特别限定，但优选使用由能够收容在本发明的方法中使用的含有靶核酸的液体及在检测工序中使用的一定量的试剂液等的孔构成的孔阵列。孔可以在无处理的情况下直接使用，也可以根据目的预先在孔内壁固定提取试剂、抗体等检测试剂和特异性结合物质等中的至少一种。另外，也可以实施用脂质双层膜覆盖孔开口部等的前处理。
器件可以具有流路，也可以经由流路输液分散有靶核酸的液体。流路的形状、结构及容量等没有特别限定，优选使用具有流路的器件。若使用这样的器件，则能够在输液含有靶核酸的液体时将靶核酸导入孔阵列的各孔，且在将封闭液插入流路时将各孔分别封闭而形成微小液滴。
(器件的一例)
图2是本发明的一个方式中的器件的示意截面图。如图2所示，器件100具备基材104和盖材101。盖材101具有凸部。凸部与基材104连接。在盖材101设置有具有贯通盖材101的孔的输液口102和废液口103。基材104具有大量的孔105。流路106位于盖材101与大量的孔105之间。
基材104可以由透光性树脂形成。本实施方式的基材104也可以是实质上透明的。
基材104的孔105在基材104的表面开口。孔105的形状、尺寸以及配置没有特别限定。在图2所示的例子中，在器件100中，在基材104上形成有能够收容试剂液107(分散有靶核酸的液体)的相同形状相同大小的大量的孔105。另外，在本实施方式的检测方法中使用粒子的情况下，也可以在基材104上形成具有能够收容1个以上粒子的形状和尺寸、能够收容含有粒子的一定量的试剂液107的相同形状相同大小的孔105。
在器件100中，孔105的直径可以为100nm～30μm，优选为1μm～15μm，更优选为3μm～15μm。孔的深度可以为100nm～30μm，优选为1μm～15μm，更优选为3μm～15μm。作为一例，孔的直径可以为3μm左右，孔105的深度例如可以为4.5μm左右。另外，孔105也可以以形成三角格子状或正方格子状的方式排列而形成于基材104。
器件100所具有的孔的个数优选为10万个～600万个。另外，孔的总容量优选为0.1～10μL。
基材104的包含大量的孔105的区域是填充作为分析对象的试剂液107的区域。在该区域的内侧，在基材104与盖材101之间设置有流路106。
盖材101可以熔融粘合或粘接于基材104。例如，盖材101可以由环烯烃聚合物或环烯烃共聚物等热塑性树脂形成。
基材104例如使用树脂形成。树脂的种类没有特别限定，优选使用对形成试剂和液滴时的封闭液具有耐受性的树脂。另外，在对信号进行荧光观察的情况下，优选选择透过检测波长的光且自体荧光少的树脂。例如，可举出环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、硅酮、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯、氟树脂及非晶氟树脂等。需要说明的是，作为基材104的例子而示出的这些材质只不过是例子，材质并不限定于此。
对于基材104，也可以在板厚方向的一个面上形成大量的孔105。作为使用了树脂的形成方法，除了注塑成型之外，还可举出热压印、光压印等。另外，在使用氟树脂的情况下，例如，也可以在基材104上具有CYTOP(注册商标)(旭硝子)的层，形成于CYTOP(注册商标)的微小的孔成为孔105。
盖材101以在组装时朝向基材104的面具有凸部的方式成型。例如也可以通过使用成型模具对热塑性树脂的流体进行成型，成型为具有凸部的板状。在图2所示的器件100中，在盖材101形成有输液口102和废液口103，但不限定于此，也可以不形成输液口102和废液口103中的至少一方。
当盖材101和基材104如上述那样成型后，以盖材101的凸部与基材104中的孔105开口的一侧的面接触的方式重叠盖材101和基材104。进而，在盖材101与基材104如上所述重叠的状态下，通过激光熔融粘合等进行熔融粘合。
以下，对各工序进行详细说明。
(导入工序)
在本工序中，使含有靶核酸的液体与器件接触，将靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入孔内。将靶核酸“导入”孔是指向孔阵列的各孔分配靶核酸。
更具体而言，在本实施方式中使用器件100的情况下，如图2所例示的，可以将以每1孔为1分子以下的靶核酸进入器件100的孔105的方式稀释而成的试剂液107(即含有靶核酸的液体)从盖材101的输液口102输液至基材104与盖材101之间的流路106。输液至基材104与盖材101之间的流路106的试剂液107收容于大量的孔105的内部。
靶核酸也可以分散于液体中。作为使靶核酸分散的液体，可以使用在使用上述的器件进行的生化分析中使用的通常的液体，优选为水性溶液。为了易于将液体封入孔内，水性溶液也可以含有表面活性剂等。另外，也可以含有后述的提取靶核酸的工序、检测靶核酸的工序中所需的试剂等。例如，在靶核酸的检测使用ICA反应的情况下，使靶核酸分散的液体中可以含有等位基因探针、ICA寡核苷酸、Flap核酸内切酶-1(FEN-1)和荧光底物等ICA反应试剂。
将靶核酸导入孔中的手段没有特别限定，可以选择与所选择的靶核酸相应的适当的手段。或者，利用可捕获靶核酸的物质(捕获物)，使捕获物与难以通过自重沉降的靶核酸结合而进行输液，或者预先使捕获物固定于孔中，捕获被输液的靶核酸，由此也能够提高导入效率。
在导入工序中，以每1孔为1分子以下的方式导入靶核酸。即，在1个孔中导入0分子或1分子的靶核酸。“以每1孔为1分子以下的方式导入靶核酸”是指使全部孔成为导入1分子的第一核酸、1分子的第二核酸及1分子的双链核酸中的1个的孔、和不导入第一核酸、第二核酸及双链核酸中的任一个的孔中的任一状态。由此，能够以1个单位(1分子单位)进行靶核酸的检测，即能够进行数字测量。另外，不需要向孔阵列的所有孔中导入靶核酸。
本说明书中，作为靶核酸的具体例，可举出DNA、RNA、miRNA、mRNA及人工核酸等。靶核酸可以是人工合成的核酸，也可以是从生物试样分离的核酸。作为生物试样，例如可举出人细胞、血液、淋巴液、组织间液、体腔液、消化液、汗、泪液、鼻涕、尿、精液、阴道液、羊水、乳汁及培养细胞等。
靶核酸的长度没有特别限定，优选为10个碱基～1000个碱基，更优选为30个碱基～300个碱基。在靶核酸为血液中的cfDNA的情况下，优选为100个碱基～200个碱基。
靶核酸也可以是将从生物试样分离的核酸链片段化而成的核酸。核酸链的片段化可以使用例如DNA片段化装置(例如Covaris、M&S Instruments公司)来进行。
靶核酸也可以是已知与疾病相关的核酸序列。例如，也可以是包含已知在癌症患者中具有突变区域的核酸序列。具体而言，可举出人EGFR(表皮生长因子受体)基因位点的一部分碱基序列、人VEGF(血管内皮生长因子)基因位点的一部分碱基序列等。作为在人EGFR(表皮生长因子受体)基因位点的一部分碱基序列中产生突变的一例，可举出T790M。
在本实施方式中，靶核酸含有第一核酸和作为第一核酸的互补链的第二核酸。第一核酸的序列和第二核酸的序列可以是全部序列互补，也可以是一部分序列不互补。例如，第一核酸的序列与第二核酸的序列中，相对于更长链的全部碱基序列的1％～20％的碱基可以错配。
在含有靶核酸的液体中可以含有单链状态的第一核酸、单链状态的第二核酸、以及双链状态的第一核酸与第二核酸互补地结合而成的核酸。
双链核酸可以是双链完全互补，也可以是一部分序列不互补。例如在双链核酸中，相对于更长链的全部碱基序列的1％～20％的碱基可以错配。另外，双链核酸可以是DNA、RNA、miRNA、mRNA和人工核酸中的同一种类的双链，也可以是不同种类的双链。作为不同种类的双链的例子，可举出DNA链和RNA链的双链以及DNA链和人工核酸链的双链等。
在本实施方式中，“1分子的第一核酸”是指1个单链的第一核酸，“1分子的第二核酸”是指1个单链的第二核酸。另外，“1分子的第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸”是指第一核酸与第二核酸互补地结合而成的1个双链核酸。
(封闭工序)
在本工序中，以靶核酸不会在大量孔间移动的方式封闭孔。作为进行封闭的手段，没有特别限定，例如，可以在导入到孔中的液体的上层形成封闭液的层，将液体封入孔内，在孔中形成液体的微小液滴。
例如，更具体而言，在本实施方式中使用器件100的情况下，如图3所示，从盖材101的输液口102向基材104与盖材101的流路106输液封闭液201、例如油性的油而将大量的孔105分别地封闭。在封闭工序中，封闭液201置换在上述输液工序中被输液至基材104与盖材101的流路106的试剂液107中未被收容于孔105的试剂液107。由此，封闭液201将大量的孔105分别封闭，孔105成为独立的反应空间(微小分区202)。
封闭工序后的各个孔105中存在1分子以下的靶核酸。在作为靶核酸存在双链核酸的孔105中，双链核酸不会因变性而解离为单链，而是以双链的状态封闭在孔中。
上述的封闭液201是能够以导入至大量的孔的液体(试剂液107)彼此不相互混合的方式分别地封闭而形成液滴(微小液滴)的液体，优选为油性溶液，更优选为油。作为油，可以使用氟系油、硅酮系油、烃系油、或它们的混合物等，例如可以使用Sigma公司制的商品名“FC-40”等。
只要能够以靶核酸不会在大量孔间移动的方式封闭孔，则在本实施方式中使用的器件也可以不具有流路。在使用这样的器件的情况下，例如，也可以从上方向收容有含有靶核酸的液体的各孔滴加油，将各孔中的液体封闭。
另外，本实施方式中使用的器件只要能够使靶核酸不在大量的孔间移动，则也可以是不具有盖材和流路的微孔板。在使用这样的器件的情况下，也可以在将含有靶核酸的液体导入孔之后，从上方使板部件密合而将孔开口部封闭。
另外，在使用不具有盖材和流路的微孔板的情况下，为了使靶核酸不会在大量的孔间移动，也可以在将含有靶核酸的液体导入孔之后，除去孔板上的剩余的液体。例如，孔板上的剩余的液体可以用刮板除去，也可以用吸引器吸引除去。
也可以在封闭工序后、信号放大工序前，使存在于分别封闭的孔中的双链核酸变性。变性的条件可以根据信号放大工序中使用的酶的耐热性来适当设定。变性温度可以为55℃～99℃，优选为70℃～99℃。达到变性温度的升温时间可以为25秒～90秒，优选为30秒～60秒。在变性温度下的保持时间可以为10秒～40秒，优选为30秒～40秒。
变性条件下的变性温度、达到变性温度的升温时间和保持时间可以任意组合上述范围。例如，也可以用25秒～90秒从室温(例如25℃)升温至变性温度55℃～99℃，在变性温度下保持10秒～40秒，由此使双链核酸变性。
在后述的信号放大工序中靶核酸被加热、能够进行双链核酸的变性的情况下，也可以在信号放大工序前不进行双链核酸的变性。
(信号放大工序)
在本工序中，在孔内进行来自靶核酸的信号的放大，使来自靶核酸的信号放大至能够检测的水平。
例如，在本实施方式中使用器件100的情况下，如图4所例示的，在孔105内进行使信号放大的反应，成为在包含靶核酸的孔105内封入有发出信号的微小溶液301的状态。
作为在本工序中放大的信号，没有特别限定，例如可举出荧光、化学发光、显色、电位变化和pH变化等。
信号放大反应例如可以是生化反应，更具体而言，可以是酶反应。作为一个例子，信号放大反应是将在孔内收容有含有用于信号放大的酶的试剂液的器件维持在能够得到所期望的酶活性的一定温度条件下的等温反应。该一定温度条件是指例如在60℃以上且99℃以下、优选为约66℃下维持例如至少10分钟、优选为约15分钟。
作为信号放大反应的例子，具体而言，可举出Invader(注册商标)法等ICA反应等。
作为信号放大反应，特别优选使用ICA反应(例如参照国际公开第2009/054474号)。这与ICA反应的原理相关，即通过(1)核酸彼此的互补结合和(2)利用酶进行的三重链结构的识别和剪切这2个反应的循环来进行信号放大。在这样的信号放大反应中，由除靶核酸以外的夹杂物引起的反应循环阻碍的影响小。因此，即使在微小分区内存在除靶核酸以外的各种成分的情况下，通过使用ICA反应，也能够高精度地检测靶核酸。例如，当将ICA反应用于信号放大反应时，用于将靶核酸导入孔中的液体(使靶核酸分散的液体)含有ICA反应所需的反应试剂和靶核酸。在信号放大工序中的生化反应为ICA反应的情况下，通过由等温反应进行的酶反应，在孔中存在靶核酸的情况下，荧光物质从消光物质游离，由此与激发光对应地发出特定的荧光信号。
或者，靶核酸的检测也可以通过使与靶核酸序列特异性结合的物质(特异性结合物质)与靶核酸结合，并检测所结合的特异性结合物质来进行。
作为特异性结合物质，可以使用与后述的针对靶核酸的特异性结合物质同样的物质，例如抗体、抗体片段、多肽或适配体等。在信号放大工序为ICA反应的情况下，作为特异性结合物质，可以使用FLAP探针和侵入探针等。作为FLAP探针和侵入探针，可以使用以能够识别第一核酸和第二核酸的方式使用公知的方法制作的探针。
第一特异性结合物质与第一核酸的Tm(也称为熔解温度)和第二特异性结合物质与第二核酸的Tm之差优选为10℃以下。如果第一特异性结合物质与第一核酸的Tm和第二特异性结合物质与第二核酸的Tm之差为10℃以下，则能够在ICA反应等等温反应中检测第一核酸和第二核酸这两者。
在本工序中，来自第一核酸的第一信号和来自第二核酸的第二信号被放大。第一信号与第二信号不同。更具体地，在信号放大工序中的生化反应为ICA反应的情况下，针对第一核酸的FLAP探针和侵入探针与单链的第一核酸或通过双链核酸的解离而产生的第一核酸结合。另外，针对第二核酸的FLAP探针和侵入探针与单链的第二核酸、通过双链核酸的解离而产生的第二核酸结合。
第一信号和第二信号可以是发光信号。在第一信号和第二信号为发光信号的情况下，第一信号的波长与第二信号的波长不同。更具体而言，在信号放大工序为ICA反应的情况下，通过使用发出互不相同的荧光的2种荧光物质，能够使第一信号的波长与第二信号的波长不同。即，当使用用于第一核酸的检测的第一荧光物质和发出与第一荧光物质不同波长的荧光的用于第二核酸的检测的第二荧光物质时，能够分别放大第一信号和第二信号。
(检测工序)
在本工序中，检测在信号放大工序中放大的信号。信号的检测方法可以根据所检测的信号的种类选择公知的适当方法。例如，在明视野中进行检测的情况下，例如对设置有孔阵列的基材沿垂直方向照射白色光。在检测荧光信号的情况下，例如，从孔的底侧向孔内照射与荧光物质对应的激发光，检测荧光物质所发出的荧光。在本工序中，例如，也可以拍摄并保存孔阵列的整体或一部分的图像，进行基于计算机系统的图像处理。
在本实施方式中，在导入工序中如上所述，各孔所含的靶核酸是仅1分子的第一核酸、仅1分子的第二核酸、仅第一核酸与第二核酸互补地结合而成的1分子的双链核酸中的任一种。另外，也可以存在不含靶核酸的孔。
因此，从各孔中是仅检测到第一信号、仅检测到第二信号、同时检测到第一信号和第二信号、还是没有检测到信号中的任一种。
换言之，对于仅检测到第一信号的孔，可以判定为仅存在单链状的第一核酸，对于仅检测到第二信号的孔，可以判定为仅存在单链状的第二核酸，对于同时检测到第一信号和第二信号的孔，可以判定为存在第一信号与第二信号互补地结合而成的双链核酸。
(计数工序)
本实施方式的检测方法还可以具有对检测到信号的孔的数量进行计数的计数工序。
更具体而言，在计数工序中，可以分别对仅检测到第一信号的孔的数量、仅检测到第二信号的孔的数量、以及同时检测到第一信号及第二信号的孔进行计数。
由此，能够分别算出仅存在单链状的第一核酸的孔的数量、仅存在单链状的第二核酸的孔的数量、存在第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸的孔的数量。
因此，能够算出被分配到孔中的含有靶核酸的液体中的第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链在单链状的第一核酸和第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸中的比例。
在本实施方式的液体中的靶核酸的检测方法中，可以使用具备导入靶核酸的器件、在检测工序中使用的光源、以及用于检测信号的检测器的一体的装置。该装置还可以进一步具有处理检测信号的图像等并算出上述靶核酸的比例的处理部。
在本实施方式的液体中的靶核酸的检测方法中，也可以使用具有承载导入靶核酸的器件的收容装置、在检测工序中使用的光源装置、以及检测检测信号的检测装置的系统。该系统还可以进一步具有处理检测信号的图像等并算出上述靶核酸的比例的处理装置。
在1个实施方式中，本发明提供一种检测方法，其具有：使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，以所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及检测从所述孔发出的所述信号的工序；所述靶核酸含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、以及所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸；在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内；在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号。
根据本实施方式的检测方法，如在实施例中后述的那样，通过检测来自第一核酸的信号，能够区别各孔中是含有第一核酸还是不含有第一核酸。含有第一核酸的孔是含有单链的第一核酸、或含有第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链中的任一种。其结果，如在实施例中后述的那样，能够准确地定量液体中所含的单链的第一核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链核酸的合计的分子数。
本发明的另一个方面包括以下的方式。
[18]一种检测方法，其具有：使含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、和所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸作为靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，以所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，在所述进行封闭的工序后使所述双链核酸变性的工序，在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及检测从所述孔发出的所述信号的工序；在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内；在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与所述第二核酸结合而发出第二信号，所述第一信号与所述第二信号不同。
[19]根据[1]所述的检测方法，其中，所述第一信号和所述第二信号为发光信号，所述第一信号的波长与所述第二信号的波长不同。
[20]根据[1]或[2]所述的检测方法，其中，所述放大信号的工序通过侵入裂解反应进行。
[21]根据[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其中，在所述进行检测的工序中，对于仅检测到所述第一信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第一核酸，对于仅检测到所述第二信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第二核酸，对于同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔，判定为存在所述双链核酸。
[22]根据[1]～[4]中任一项所述的检测方法，其还具有对在所述进行检测的工序中检测到所述信号的所述孔的数量进行计数的工序。
[23]根据[5]所述的检测方法，其中，在所述进行计数的工序中，分别对仅检测到所述第一信号的所述孔的数量、仅检测到所述第二信号的所述孔的数量、以及同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量进行计数。
[24]根据[6]所述的检测方法，其中，根据仅检测到所述第一信号的所述孔的数量和同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量，算出所述液体中的所述双链核酸的数量占单链状的所述第一核酸和所述双链核酸的总数的比例。
[25]根据[1]～[7]中任一项所述的检测方法，其中，所述第一特异性结合物质与所述第一核酸的熔解温度Tm和所述第二特异性结合物质与所述第二核酸的熔解温度Tm之差为10℃以下。
[26]根据[18]～[25]中任一项所述的检测方法，其中，所述放大信号的工序为等温反应。
[27]根据[18]～[26]中任一项所述的检测方法，其中，所述变性的工序和所述放大信号的工序同时进行。
[28]根据[18]～[27]中任一项所述的检测方法，其中，所述变性的工序在比所述放大信号的工序高的温度下进行。
[29]根据[18]～[28]中任一项所述的检测方法，其中，所述变性的工序在比所述放大信号的工序高的温度下进行。
[30]根据[18]～[29]中任一项所述的检测方法，其中，所述变性的工序包括在55℃～99℃下保持10秒～40秒。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实验例1]
(基于ICA法的细胞内核酸的检测)
将包含人EGFR(表皮生长因子受体)基因位点的一部分碱基序列的区域作为靶核酸，进行靶核酸的定量检测。在此，人EGFR的一部分区域是已知在一部分癌症患者中具有突变的区域。在本实验例中，将EGFR基因位点的正义链(序列号7)作为靶核酸。
<DNA样品的制备>
使用DNA提取试剂盒(AllPrep、QIAGEN公司)从所培养的人细胞(HT29)中分离基因组DNA，以成为血中循环DNA的模拟检样的方式，使用DNA片段化装置(Covaris、M&SInstruments公司)将所分离的DNA片段化，作为制备例1的DNA样品。
为了测定经片段化的DNA样品的浓度，在95℃下将DNA样品热变性10分钟后骤冷，进行单链化。刚骤冷后的DNA样品几乎全部处于单链的状态。接着，使用超微量分光光度计(NanoDrop、Thermo Fisher公司)测定骤冷后的DNA样品的吸光度，确认到单链状态下的浓度为1.1fM。即，DNA样品全部为双链核酸时的浓度为0.55fM。
在此，单链状态的靶核酸的浓度是指EGFR基因位点中的正义链的个数与反义链的个数的合计的个数的浓度。另外，双链状态的靶核酸的浓度是指EGFR基因位点中的由正义链和反义链构成的组的个数的浓度。例如，在1个2倍体细胞中，在全部为单链状态的情况下存在4个靶核酸，在全部为双链状态的情况下存在2个靶核酸。
在上述浓度的计算中，首先，根据NanoDrop的吸光度的测定值算出DNA的质量体积浓度。接着，假定3pg的DNA样品包含1个EGFR基因位点的正义链和1个EGFR基因位点的反义链，算出骤冷后的DNA样品中所含的单链状态的靶核酸的浓度。
<核酸检测试剂的制备>
为了进行基于ICA反应的核酸检测，作为核酸检测试剂，制备了ICA反应试剂。本实施例中的ICA反应试剂含有0.5μM等位基因探针1(序列号1)(FLAP探针)、0.1μM InvaderOligo 1(序列号2)(侵入探针、也称为ICA寡核苷酸)(以上来自Fasmac公司)、4μM FRETCassette(Alexa488-BHQ)(序列号3)(日本Bio Services公司)(荧光底物)、50mM Tris-HCl(pH为7.9)、20mM MgCl2和0.05mg/mL FEN-1。需要说明的是，这些ICA反应试剂中的各成分的浓度是实验例1的ICA反应试剂与DNA样品的混合液中的最终浓度。等位基因探针1和Invader Oligo 1是用于ICA反应的探针，均特异性地识别EGFR基因位点的正义链和反义链中的一个的核苷酸链。
<器件的准备>
用COP(环烯烃聚合物)制作设置有大量微小的孔的基材，贴合COP制的盖材，由此制作器件。每1cm2的孔的总体积为0.93μL。用于测量的总孔数为1000000个。
<反应混合溶液的输液>
向器件输液8μl混合有制备例1的DNA样品和上述ICA反应试剂的溶液，导入各孔。接着，输液200μl FC-40(Sigma公司)作为封闭液，将各孔封闭。
由此，每1孔有1分子以下的DNA被封闭在孔内。即，各孔中，作为靶核酸，是仅包含选自与等位基因探针1互补地结合的单链的第一核酸、作为第一核酸的互补链的单链的第二核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链中的一种，或者不包含靶核酸中的任一种。
<核酸检测反应>
将反应混合溶液输液后的上述器件设置在热板上，在66℃下使其反应25分钟。由此，进行了基于等位基因探针和Invader Oligo的EGFR基因区域的识别、基于FEN-1的等位基因探针的剪切、所释放的等位基因探针片段与FRET Cassette的结合，基于FEN-1的FRETCassette的剪切进展，从Alexa488发出了荧光信号。
<孔的荧光观察>
在66℃下加热25分钟后，用荧光显微镜(BZ-700、KEYENCE公司)使用4倍的物镜、GFP的荧光过滤器，拍摄器件中的各孔的通过核酸检测反应得到的荧光信号的荧光图像。曝光时间设为3000msec。在存在具有包含单核苷酸多态性的EGFR基因区域的靶核酸的孔中，可以观察到来自靶核酸的荧光信号。荧光显微镜观察的结果是，确认了每1cm2有13.7个孔发出荧光。
<浓度的计算>
根据该结果，能够如下算出与等位基因探针互补且包含单核苷酸多态性的DNA的浓度。其中，导入到器件的孔中的液体是将使用NanoDrop测定的试样稀释至20倍而得到的溶液。
浓度＝(13.7个/cm2)÷(6.02×1023)÷0.93μL/cm2×106×20
＝49×10-17(M)
＝0.49(fM)
即，在制备例1的DNA样品中，算出等位基因探针1互补地结合的单链的第一核酸的浓度与第一核酸和第二核酸互补地结合而成的双链的浓度的合计为0.49fM。基于由NanoDrop得到的测定结果，为与制备例1的DNA样品中所含的靶核酸的浓度(0.55fM)同等的测量结果。
[比较例1]
<基于数字PCR法的细胞内核酸的检测>
使用ddPCR QX100和PrimePCR for ddPCR EGFR T790M(Biolad公司)，按照说明书所述的步骤进行DNA样品的浓度测定。DNA样品使用与实验例1相同的制备例1的DNA样品。
与上述实验例1同样地，将每1孔有1分子以下的DNA封闭在孔内。即，各孔中，作为靶核酸，是仅包含选自第一核酸、作为第一核酸的互补链的单链的第二核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链中的一种，或者是不包含靶核酸中的任一种。
在数字PCR中，从仅包含单链的第一核酸的孔、仅包含作为第一核酸的互补链的单链的第二核酸的孔、以及仅包含第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链的孔的全部中检测信号。
基于数字PCR的测定结果是，算出制备例1的DNA样品中所含的单链的第一核酸的浓度、单链的第二核酸、单链的第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链的浓度的合计为1fM。
根据使用了NanoDrop的结果，确认了制备例1的DNA样品中所含的几乎全部处于单链的状态的靶核酸的合计浓度为1.1fM。另外，根据比较例1的结果，单链的第一核酸的浓度、单链的第二核酸、单链的第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链的浓度的合计为1fM。由该结果可知，制备例1的DNA样品中所含的靶核酸大部分处于单链的状态。
另一方面，由实验例1的结果可知，等位基因探针1互补地结合的单链的第一核酸的浓度为0.49fM。在制备例1的DNA样品中，可知第一核酸的浓度为大部分处于单链的状态的靶核酸的合计浓度的约一半。
[实验例2]
将实验例1中说明的EGFR基因位点的正义链和1个EGFR基因位点的反义链作为靶核酸，进行靶核酸的定量检测。
<DNA样品的制备>
使用DNA提取试剂盒(AllPrep、QIAGEN公司)从所培养的人细胞(HT29)中提取基因组DNA。利用M&S Instruments公司的委托服务(DNA Shearing Service，DNA剪切服务)，将所提取的基因组DNA破碎至150bp。使用离心干燥机(DNA SpeedVac、Thermo FisherScientific公司)使破碎后的基因组DNA溶液1.3ml蒸发液体后，加入蒸馏水100μl，作为制备例2的DNA样品。
测定DNA样品的吸光度，确认了单链状态下的浓度为1.0fM。即，假设DNA样品全部为双链核酸时的浓度为0.5fM。
<核酸检测试剂的制备>
为了进行基于ICA反应的核酸检测，作为核酸检测试剂，制备了ICA反应试剂。本实施例中的ICA反应试剂含有0.5μM等位基因探针1(序列号1)(FLAP探针)、0.1μM InvaderOligo 1(序列号2)(侵入探针、也称为ICA寡核苷酸)、0.2μM等位基因探针2(序列号4)(FLAP探针)、5nM Invader Oligo 2(序列号5)(侵入探针)(以上来自Fasmac公司)、4μM FRETCassette(Alexa488-BHQ)(序列号3)(日本Bio Services公司)(荧光底物)、2μM FRETCassette(Redmond Red-Epoch Eclipse Quencher)(序列号6)(TSUKUBA OLIGO SERVICE公司)(荧光底物)50mM Tris-HCl(pH为7.9)、20mM MgCl2和0.05mg/mL FEN-1。需要说明的是，这些ICA反应试剂中的各成分的浓度是实验例2的ICA反应试剂与DNA样品的混合液中的最终浓度。等位基因探针1、Invader Oligo 1、等位基因探针2和Invader Oligo2是用于ICA反应的探针。等位基因探针1及Invader Oligo 1特异性地识别EGFR基因位点的正义链及反义链中的一个的核苷酸链，等位基因探针2及Invader Oligo 2特异性地识别EGFR基因位点的正义链及反义链的另一个的核苷酸链。
<器件的准备和反应混合液的输液>
使用实验例1中记载的器件，按照与实验例1相同的步骤进行反应混合溶液的输液。
<核酸检测反应>
将反应混合溶液输液后的上述器件设置在热板上，在66℃下使其反应25分钟。由此，进行了基于等位基因探针和Invader Oligo的EGFR基因区域的识别、基于FEN-1的等位基因探针的剪切、所释放的等位基因探针片段与FRET Cassette的结合，基于FEN-1的FRETCassette的剪切进展，从Alexa488和Redmond Red发出了荧光信号。
<孔的荧光观察>
在与实验例1相同的条件下，拍摄器件中的各孔的通过核酸检测反应得到的荧光信号的荧光图像，其结果是，仅检测到来自Alexa488的荧光信号的孔数为508个，仅检测到来自Redmond Red的荧光信号的孔为429个，检测到Alexa488和Redmond Red这两者的荧光信号的孔为3个。
仅检测到来自Alexa488的荧光信号的孔表示其为仅存在EGFR基因位点的正义链和反义链中的一个的孔。仅检测到来自Redmond Red的荧光信号的孔表示其为仅存在EGFR基因位点的正义链及反义链中的另一个的孔。检测到Alexa488和Redmond Red这两者的荧光信号的孔表示其为在封闭于孔内的时点存在EGFR基因位点的正义链和反义链的双链核酸的孔。
需要说明的是，对于检测到Alexa488和Redmond Red这两者的荧光信号的孔，也考虑EGFR基因位点的正义链和反义链这两者偶然被封闭在1个孔的可能性，但考虑到器件的总孔数为924890个、其中检测到荧光信号的孔的个数为上述值时，认为其可能性显著低。即，可以认为检测到Alexa488和Redmond Red这两者的荧光信号的孔不是EGFR基因位点的正义链和反义链这两者偶然被封闭在1个孔的孔，而是在被封闭在孔内的时点存在EGFR基因位点的正义链和反义链的双链核酸的孔。
由实验例2的结果可知，通过除了针对第一核酸的探针以外，还适当设计使用针对第二核酸的探针，能够分别检测含有单链的第一核酸、单链的第二核酸、以及第一核酸与第二核酸互补地结合而成的双链的孔。基于该结果可知，能够利用实验例1中记载的计算方法分别对分子数和浓度进行定量。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供能够更高精度地对单链的核酸和双链的核酸区别地进行定量的技术。
符号说明
1 单链核酸
2 单链核酸
3 双链核酸
4、5、6、7 液滴
11 第一核酸
12 第二核酸
13 双链核酸
14、15、16、17、18、19 液滴
100 器件
101 盖材
102 输液口
103 废液口
104 基材
105 孔
106 流路
107 试剂液
108 填充在孔中的试剂液
201 封闭液
202 微小分区
301 发出信号的微小溶液
Figure IDA0003717503430000011
Figure IDA0003717503430000021
Figure IDA0003717503430000031

Claims (9)

1.一种检测方法，其具有：
使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，
以所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，
在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及
检测从所述孔发出的所述信号的工序；
所述靶核酸含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、以及所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸，
在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内，
在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号，第二特异性结合物质与所述第二核酸结合而发出第二信号，
所述第一信号与所述第二信号不同。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
所述第一信号和所述第二信号为发光信号，
所述第一信号的波长与所述第二信号的波长不同。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，
所述放大信号的工序通过侵入裂解反应进行。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，
在所述进行检测的工序中，
对于仅检测到所述第一信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第一核酸，
对于仅检测到所述第二信号的所述孔，判定为仅存在单链状的所述第二核酸，
对于同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔，判定为存在所述双链核酸。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其还具有：
对在所述进行检测的工序中检测到所述信号的所述孔的数量进行计数的工序。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，
在所述进行计数的工序中，分别对仅检测到所述第一信号的所述孔的数量、仅检测到所述第二信号的所述孔的数量、以及同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量进行计数。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，
根据仅检测到所述第一信号的所述孔的数量和同时检测到所述第一信号和所述第二信号的所述孔的数量，算出所述液体中的所述双链核酸的数量占单链状的所述第一核酸和所述双链核酸的总数的比例。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其中，
所述第一特异性结合物质与所述第一核酸的熔解温度Tm和所述第二特异性结合物质与所述第二核酸的熔解温度Tm之差为10℃以下。
9.一种检测方法，其具有：
使含有靶核酸的液体与具有孔阵列的器件接触，所述孔阵列具有大量的孔，将所述靶核酸以每1孔为1分子以下的方式导入所述孔内的工序，
以所述靶核酸不会在大量的所述孔间移动的方式封闭所述孔的工序，
在所述孔内放大来自所述靶核酸的信号的工序，以及
检测从所述孔发出的信号的工序；
所述靶核酸含有第一核酸、作为所述第一核酸的互补链的第二核酸、以及所述第一核酸与所述第二核酸互补地结合而成的双链核酸，
在所述进行封闭的工序中，所述双链核酸以双链的状态封闭在所述孔内，
在所述放大信号的工序中，第一特异性结合物质与所述第一核酸结合而发出第一信号。
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