CN116218963A - 关联靶的数字测定 - Google Patents

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CN116218963A CN202310178473.XA CN202310178473A CN116218963A CN 116218963 A CN116218963 A CN 116218963A CN 202310178473 A CN202310178473 A CN 202310178473A CN 116218963 A CN116218963 A CN 116218963A
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亚当·M·麦考伊
尼尔斯·克里特戈德
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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Abstract

本申请涉及关联靶的数字测定。用于执行关联靶的数字测定的系统，包括方法、设备和组合物。在某些实施方案中，对分区中的关联靶的分析可以降低检测限值(LOD)或以其他方式增加分析灵敏度、精确度和/或特异性。靶可以表示相同模板的隔开或重叠的区域和/或每种靶可以表示来自相同模板的不同互补链的区域。在某些实施方案中，关联靶可以由一种类型的生物粒子提供，并且，分区的靶含量可用于鉴定和定量样本中的生物粒子的类型。

Description

关联靶的数字测定
本申请是申请日为2014年03月17日，申请号为201480028178.5，发明名称为“关联靶的数字测定”的申请的分案申请。
优先权申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请基于并要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/791801和2013年11月27日提交的美国临时专利申请序列号61/909776的权益。这些优先权申请中的每一个的全部内容被为了所有目的通过引用并入本文。
其他材料的交叉引用
本申请为了所有目的通过引用并入下列材料的全部内容：2006年5月9日颁布的美国专利号7,041,481；2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394A1；2011年9月8日公布的美国专利申请公布号2011/0217712A1；2012年6月21日公布的美国专利申请公布号2012/0152369A1；2013年2月14日公布的美国专利申请公布号2013/0040841A1；2013年12月6日提交的美国专利序列号14/099,750；2014年2月3日提交的美国专利申请序列号14/171,754；2014年2月3日提交的美国专利申请序列号14/171,761；2014年2月26日提交的美国专利申请序列号14/191,295；以及Joseph R.Lakowicz的PRINCIPLES OF FLUORESCENCESPECTROSCOPY(第二版，1999)。
技术领域
本申请涉及但不限于关联靶的数字测定。
引言
数字测定通常依靠检测样本中分析物的独立拷贝的存在或活性的能力。在示例性数字测定中，样本被分成大体上相等体积的分区的组，每个分区平均包含少于约一个拷贝的分析物。如果分析物的拷贝在分区中随机分布，则某些分区应不包含任何拷贝，而其他分区仅包含一个拷贝，并且，如果分区的数目足够大，又有其他分区应包含两个拷贝、三个拷贝和甚至更多数目的拷贝。基于分区中分析物的给定平均浓度，在一个分区中准确地发现0个、1个、2个、3个或更多个拷贝的概率通过泊松分布来描述。相反，分区中分析物的浓度(且由此在样本中的浓度)可以由一个分区中发现给定数量的拷贝的概率来估算。
未发现拷贝和发现一个或更多个拷贝的概率的估值可以在数字测定中测量。可检验每个分区以确定该分区是包含至少一个拷贝的分析物的阳性分区，还是不包含分析物的拷贝的阴性分区。在分区中没有发现拷贝的概率可通过阴性的被测试分区的分数(“阴性分数”)估计，而发现至少一个拷贝的概率通过阳性的被测试分区的分数(“阳性分数”)估计。阴性分数或阳性分数随后可以用于通过诸如泊松统计法确定分区中的分析物的浓度。
数字测定往往依赖分区中核酸靶的扩增以能够检测分析物的单个拷贝。扩增可以经由聚合酶链式反应(PCR)进行，以实现数字PCR分析。靶的扩增可由报告物诸如包含在反应中的荧光探针通过光学来检测。具体地，探针可以包括提供指示靶是否已被扩增的荧光信号的荧光团。
概述
本公开提供用于执行关联靶的数字测定的系统，包括方法、设备和组合物。在某些实施方案中，对分区中的关联靶的分析可以降低检测限值(LOD)或以其他方式增加分析灵敏度、精确度和/或特异性。靶可以表示相同模板的隔开或重叠的区域和/或每种靶可以表示来自相同模板的不同互补链的区域。在某些实施方案中，关联靶可以由一种类型的生物粒子提供，并且，分区的靶含量可用于鉴定和定量样本中的生物粒子的类型。
本申请提供了以下各项：
1.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：
形成分区，每个分区包括样本的一部分，所述样本包含与第二靶相关联的第一靶；
收集指示每种靶在各个分区中的存在或不存在的数据；
基于所述数据将多个分区中的每个分区分类为对于每种靶为阳性或阴性的，其中，在所述数据中具有仅指示所述第一靶的存在的分区被分类为对于两种靶为阴性的；和
确定所述第一靶的水平。
2.根据第1项所述的方法，其中，在所述数据中具有仅指示所述第二靶的存在的分区被分类为对于两种靶为阴性的。
3.根据第1项所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％与所述第二靶相关联。
4.根据第3项所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％共价连接至所述第二靶。
5.根据第1项所述的方法，其中，所述分类步骤包括将在所述数据中具有指示至少一种靶的不存在的至少大多数分区分类为对于所述两种靶为阴性的步骤。
6.根据第5项所述的方法，其中，所述分类步骤包括将在所述数据中具有指示至少一种靶的不存在的每个分区分类为对于所述两种靶为阴性的步骤。
7.根据第1项所述的方法，其中，确定水平的步骤基于被分类的分区的总数的第一值和被分类为对于所述两种靶为阳性的分区的数量的第二值或被分类为对于所述两种靶为阴性的分区的数量的第二值。
8.根据第7项所述的方法，其中，所述确定步骤包括从所述第一值和所述第二值计算所述第一靶的水平的步骤。
9.根据第8项所述的方法，其中，所述计算水平的步骤基于泊松统计。
10.根据第8项所述的方法，其中，所述水平是每分区的拷贝的平均数。
11.根据第1项所述的方法，其中，所述分区是液滴。
12.根据第1项所述的方法，其中，所述数据指示具有所述第一靶的存在的分区多于具有所述两种靶的存在的分区。
13.根据第12项所述的方法，其中，所述数据指示具有所述第二靶的存在的分区多于具有所述两种靶的存在的分区。
14.根据第1项所述的方法，还包括绘制所述数据的至少一部分以形成图的步骤，其中，所述分类步骤至少部分地基于数据点的簇在所述图中的位置。
15.根据第1项所述的方法，其中，收集数据的步骤包括获得对于每个分区的一个或更多个信号值的步骤，其中，所述分类步骤包括比较对于每个分区的所述一个或更多个信号值与分类所述分区的一个或更多个阈值或范围值的步骤。
16.根据第1项所述的方法，其中，所述水平是指示所述第一靶是否高于背景存在的存在或不存在。
17.根据第1项所述的方法，其中，所述样本包含生物粒子，并且其中，当形成所述分区时，所述第一靶和所述第二靶被所述生物粒子包含。
18.根据第17项所述的方法，其中，所述生物粒子选自由生物细胞、病毒和细胞器组成的组。
19.根据第1项所述的方法，其中，确定水平的步骤包括(a)基于指示具有每种靶的单独存在的分区的相应计数计算假双阳性的预期数量的步骤，以及(b)比较假双阳性的预期数量和观察到的双阳性的计数以确定观察到的双阳性的计数是否显著大于假双阳性的预期数量的步骤。
20.根据第1项所述的方法，其中，所述第一靶是第一靶序列且所述第二靶是第二靶序列，并且其中，所述样本包括包含所述第一靶序列和所述第二靶序列的模板，并且其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列在所述模板中至少部分地彼此重叠。
21.根据第20项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列重叠以定义重叠区域，并且其中，所述重叠区域包括提供所述靶的分类学种的至少一个序列变异位点。
22.根据第1项所述的方法，其中，所述至少一个序列变异位点包括单核苷酸多态性。
23.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：
形成分区，所述分区仅在所述分区的亚组中包含至少一个拷贝的模板，所述模板包含第一靶序列和第二靶序列；
扩增所述分区中的第一靶序列和第二靶序列；
收集扩增所述分区中的第一靶序列和第二靶序列的数据；
处理所述数据，使得如果特定的分区对两种靶检验是阳性的，则所述分区被分类为对于两种靶是阳性的，并且如果特定的分区对两种靶中的任一种或两者检验是阴性的，则所述分区被分类为对于两种靶是阴性的；和
基于所处理的数据来确定所述第一靶的浓度。
24.根据第23项所述的方法，其中，单个拷贝的所述模板具有彼此互补的第一链和第二链，并且其中，所述第一靶序列能从所述第一链选择性扩增，而所述第二靶序列能从所述第二链选择性扩增。
25.根据第24项所述的方法，其中，所述分区包括参与扩增所述第一靶序列的发光团标记的引物。
26.根据第25项所述的方法，其中，所述发光团标记的引物包括发夹结构。
27.根据第24项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列重叠以定义重叠区域，并且其中，所述重叠区域包括对于提供所述靶的生物学种的至少一个序列变异位点。
28.根据第27项所述的方法，其中，所述至少一个位点是单核苷酸多态性。
29.根据第27项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列分别用第一对引物和第二对引物扩增，其中，所述第一对引物和所述第二对引物中的每一对在各自引物的3’端的三个核苷酸内与基因变异位点重叠。
30.根据第29项所述的方法，其中，所述第一对引物结合与所述第二对引物不同的所述模板的链，以形成具有至少一个内部错配的碱基配对结构。
31.根据第30项所述的方法，其中，所述碱基配对结构具有至少两个内部错配。
32.根据第23项所述的方法，其中，所述扩增步骤产生对应于所述第一靶序列的第一扩增子和对应于所述第二靶序列的第二扩增子，并且其中，每个扩增子具有小于所述模板的长度的四分之一的长度。
33.根据第23项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列对应于所述模板的彼此隔开大于每种靶序列的长度的区域。
34.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：
提供包含单链第一模板和具有第一链和第二链的双链第二模板的分区，所述第一模板和所述第二模板各自仅存在于所述分区的亚组中，所述第一模板和所述第一链各自包括第一靶序列且所述第二链包括第二靶序列；
扩增所述分区中的第一靶序列和第二靶序列；
收集扩增各个分区中的第一靶序列和第二靶序列的数据；以及
基于所述数据确定所述单链第一模板和所述双链第二模板中的每一个的水平。
35.根据第34项所述的方法，其中，所述扩增步骤通过线性扩增生成扩增子。
36.根据第34项所述的方法，其中，所述扩增步骤包括用不太严格的退火温度执行至少一个热循环，之后用较严格的退火温度进行多个热循环的步骤。
37.根据第36项所述的方法，其中，所述第一靶序列用在不太严格的退火温度下结合所述第一模板，但在较严格的退火温度下基本上不结合所述第一模板的引物扩增。
38.根据第37项所述的方法，其中所述引物是具有与所述第一模板的区域互补的3’端区域和基本上不与所述第一模板互补的5’端区域的加尾引物。
39.根据第38项所述的方法，其中，所述5’端区域的长度是至少三个核苷酸。
40.根据第37项所述的方法，其中，当与所述第一模板碱基配对时，所述引物与所述第一模板具有一个或更多个内部错配。
41.根据第34项所述的方法，其中，所述第一模板的第一靶序列和所述第一链的第一靶序列在序列上彼此不同，并且均用相同的一对引物扩增。
42.根据第34项所述的方法，其中，所述第一模板包括cDNA且所述第二模板包括基因组DNA。
43.根据第34项所述的方法，其中，所述第一模板包括RNA且所述第二模板包括DNA。
44.根据第34项所述的方法，其中，所述第一模板包括成熟的miRNA且所述第二模板包括前体-miRNA。
45.一种样本分析的方法，所述方法包括：
提供包括至少两种类型的生物粒子和/或从其制备的核酸的样本，其中，每种类型的生物粒子包含不同的靶组或亚组，所述不同的靶组或亚组包括两种或更多种靶中的至少一种；
形成各自包含所述样本的一部分的分区；
确定多个分区中的每个分区中的所述两种或更多种靶中的每种靶的存在或不存在；和
确定包含两种或更多种靶的特定的靶组或亚组的生物粒子类型的水平。
46.根据第45项所述的方法，还包括在形成分区的步骤后打开生物粒子的步骤。
47.根据第46项所述的方法，其中，所述打开步骤包括加热所述分区的步骤。
48.根据第47项所述的方法，其中，所述加热步骤包括将所述分区加热到至少约50摄氏度的温度的步骤。
49.根据第47项所述的方法，其中，所述加热步骤包括将所述分区加热到至少约90摄氏度的温度的步骤。
50.根据第46项所述的方法，其中，所述打开步骤包括用酶降解部分所述生物粒子的步骤。
51.根据第45项所述的方法，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括包含所述特定的靶组或亚组的类型和至少两种其他类型，并且其中，确定水平的步骤包括，如果存在的话，校正由各个分区中的所述至少两种其他类型的生物粒子或来自其的核酸的每一种的共定位导致的各个分区中的所述特定的靶组或亚组的偶然发生率的步骤。
52.根据第45项所述的方法，其中，所述水平是所述类型的生物粒子在所述样本中的存在或不存在。
53.根据第45项所述的方法，其中，所述水平是浓度，并且其中，所述浓度是每分区的所述类型的生物粒子的平均拷贝数。
54.根据第45项所述的方法，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括至少两种类型的细胞。
55.根据第54项所述的方法，其中，所述至少两种类型的细胞包括至少两种类型的细菌细胞。
56.根据第55项所述的方法，其中，所述细菌细胞包括葡萄球菌细胞。
57.根据第56项所述的方法，其中，至少一种所述靶表示甲氧西林抗性。
58.根据第45项所述的方法，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括至少两种类型的病毒粒。
59.根据第45项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶选自由核酸序列、代谢产物和蛋白质组成的组。
60.根据第45项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶中的至少一种是由RNA提供的靶序列。
61.根据第60项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶中的每一种是由RNA提供的靶序列。
62.根据第60项所述的方法，还包括在形成分区的步骤后从所述RNA生成互补DNA的步骤。
63.根据第62项所述的方法，还包括扩增所述互补DNA的序列的步骤。
64.根据第62项所述的方法，其中，生成互补DNA的步骤用具有逆转录酶活性的酶来执行。
65.根据第45项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶包括第一靶和第二靶，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括，包含所述第一靶而不包含所述第二靶的类型，包含所述第二靶而不包含所述第一靶的类型，以及包含所述第一靶和所述第二靶两者的类型，并且其中，确定一种类型的生物粒子的水平的步骤包括确定包含所述第一靶和所述第二靶的类型的水平的步骤。
66.根据第65项所述的方法，其中，包含所述第一靶和所述第二靶的类型和包含所述第一靶而不包含所述第二靶的类型属于相同分类单元，所述相同分类单元不包括包含所述第二靶而不包含所述第一靶的类型。
67.根据第66项所述的方法，其中，所述分类单元是属或种。
68.根据第45项所述的方法，其中，所述靶中的至少一种是包括核糖体RNA或DNA序列的核酸序列。
69.根据第68项所述的方法，其中，所述核糖体RNA或DNA序列是选自由以下组成的组的序列：5S核糖体RNA或DNA序列、16S核糖体RNA或DNA序列、18S核糖体RNA或DNA序列、23S核糖体RNA或DNA序列和28S核糖体RNA或DNA序列。
70.根据第68项所述的方法，其中，所述核酸序列是由基因组DNA提供的DNA序列。
71.根据第68项所述的方法，其中，所述核酸序列是由核糖体RNA提供的RNA序列，所述方法还包括扩增从所述RNA序列形成的互补DNA序列的步骤。
72.根据第68项所述的方法，其中，所述至少两种靶中的每一种包括核糖体RNA或DNA序列。
73.根据第72项所述的方法，其中，所述靶中的至少一种包含相对于一个属的其他种，对所述属的特定种特异的核糖体RNA或DNA序列，并且其中，至少一种所述靶包含存在于所述属的多个种中的核糖体RNA或DNA序列。
74.根据第68项所述的方法，其中，所述靶中的至少一种是病原性指示物。
75.根据第45项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶包括两种或更多种种特异性靶的组。
76.根据第45项所述的方法，其中，每个分区平均包含来自每种类型的生物粒子的核酸的少于三个基因组和/或少于三个基因组当量。
77.根据第45项所述的方法，其中，所述形成分区的步骤生成至少1000个分区。
78.根据第45项所述的方法，其中，只有所述分区的亚组包含所述靶中的任一种的至少一个拷贝。
79.根据第45项所述的方法，其中，每种靶包括核酸，所述方法还包括扩增所述分区中的每种靶的步骤。
80.根据第79项所述的方法，其中，所述分区包括对每种靶的扩增共同地敏感的一种或更多种报告物。
81.根据第80项所述的方法，其中，所述分区包括对于每种靶不同的报告物，并且其中，所述不同的报告物只特异性结合所述靶中的一种和/或只结合对应于所述靶中的一种靶的扩增子。
82.根据第80项所述的方法，其中，所述分区包括对每种靶的扩增敏感的相同的通用报告物。
83.根据第80项所述的方法，其中，每种报告物包括核酸、抗体、适体、酶或其组合。
84.根据第45项所述的方法，其中，将所述两种或更多种靶在至少一个分区中的存在或不存在与靶的模式的数据库比较，其中，所述比较鉴定所述至少一个分区中的生物粒子的类型。
85.根据第45项所述的方法，其中，所述生物粒子包括哺乳动物细胞。
86.根据第85项所述的方法，其中，所述靶中的至少一种提供组织鉴定并且所述靶中的至少另一种是肿瘤标志物。
87.根据第86项所述的方法，其中，所述肿瘤标志物是化疗抗性标志物、转移潜能性标志物或异常调节的细胞增殖标志物。
88.根据第85项所述的方法，其中，至少一种靶是表观遗传标志物。
89.根据第88项所述的方法，其中，所述表观遗传标志物通过差异化DNA分裂或化学检测来检测。
90.根据第89项所述的方法，其中，所述化学检测包括重亚硫酸盐转化。
91.根据第89项所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA接触核酸酶。
92.根据第91项所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA接触甲基化特异性核酸酶或甲基化敏感性核酸酶。
93.根据第45项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶包括至少三种靶。
94.根据第45项所述的方法，还包括通过群特异性靶的存在或不存在将所述样本中的一种类型的生物粒子鉴定为群的成员，并通过至少一种种特异性靶的存在或不存在排除所述类型的生物粒子的特定种的步骤。
95.一个组，其包括：
多个分区，每个分区包含相同样本的一部分，并且每个分区具有小于100nL的体积，所述样本包含至少两种类型的生物粒子和/或来自其的核酸，
其中，每种类型的生物粒子包含包括两种或更多种靶中的至少一种的不同的靶组或亚组，所述两种或更多种靶包括存在于多个具有相同分类学等级的多个分类单元中的第一靶和仅存在于所述多个分类单元中的一个分类单元中的第二靶，
其中，只有分区的亚组包含所述靶中的任一种靶的至少一个拷贝，以及
其中，每个分区还包括检测所述第一靶的第一报告物和检测所述第二靶的第二报告物，以及足以扩增每种靶的试剂。
96.根据第95项所述的组，其中，所述第一报告物和所述第二报告物中的每一种特异性结合16S核糖体RNA或DNA序列。
97.根据第95项所述的组，其中，所述多个分区包括至少1000个分区。
98.根据第95项所述的组，其中，每个分区是液滴，所述方法还包括包围所有液滴的连续相。
附图说明
图1是根据本公开的方面的执行关联靶的多重数字测定以降低检测限值或以其他方式增加分析的灵敏度和/或精确度的示例性方法的流程图。
图2是根据本公开的方面的用于执行图1的多重数字测定的示例性系统的示意图。
图3是根据本公开的方面，示出了示例性的、不太灵敏的在包含一种靶(靶A)的分区中进行的单重数字测定的示意图，在分区上方的示例性整体相中展示了靶扩增和检测策略(扩增子的拷贝和降解形式的探针以虚线示出)并在整体相下方示出了示例性真阳性和假阳性分区以及真阴性分区。
图3A是图3的探针的放大图。
图4根据本公开的方面，示出了在分区中对一对连接的靶(靶A和B)进行的示例性的、更灵敏的多重数字测定的示意图，在分区上方的示例性整体相中展示了扩增分区中的靶和用光谱学上不同的探针检测的策略(扩增子的拷贝和降级形式的探针以虚线示出)，并在整体相下方示出了示例性真双阳性(AB)、假双阳性(AB)、假单阳性(A或B)和真双阴性的分区。
图4A是根据本公开的方面的可从图4的多重数字测定的分区中收集的荧光数据的示例性散点图的示意图。
图5是根据本公开的方面，示出用于图4的多重数字测定的另一示例性整体相的示意图，图4的光谱学上不同的探针被光谱学上相似的、可通过扩增后的强度辨别(任选地，至少部分地由于探针浓度的不同和/或两种靶的扩增效率的不同)的探针代替。
图6是根据本公开的方面，示出用于图4的多重数字测定的又一示例性整体相的示意图，图4的光谱学上不同的探针被不同的浓度的光谱学上相似的探针和/或标记有不同量的相同荧光团的探针代替。
图7是根据本公开的方面，示出用于图4的多重数字测定的又一示例性整体相的示意图，图4的光谱学上不同的探针被报告两种靶的扩增的通用报告物(例如，嵌入染料)代替。
图8是根据本公开的方面，示出用于图4的多重数字测定的又一示例性整体相的示意图，两种靶(及其引物)在等位基因变异位点重叠，使得每种靶测定(A或B)是等位基因特异性的，并选择性检测相对于野生型靶的突变靶。
图9是根据本公开的方面，示出用于执行如图8中的一对等位基因特异性测定的另一示例性整体相的示意图，图8的探针和等位基因特异性引物被也充当扩增报告物的标记的等位基因特异性引物代替。
图10根据本公开的方面，示出了用于图9的等位基因特异性测定的示例性的标记的等位基因特异性引物，并示出错配(“X”)如何允许引物选择性结合期望的等位基因模板。
图11是根据本公开的方面的执行单链模板和双链模板的多重数字测定的示例性方法的流程图。
图12是根据本公开的方面，示出用于图11的多重数字测定的示例性整体相的示意图，在整体相中展示了线性扩增分区中的靶和用光谱学上不同的探针检测的策略(单链扩增子的拷贝和降级形式的探针以虚线示出)。
图13是根据本公开的各方面，示出用于图11的多重数字测定的示例性方面的示意图，在整体相(双链扩增子的拷贝和降级形式的探针在虚线中示出)中展示了指数级扩增分区中的靶的策略和用光谱学上不同的探针检测的策略，并在整体相下方被展示为一系列的步骤。
图14是根据本公开的方面示出从整体相形成分区的示意图，所述整体相包括(a)包含三种类型的生物细胞(A、B和C)的样本和(b)用于扩增来自细胞中的核酸的一对不同靶(1和2)的试剂。
图15是根据本公开的方面的荧光强度(FL INT)数据的图，所述数据可在打开(例如，裂解)分区中的细胞并扩增由被打开的细胞提供的来自核酸的靶后从按照图14形成的一组分区的两个光通道(CH1和CH2)中收集。
图16是根据本公开的方面的荧光强度(FL INT)数据的图，所述数据可作为按照图14形成的一组分区的单个光通道中的时间的函数或分区规则的函数收集，但是，图14中的一对序列特异性报告物被一个非特异性报告物诸如嵌入染料代替。
图17是根据本公开的方面，示出从整体相形成分区的示意图，所述整体相包括(a)包含从三种类型的生物细胞(A、B和C)制备的核酸的样本和(b)用于扩增来自所述核酸的一对不同靶的试剂和用于检测所述扩增的试剂。
图18是根据本公开的方面的可以存在于按照本文描述地测定的样本中的不同类生物粒子的示意图，这些类型以相同等级的分类学群(分类单元)排列，并且这些类型的靶含量仅是对于待测定的样本的一对特定靶(靶1和2)示出的。
详述
本公开提供了用于执行关联靶的数字测定的系统，包括方法、设备和组合物。在某些实施例中，对分区中关联靶的分析可以降低检测限值(LOD)或以其他方式增加分析灵敏度、精确度和/或特异性。靶可以表示相同模板的隔开或重叠的区域和/或每种靶可以表示来自相同模板的不同互补链的区域。在某些实施方案中，关联靶可以由一种类型的生物粒子提供，并且，分区的靶含量可用于鉴定和定量样本中的生物粒子的类型。
提供了一种执行数字测定的示例性方法。在该方法中，可以形成分区，每个分区包括包含与第二靶相关联的第一靶的样本的一部分。可以收集指示每种靶在各个分区中的存在或不存在的数据。多个分区中的每个分区可以基于该数据被分类为对于每种靶是阳性还是阴性的。在数据中具有指示仅第一靶的存在的分区可以被分类为对于两种靶是阴性的。可以确定第一靶的水平。
提供了另一种执行数字测定的示例性方法。在该方法中，可以形成分区，其中，只有分区的亚组包含模板的至少一个拷贝。该模板可以包含第一靶序列和第二靶序列。可以扩增分区的第一靶序列和第二靶序列。可以收集对于分区中的第一靶序列和第二靶序列的扩增的数据。可以处理该数据，以使得如果一个给定的分区被测试为对两种靶是阳性的，则该分区被分类为对于两种靶是阳性的，并且如果一个给定的分区被测试为对两种靶中的任一个或两者是阴性的，则该分区被分类为对于两种靶是阴性的。第一靶的浓度可以基于所处理的数据来确定。
又提供了另一种执行数字测定的示例性方法。在该方法中，可以提供分区，每个分区包含单链第一模板和双链第二模板，该双链第二模板具有第一链和第二链。第一模板和第二模板各自可以只存在于分区的亚组中。第一模板和第二链各自可以包括第一靶序列，而第二链可以包括第二靶序列。第一靶序列和第二靶序列可以在分区中被扩增。可以收集对于各个分区中的第一靶序列和第二靶序列的扩增的数据。单链第一模板和双链第二模板中的每个的水平可以基于该数据来确定。
提供了样本分析的示例性方法。在该方法中，可以提供至少包括两种类型的生物粒子和/或来自其的核酸的样本。每种类型的生物粒子可以包含包括由两种或更多种靶中的至少一种靶的不同的靶组或亚组。可以形成分区，每个分区包含样本的一部分。可以确定多个分区中的每个分区中的两种或更多种靶中的每种靶的存在或不存在。可以确定包含两种或更多种靶的特定的靶组或亚组的一类生物粒子的水平。
提供了示例性的组。该组可以包括多个分区，每个分区包含相同样本的一部分，并且每个分区具有小于100nL的体积。该样本可以包含至少两种类型的生物粒子和/或来自其的核酸。每种类型的生物粒子可以包含包括两种或更多种靶中的至少一种靶的不同的靶组或亚组。两种或更多种靶可以包括存在于相同分类学等级的多个分类单元中的第一靶和仅存在于所述等级的一个分类单元中的第二靶。只有的分区的亚组可以包含所述靶中的任一种靶的至少一个拷贝。每个分区也可以包括检测第一靶的至少一种报告物和第二报告物，以及足以扩增每一种靶的试剂。
数字测定可能遇到假阳性的存在，假阳性可以是例如对于实际不存在的靶检测为阳性的分区、检测部分产物的分区，或包含来自除了被测定的样本以外的来源的污染物作为靶的分区。此类假阳性可以降低测定的灵敏度和可靠性。需要新的方法来解决假阳性。
对于特定靶序列或靶细胞/生物体实现可能最低的检测限值(LOD)往往是期望的。数字测定的LOD可以通过对于给定靶的假阳性分区(“假阳性”)的频率(即，假阳性率)来确定。这个频率可以确定真阳性分区(“真阳性”)可以与由假阳性形成的背景噪音可靠地区分开的靶浓度。即使少量的假阳性可能对LOD具有相对大的影响。
很大部分的该问题通常源于使低丰度样本(即，仅包含少量的靶)明显不同于阴性对照的需求。从低丰度样本收集的数据的固有方差(inherent variance)意味着将阴性样本与低丰度样本区分开的能力是不理想的。由于取样误差，低丰度样本的方差是固有地高的。取样误差一般不能从根本上被改变，因此改进LOD的最实际方法是降低假阳性率。测定的设计是产生具有低假阳性率的测定的一个因素。
拉低假阳性率的另一途径是针对相同模板执行包括两种(或更多种)测定的多重测定，并寻找相同分区的共定位以区分真阳性和假阳性。真阳性将产生共定位信号，因为模板包含针对模板的单个拷贝进行的双重测定的靶。这种方法中的有效假阳性率(双假阳性率)应当远远低于单假阳性率。两种测定可以具有独立的假阳性率。因此，当单假阳性的频率是低的时，一个分区对于双重测定是假阳性的概率可能是极其低的。结果，几乎可以消除不依赖模板的假双阳性。这拉低了LOD，因为真阳性(即，双阳性)可以更容易地与假阳性区分开。
在轮流交替的靶分子诸如待标准化的人体基因组DNA可以在隔开的孔中取样的对稀有靶的分析中，本文公开的方法可能是特别有用的。这种方法具有用于诊断以及基础研究的可能性。该方法对于其中测定设计空间使得难以设计具有内在的低假阳性率的单一测定的应用可能是特别有用的。
由于分析失败或DNA降解，可能存在假阴性率。当计算靶水平时，这可以单独测量和考虑，或以其他方式补偿。
存在对这种可能对特定应用有利的方法的几种特定变化形式。连接的靶的两种靶测定的使用可有助于将真阳性(由被测定的样本中的模板提供)与由部分模板，例如，来自除样本以外的来源的扩增子拷贝对测定的污染造成的假阳性区分开。只要污染不严重，用于两种靶分析的污染性模板/扩增子将是未连接的并因此不高频地共定位于多个分区。即使当污染严重时，可以使用稀释以将污染性扩增子的浓度稀释到可以区分开连接的靶和未连接的靶的范围。污染可通过一个扩增子或两个扩增子产生。即使污染包括两个扩增子，由于靶连接，真阳性(来自样本)将能与假阳性(来自污染物)区分开。
在某些实施方案中，用于相同等位基因的两种等位基因特异性测定可以用于降低LOD(例如，参见第III部分)。如果两种测定被充分补偿，则可以采用
Figure BDA0004101788870000181
探针。在其他示例中，可以检测来自报告相应靶的扩增的两个标记的引物的信号，所述标记的引物具有附接到每种引物的不同发光团(或相同发光团)。作为探针的示例性引物包括/>
Figure BDA0004101788870000182
引物，/>
Figure BDA0004101788870000183
引物，具有内部RNA碱基的荧光引物等。在某些情况下，两个等位基因特异性引物可以用于扩增包含相同单核苷酸多态性(SNP)的各个靶、一条引物靶向每条链，以及任选地，每条引物以该引物在对于各条链上的SNP位点上的3’碱基结束。在其他示例中，嵌入染料，诸如/>
Figure BDA0004101788870000184
染料可以用作两种靶的遗传报告物，荧光强度区分这两种靶。
对模板的不同链特异的靶可以以任何合适的量重叠。在某些示例中，除了一种或更多种等位基因特异性核苷酸碱基对以外，所述靶可以不重叠。在其他实施例中，除了其他的以外，所述靶可以重叠两个、三个、五个或十个核苷酸或超过等位基因特异性引物的大部分长度。在任何情况下，如果使用基于探针的分析用于检测，则每种靶可以具有其自身的引物对，并且任选地，具有自身的探针。
用于本文公开的等位基因检测的方法可以极大地增加灵敏度。仅对于一种靶的等位基因特异性PCR可能具有极大的假阳性率。用于等位基因特异性靶的引物序列被并入对应的扩增子，因此，一旦错配事件发生在分区中的等位基因上(例如，在对于突变等位基因的测定中的在野生型等位基因上的错误引发)，则失去对该特定分区的等位基因之间的辨别。对于相同等位基因的两种靶(例如，在相对的链上)，对于生成一个扩增子的一种靶测定的等位基因特异性引物的错误引发事件与产生另一测定的另一扩增子所需的错误引发事件无关。因此，可能产生对于一种测定的假阳性，而不是相同分区中对两种测定的双假阳性，除非对于两种靶存在独立的错误引发。对于一般的方法，双假阳性率应当远远小于每个单假阳性率。
靶的水平(例如，靶的浓度)的估值可以以多种方式来调节/校正。所确定的浓度可以考虑基于靶的两种单假阳性率的预期双假阳性。例如，可以从观察到的双阳性数减去双假阳性的预期数，以允许确定考虑了偶然发生的双假阳性的调节的浓度。除了当发生具有扩增子/模板片段的污染的某些情况，在LOD是重要的大多数加样条件下，此类调节可以是小的(例如，被忽略)。所确定的浓度也可以或可选择地可包括只仅对于一种靶检验是阳性的(实际上为假阴性)并且实际上包含来自所述样本的至少一种靶的单阳性的校正。除了其他的以外，此类校正可以基于靶之间的连接程度(例如，如果有的话，基于模板的降解程度)、测定的固有测定失败率或它们的组合。
下列部分中展示了本公开的进一步方面：(I)定义，(II)系统概述，(III)关联靶的示例性数字测定，(IV)基于关联靶鉴定生物粒子，以及(V)实施例。
I.定义
本公开使用的技术和科学术语具有本领域技术人员公认的含义。参见，例如，Lackie,DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier(2007年第四版)；Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor LabPress(Cold Spring Harbor,NY 1989)。然而，下列术语可以具有如下所述的另外或另选的定义，提供这些定义以有助于对本文频繁使用的某些术语的理解但并不旨在限制本公开的范围。
术语“包含(comprise)”或“包括(include)”及其变型形式诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”当述及步骤或元件时，旨在意指添加进一步的步骤或元件是可选并且未被排除。类似或等同于本文所述的方法、装置和材料的任何方法、装置和材料可以用于本发明的实践中。
“样本”是指来自任何合适的来源的感兴趣的化合物、组合物和/或混合物。样本是用于测定的常规的感兴趣的对象，所述测定分析该样本的某一方面，诸如与该样本中可能存在的至少一种靶相关的方面。样本可以其收集时的自然状态和/或以改变的状态进行分析，所述改变的状态例如，特别是，储存、保存、提取、裂解、稀释、浓缩、纯化、过滤、与一种或更多种试剂混合、预扩增(例如，在PCR之前，通过对样本进行有限的PCR循环(例如，<15)实现靶富集)、去除扩增子(例如，在PCR之前，用尿嘧啶-d-糖基化酶(uracil-d-glycosylase)(UDG)处理以去除先前生成的扩增子的任何遗留污染物(即，扩增子可用UDG消化，因为其是用dUTP，而不是dTTP生成的)、分区或其任何组合之后的状态。
样本可以是用于任何合适目的的任何合适的类型。除了其他的以外，临床样本可以包括鼻咽冲洗物(nasopharyngeal wash)、血液、血浆、无细胞血浆、血沉棕黄层、唾液、尿液、粪便、痰、粘液、伤口拭子、组织活检物、乳汁、流体吸出物、拭子(例如，鼻咽拭子)和/或组织。除了其他的以外，环境样本可以包括水、土壤、气溶胶和/或空气。除了其他的以外，研究样本可以包括培养的细胞、原代细胞、细菌、孢子、病毒、小型生物体、上面列出的任何一种临床样本。另外的样本可以包括待测试生物威胁物质的食品、武器的部件、生物防御样本、疑似污染物等等。
样本可以被收集用于诊断目的(例如，临床分析物诸如致病原的定量测量)或用于监测目的(例如，为了确定已超出预定阈值的感兴趣的环境分析物诸如生物威胁物质)。
生物样本可以从任何合适的一种或更多种生物体例如至少一种动物、植物、真菌、细菌或其他生物体，或其至少一部分(例如，来自其的一种或更多种细胞或核酸)获得或可以包含上述任何合适的一种或更多种生物体。在某些实施方案中，生物样本来自动物例如哺乳动物(例如，人类或非人灵长类，牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如，鸡)或鱼。生物样本可以是从生物体获得的任何组织和/或体液，例如血液级分或血液制品(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰液或唾液、组织(例如，肾、肺、肝、心脏、脑、神经组织、甲状腺、眼睛、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体、转化的细胞和干细胞；粪便、尿液等。生物样本可以从活组织检查获得。
在某些实施方案中，样本是环境样本。例如，空气、水或土壤样本。样本可以从特定的环境来源诸如特定的湖泊、地区、含水层、流域或特定的生态系统或地理区域取得。或者，样本可以从区域、对象或空间的刷拭物(swipe)、刮擦物(scrape)等获得。例如，样本可以是来自病房、床铺或其他物体的空气或水样本，或刷拭物或刮擦物。
样本可以包含感兴趣的粒子。不过，在某些情况下，样本不包含感兴趣的粒子。例如，样本可能被怀疑包含感兴趣的特定类型的粒子，诸如来自甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的粒子。可选择地或除此之外，样本可以包括其他类型的不感兴趣的粒子。因此，样本可以包括感兴趣和不感兴趣粒子的混合物。在某些情况下，样本可以包含从生物粒子制备的核酸。
可以制备提高靶的有效鉴定的样本。例如，样本可以被纯化、片段化、分级、均质化或超声波处理。在某些实施方案中，一种或更多种靶可以从样本(例如，生物样本)提取或与分离。在某些实施例中，样本被富集以获得一种或更多种靶的存在。在某些实施方案中，通过亲和性方法，例如免疫亲和性富集或通过杂交来富集样本中的靶。例如，一般来说，可以通过免疫亲和性、离心或本领域中已知的捕获和/或分离粒子/靶的其他方法被富集样品的生物粒子/靶或特定类型的粒子/靶。
在某些实施方案中，使用尺寸选择(例如，为去除小/短的分子和/或大/长的分子)富集样本的靶。在其他实施方案中，通过选择真核生物信使RNA多聚A尾富集样本的RNA分子。例如，样本可以被传送到寡dT柱，而多聚A富集的RNA可以被洗脱用于进一步的分析。
术语“分区”、“被分区的”等是指，将流体分成多个独立部分或“分区”。分区的形成可能涉及将任何合适的量的流体体积，包括多达流体的全部体积(其可以描述为整体相、包含样本的流体、样本和/或混合物)分配/划分为多个分区。一组分区的每个分区可以包括相同流体体积的一部分，并且可以是和/或包括与该组的其他分区的流体体积分离的流体体积。除了其他的以外，分区可以通过流体/液体相，诸如乳液连续相、通过固态相，诸如隔室(诸如容器)的至少一个壁或二者的组合来彼此隔离。在某些实施方案中，每个分区可以由不同的隔室诸如不同的壁、通道或容器来保持。在某些实施方案中，分区可以是以流体连续相布置的液滴，所述流体连续相可以是液体，使得液滴和连续共同形成乳液。在某些实施方案中，流体分区(例如，液滴)是被不可混溶的载体流体(例如，油)环绕的含水液滴。
分区可以是包含样本的一部分的样本分区。分区在尺寸上可以是基本一致的，或可以具有不同的尺寸(例如，多组分区具有两种或更多种分散的、相同的尺寸)。示例性分区是液滴。分区也可以以预定的尺寸分布或以随机的尺寸分布在尺寸上连续地改变。
“液滴”是指小体积的流体，一般来讲是液体，该流体被一种不同的流体，一般是不可混溶的流体，诸如连续相的乳液环绕。液滴的体积和/或乳液中液滴的平均体积可以例如，小于约1微升(或在1微升与1纳升之间，或在约1微升与1皮升之间)，小于约1纳升(或在约1纳升与1皮升之间)，或小于约1皮升(或在1皮升与1毫微微升(femtoliter))等等。除了其他直径以外，液滴(或乳液的液滴)可以具有小于约1000、100或10微米或约1000至1微米的直径(或平均直径)。液滴可以是球形或非球形的。液滴可以是单液滴(simple droplet)，或复合液滴，即，在该液滴中，至少一个液滴包围至少一个其他的液滴。
“油”是指不可与水混溶的任何流体。在某些示例中，除了其他的以外，油可以是包括碳以及氢、氟、硅和氧的任何组合的有机流体。本文公开的任何乳液可以是油包水(W/O)乳液(即，含水液滴在连续油相中)。除了其他的以外，油可以例如是或包括至少一种硅油、矿物油、氟碳油、植物油或它们的组合。任何其他的合适组分可以存在于任何乳液相中，诸如，至少一种表面活性剂、试剂、样本(即，其一部分)、其他添加剂、标签、粒子或其的任何组合。
“靶”是指感兴趣的分析物(或其区域)。可互换地，靶可以称为分析物或鉴别标识物(identification signature)。靶可以是测定诸如多重分析的对象，并且靶可被样本包含和/或被各自包含样本的一部分的一组分区共同包含。靶可以是分子(靶分子)、两种或更多种分子的装配体或复合体(靶装配体/复合体)、生物粒子(靶生物粒子(例如，靶细胞))等。靶可以是分子的一部分(或全部)，装配体/复合体的一部分(或全部)，或粒子的一部分(或全部)。示例性靶包括核酸、核酸序列、蛋白质(例如，抗体、酶、生长因子、凝血因子、磷蛋白等)、蛋白质序列(例如，表位/半抗原)、碳水化合物、代谢物和生物粒子。示例性靶序列在长度上可以是至少10、15、20、25、30、40或50个核苷酸。
在某些示例中，靶可以是分子或复合体所包含的靶序列，并且可以只形成分子或复合体的一部分(或全部)。靶序列可以是例如核苷酸序列(例如，单链或双链序列)、氨基酸的序列、糖序列等。在某些情况下，靶可以是模板(或可以由模板提供)。示例性靶序列可以由基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA、互补DNA、RNA(例如，基因组RNA和/或转录物)等提供。“靶分子”是指样本中待检测的分子。
“生物粒子”是指包含生物分子的粒子，诸如大分子(例如，蛋白质、核酸和/或更多糖，除了其他的以外)和/或大分子复合体(例如，核蛋白复合体)。生物粒子可以是生物细胞(可互换地称为细胞)、病毒粒(可互换地称为病毒粒子)、细胞器(可互换地称为亚细胞粒子)等等。在某些实施方案中，生物粒子可以是一类微生物(其可可互换地称为微生物和/或单细胞生物体)，诸如一类细菌、病毒、原生动物、酵母、古生菌等。在某些实施方案中，细胞可以由多细胞生物体(例如，来自人、马、鼠、蛙、鱼、昆虫、海绵动物、真菌等)提供。除了其他的以外，细胞可以包括特定组织类型、特定表型(例如，增殖性、被刺激的表型等)或特定疾病的细胞(例如，被感染的细胞、癌症细胞等)。样本中(或只可能在样本中)的生物粒子可以是至少一种、两种或更多种、或三种或更多种不同的“类型”。不同类型的生物粒子可以根据遗传学、表观遗传学和/或表型学区分。除了其他的以外，不同类型可以是分类学相关但是可区分的，例如属于特定分类等级(界、门、纲、目、科、属和/或种)的相同分类单元。例如，除了其他的以外，至少一对不同类型中的每种类型可以代表不同的属或相同的科、相同属的不同种，或相同种的不同株或变体。株/变体可以具有任何合适数量的遗传学/表观遗传学差异，包括单基因、单核苷酸差异和/或单表观遗传差异。这对不同的类型可以属于相同分类等级的不同分类单元，但是可以共享一个基因区或一组基因区。
“靶生物粒子”，诸如“靶细胞”或“靶病毒”可以是感兴趣的生物粒子，诸如样本中待检测的一种类型的细胞或病毒。可互换地，靶生物粒子可以描述为“分析物粒子”，并且可以与“非分析物(非靶)粒子”区分开。在某些实施方案中，感兴趣的粒子包含可以将靶粒子和待分析样本中可能的其他类型的粒子区分开的靶含量(例如，靶分子和/或靶序列的)。例如，感兴趣的粒子可以包含本文公开的任何靶，诸如表征靶粒子并相对于不感兴趣的其他类型的粒子，将感兴趣的粒子鉴定为属于感兴趣的类型的一个靶序列或一组靶序列。
以“部分占有(parital occupancy)”包含一种或更多种靶的一组分区是指，每种靶在该组分区的至少一个分区中不存在的情况。因此，当部分占有时，该组分区的仅一个亚组包含待分析的每种靶的至少一个拷贝。例如，通过对第一靶和第二靶的多重测定，只有第一亚组的分区包含第一靶，并且只有第二亚组的分区包含第二靶。当形成分区时，如果第一靶和第二靶彼此完全关联，则分区的第一亚组和第二亚组可能是相同的亚组。可选地，当形成分区时，如果第一靶和第二靶彼此不完全关联，则分区的第一亚组和第二亚组可能是不同的。在某些情况下，如果靶不完全关联，则不同第三亚组的每个分区可能包含每种靶的至少一个拷贝。因此，通过部分占有，一个或一个以上(例如，多个)的分区不包含第一靶的拷贝，一个或一个以上(例如，多个)分区可能包含第一靶的单个拷贝(只有一个拷贝)，以及任选地，又有一个或一个以上分区(例如，剩余的分区)可能包含第一靶的两个或两个以上的拷贝。相似地，通过部分占有，一个或一个以上(例如，多个)分区不包含第二靶的拷贝，一个或一个以上(例如，多个)分区可能包含第二靶的单个拷贝(只有一个拷贝)，以及任选地，一个或一个以上分区(例如，剩余额分区)可能包含第二靶的两个或两个以上的拷贝。
术语“部分占有”并不局限于任何分区中有不超过特定靶的一个拷贝的情况。当设置或形成分区时，在部分占有时，包含靶的分区可以例如，每个分区包含尤其是，平均多于或少于约一个拷贝、两个拷贝或三个拷贝的靶。靶的拷贝在分区之间可以具有可以描述为泊松分布的随机分布。在某些情况下，相当数量的分区(例如，除了其他的以外，至少约1％、2％、5％、10％或20％的分区)各自可能包含至少两个不同靶中的每种靶的一个拷贝，和/或更多个分区各自可能包含所有待分析的所有靶的至少一个拷贝。
“关联”的一对靶是指，以大于单独几率的频率从相同整体相一起分布到相同分区的靶。通过一起呈现在相同生物粒子(例如，相同的生物细胞、病毒粒、亚细胞官等)中或上，这对靶的相应拷贝可以彼此关联。作为另一示例，这对靶可以“连接”，就是说，彼此连接(共价结合和/或直接或间接非共价结合，诸如尤其是，通过碱基配对)。在分区形成之前和/或期间，样本中的关联靶可以具有至少约50％、80％、90％或100％的任何合适的关联度和/或连接度。关联(和/或连接)度指示，一种靶的拷贝与另一靶的至少一个拷贝关联(和/或连接)的百分比。靶的关联/连接度可以是之前已知或检验的。关联度指示，样本内被限制于相同隔室(例如，相同细胞)的靶的彼此连接的百分比，和/或在对偶然共定位校正后，靶一起分布到相同分区的频率。无论是由于分区形成期间还是偶然的物理连接和/或被迫的空间接近而占据相同分区的靶，可以描述为共定位在该分区中或共同存在于分区中。具有高关联度的靶以对应的高频率共定位在相同分区中，无论该靶在样本中是大量的还是稀有的。例如，具有90％关联的靶应当共定位在至少90％的包含至少一种靶的分区中。相反，未关联的靶应当按照在给定分区中发现每种靶的概率乘积共定位，所述概率乘积随着靶的浓度改变。
“核酸”是指，包含核苷酸单体的链的分子/装配体。除了其他形式以外，核酸可以是单链的、双链的、三链的或其组合。单链核酸可以包含任何合适数量的核苷酸，诸如，尤其是，至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000个核苷酸。一般来说，核酸链的长度对应于其来源，其中，合成核酸(例如，引物和探针)通常是较短的，而生物学/酶学方法生成的核酸(例如，核酸分析物)通常是较长的。“核酸”是指，尤其是，具有不同序列、长度、类型或它们的组合的多种核酸。
核酸可以具有天然或人工的结构，或它们的组合。具有天然结构的核酸，即，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)通常具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团被连接到碱基(例如，嘌呤(诸如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(诸如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可以例如通过改变天然骨架的戊糖基团和磷酸基团形成。示例性的人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)、硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸等。
核酸序列由碱基沿主链排列的顺序定义。该序列通常决定了核酸通过氢键特异性结合配偶链(或形成分子内双链体)的能力。特别地，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，而鸟嘌呤与胞嘧啶配对。可以以反向平行方式结合另一核酸链或区域的核酸链或区域通过与其他链或区域形成此类碱基对的连续串称为“互补”。
“寡核苷酸”是指，长度短于500、200或100个核苷酸的核酸。寡核苷酸可以通过化学合成，任选地不需要酶催化。寡核苷酸可以充当例如引物、探针等。
“检测试剂”是指，促进或能够用合适的检测器(例如，光学检测器)检测靶的存在或不存在和/或量的试剂。一组检测试剂可以存在于包含样本的流体中和/或从包含样本的流体形成的每个分区中。该组检测试剂可以包括仅特异性结合待分析的一种靶和/或非特异性结合待分析的每种靶的至少一种结合配偶体。结合配偶体可以包括标记和/或可以是发光的(和/或可以具有发光形式)。在涉及靶扩增的实施方案中，该组检测试剂也可以或可选择地可包括对于每种靶的一种或更多种扩增引物。
“报告物”是指，报告状况，诸如靶存在或不存在或丰度，和/或是否已发生反应或反应的程度的至少一种检测试剂或一组检测试剂。示例性报告物可以包括，至少一种发光团诸如光致发光团(photoluminophore)或化学发光团和/或至少一种寡核苷酸。其他示例性报告物可以包括发色团、酶、酶的底物、结合配偶体或它们的组合。用于核酸扩增测定的示例性报告物可以包括特异性报告物，诸如，探针，和/或非特异性(通用)报告物诸如嵌入染料(例如，SYBR Green、溴化乙锭等)。因此，报告物可以是靶和/或从所述靶产生和/或对应于所述靶的产物的结合配偶体。
报告物可以具有不同的形式和/或构象。报告物可以具有初始/完整的形式以及一种或更多种降解/修饰的形式。一种或更多种降解/修饰的形式可以在扩增至少一种靶期间从所述初始/完整的形式产生。该形式可通过光学区分。例如，降解/修饰的形式可以比初始/完整形式更多或更少光致发光的。具有不同形式的示例性特异性报告物是Taqman(
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在其他示例中，特异性报告物可以具有不同的构象，诸如当未结合时为分子内发夹结构，而当结合时为延伸的(非发夹)结构。
“结合配偶体”是指，结合另一实体，诸如，靶和/或对应和/或表示所述靶的存在/不存在或丰度的反应产物(例如，扩增子)的分子、复合体、装配体或粒子。结合配偶体可以特异性结合该实体，并因此可以与该实体形成特异性结合对。特异性结合对的非限制性示例包括互补的核酸、报告物及其配体、生物素和亲和素/链霉亲和素、抗体和对应的抗原、抗体和G蛋白、多组氨酸和Ni+2、转录因子和包含转录因子的结合位点的核酸、适体及其配偶体等等。可以与靶分子的特异性相互作用或特异性结合的分子的非限制性示例包括核酸(例如，寡核苷酸)、蛋白质(例如，抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白质支架等)以及适体。
关于测定中的结合配偶体(例如，报告物，诸如探针)和特定靶(和/或关于对应特定靶的产物)的“特异性结合”是指，结合配偶体与基本上排除了所述测定中的其他靶(和/或它们的对应产物)的靶(和/或结合配偶体及其产物)之间的结合。
“标记”是指，连接到任何实体或与任何实体整合的鉴定性和/或辨别性标志物或识别物，除了其他的以外，所述任何实体诸如化合物、装配体、生物粒子或液滴。标记可通过任何合适的方法检测，包括光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学方法或其他物理方法。合适的标记可以包括发光团、发色团、放射性同位素(例如，32P，3H)、电子密集性试剂、酶、特异性结合配偶体等。可以采用本领域中用于偶联，例如用于将探针偶联到一种标记的任何已知方法，例如，使用Hermanson,Bioconjugate Techniques1996,Academic Press,Inc.,San Diego中描述的方法。本文的其他地方描述了可能合适的标记的进一步方面，如第IV部分。
被“附接”到一种标记的分子或其他实体(例如，关于如本文所述的标记的探针)是通过一个或更多个化学键共价附接(偶联的)到该标记，或诸如通过一个或更多个离子力、范德华力、静电力和/或氢键非共价附接到该标记使得分子的存在可以通过检测该标记的存在来检测的分子或其他实体。
术语“发光”是指，不能仅归因于发光体的温度的光的发射。发光的示例性形式包括光致发光、化学发光、电致发光等。“发光团”是能够发光的任何原子、部分、分子、复合体或装配体。光致发光是响应于激发光的辐射所产生的任何发光现象，并且包括荧光、磷光等。因此，发光团可以是光致发光团(诸如荧光团或磷)、化学发光团等。
“测定”可互换地称为“测试”，是指用来表征样本的程序或程序的组。此类表征可以经由关于从这些程序获得的样本的数据获得。测定可以使用至少一种“测定混合物”进行，所述至少一种“测定混合物”是一种组合物，在处理该组合物以允许发生反应(如果有的话)之前、期间和/或之后，可以从该组合物检测一个或更多个信号。测定可以确定样本中的一种或更多种靶的性质。“多重测定”是指一般同时在同一组的分区上执行对两种或更多种靶的分析。
“水平”是指对靶的丰度的定量或定性和/或相对或绝对量度。水平可以是存在或不存在，如尤其是通过阈值、量或浓度来定义。量度可以是内在或外在的。除了其他的以外，示例性水平包括不存在、存在、包含靶的至少一个拷贝的分区的数量或靶的浓度(诸如每分区的平均靶拷贝数，每单位体积的靶拷贝数，每单位体积的靶的摩尔浓度或质量)。
“扩增”是指生成靶，诸如靶序列的拷贝的反应或方法。拷贝可以是靶的严格或不严格的拷贝。(示例性的不严格的拷贝是RNA靶的DNA拷贝。)在扩增进行时，扩增可以产生拷贝数量的指数级或线性增加。示例性的扩增产生拷贝数量和/或信号的至少5、10、100或1000倍增加。拷贝可以通过任何合适的机制产生，诸如使用聚合酶、连接酶的引物延伸或其组合。本文公开的用于基于分区的测定的示例性扩增反应可以包括聚合酶链反应(PCR)或连接酶链式反应，每种反应通过热循环驱动。这些测定也可以或可选地可使用可以等温执行的其他扩增反应，诸如支链探针DNA分析、级联RCA、解旋酶依赖的扩增、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸的扩增(NASBA)、切口酶扩增反应(NEAR)、PAN-AC、Q-β复制酶扩增、滚环复制(RCA)、自动维持序列复制(self-sustaining sequence replication)、链置换扩增(strand-displacement amplification)等。扩增反应可以扩增包含靶序列的模板的至少一个区域(或全部)。模板可以是直链或环形模板。扩增可以例如形成尤其是，DNA靶序列的DNA拷贝、RNA靶序列的DNA拷贝、DNA靶序列的RNA拷贝或RNA靶序列的RNA拷贝。
扩增可以用任何合适的试剂执行。扩增可以在扩增混合物中执行或检验其发生，扩增混合物是能够生成组合物中的靶序列(如果存在的话)的多个拷贝的任何组合物。除了其他的以外，扩增混合物可以包括至少一条引物或引物对、至少一种扩增报告物、至少一种复制酶(例如，至少一种聚合酶，诸如至少一种DNA和/或RNA聚合酶)和脱氧核苷酸(和/或核苷酸)、三磷酸酯(dNTP和/或NTP)的任何组合。测定混合物的进一步方面和能够多重化扩增和检测同一分区中的两种或更多种靶序列的检测策略在本文的其他地方以及在上文列在交叉引用下面的通过引用并入本文的专利文献中描述。
“扩增子”是指扩增反应的产物。扩增子可以是单链或双链的，或其组合。扩增子可以对应于被扩增以生成扩增子的靶序列的至少一个区域。
“引物”是指核酸，诸如能够和/或被用于引发靶序列的复制的寡核苷酸。因此，引物可以是与较长靶序列的区域互补的较短的核酸。在复制期间，引物可以基于靶序列被延伸以生成是靶序列的至少一个区域的互补拷贝的较长核酸。除了其他的以外，引物延伸可以通过连续添加单个核苷酸(诸如，使用聚合酶)，或通过同时添加两种或更多种核苷酸的嵌段(诸如，使用连接酶)或它们的组合来增量地发生。引物可以是DNA、RNA或其类似物(即，核酸类似物)或它们的任何组合。引物可以具有任何合适的长度，诸如尤其是，至少约7、10、15、20或30个核苷酸。示例性引物是化学合成的，无需酶催化。引物可以作为用于放大至少一种靶序列的至少一对引物来提供。一对引物可以是共同定义所得扩增子的末端(以及由此而来的长度)的有义引物和反义引物。
“探针”是指附接到至少一种标记，诸如至少一种发光团或发色团的结合配偶体。探针可以包括寡核苷酸并且可以是针对靶序列和/或通过扩增靶序列所产生的扩增子的序列特异性的结合配偶体。探针可以例如被设计为能够检测基于光致发光，诸如通过荧光共振能量转移(FRET)的靶扩增。用于本文公开的核酸测定的示例性探针包括各自被连接到单个发光团或各自被连接到当彼此接近时共同呈现荧光共振能量转移(FRET)的一对发光团的一种或更多种核酸。除了其他的以外，该发光团对可以提供第一和第二发射体或一种发射体和一种猝灭剂。当发光团彼此分离时，来自这对发光体的荧光发射诸如通过在引物延伸期间裂解探针(例如，5’核酸酶分析，诸如利用
Figure BDA0004101788870000301
探针)或当探针杂交至扩增子(例如，分子信标探针)时改变。探针的核酸部分可以具有任何合适的结构或来源，例如，该部分可以是锁核酸、肽核酸、通用探针库的成员等。在其他情况下，探针以及引物对中的一条引物可以组合在同一分子中(例如，/>
Figure BDA0004101788870000302
引物或/>
Figure BDA0004101788870000303
引物)。例如，引物-探针分子可以在其3'端包括引物序列而在其5'端包括分子信标型探针。通过这种布置，用不同发光团标记的相关引物探针分子可以用在采用同一反向引物的多重测定中，以定量单个核苷酸不同的靶序列(单核苷酸多态性(SNP))。用于核酸测定的另一示例性探针是
Figure BDA0004101788870000304
引物。
“转录产物”是指，通常使用RNA聚合酶通过转录DNA的过程产生的RNA。转录产物可以提供靶序列，可以只表示被转录DNA的一个区域，诸如DNA内的一个基因，并且可以被描述为基因转录产物。转录产物可以是初级转录物或从初级转录物产生的加工的转录物(例如，剪接的转录物)。示例性转录产物包括前体-mRNA(前信使RNA)、mRNA、核醣体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、前体微小RNA(前-miRNA)、微小RNA(miRNA)等。
“逆转录”是指从RNA模板，诸如任何合适的转录产物形成互补DNA。逆转录可以用催化该过程的酶来执行。可能合适的示例性酶包括逆转录酶(例如，MLV-RT、Tth聚合酶、AMV-RT、HIV-RT等)。所述酶可能也能够用DNA作为模板合成DNA，并且在某些情况下，可能能够扩增靶序列。所述酶可以是足够热稳定的，以允许对分区加热以打开该分区，而不破坏该酶的逆转录活性。
“等位基因”是指，一个遗传学区域诸如一个基因的一种交替形式。由于一个或更多个核苷酸的缺失、插入、复制、重排或取代，同一基因区域/基因的不同等位基因可以彼此不同。在示例性实施方案中，等位基因因单个核苷酸而不同，并因此该遗传学区域包含单核苷酸多态性(SNP)。等位基因可能引起或可能不引起可区分的表型。在某些情况下，一对等位基因可以是正常的等位基因(也称为野生型等位基因)和变体等位基因(也称为突变的等位基因)。
样本中(或可能存在于样本中)的至少一对靶可以表示一个感兴趣的基因区域或基因的不同形式/等位基因，诸如变体形式/等位基因(也称为突变形式)和正常形式(也称为野生型形式)。除了其他的以外，不同形式可以是所述感兴趣的基因区域/基因的交替形式，其在一个或更多个核苷酸位置处的序列不同，诸如单个核苷酸或两个、三个或更多个核苷酸不同，和/或因插入、复制或缺失而不同。变体形式/等位基因可以是基因的较为罕见的形式，而正常形式/等位基因可以是样本包含的生物体物种(和/或某类细胞)的基因的较为丰富的形式。例如，变体形式可能在少于来自生物体的物种或该类细胞的细胞的感兴趣的群体的尤其是约10％、5％或1％的成员中是显性的。另外或可选择地，正常形式式可能在来自生物体的物种或该类细胞的细胞的感兴趣的群体的的大于约10％、25％或50％(多数)的成员中是显性的。
至少一对靶可以包括是变体序列(来自感兴趣的基因的变体形式)的靶和是正常序列(来自感兴趣的基因的正常形式)的一种其他的靶。变体序列和正常序列可以在感兴趣的基因处彼此重叠以界定重叠区域。变异序列和正常序列可以因重叠区域中的至少一个核苷酸而不同。在某些情况下，重叠区域可以因至少或不超过1、2或3个核苷酸而在变体序列和正常序列之间不同。除了其他的以外，重叠区域可以是至少1、2、5或10个核苷酸。在某些示例中，重叠区域可以与变体序列和/或正常序列具有相同的长度。
“基因组当量(genome-equivalent)”是指质量上等于生物粒子或生物体的单基因组的基因组DNA的量。(二倍体细胞包含两个基因组的基因组DNA而大多数细菌细胞包含仅一个基因组的基因组DNA。)当基因组DNA从一组细胞或病毒中被分离时，基因组当量可能是有用的单位，因为来自各个细胞/病毒的基因组DNA被混合且往往被片段化。分离自一种类型的细胞的基因组DNA的基因组当量可能平均具有细胞基因组的每个基因的一个拷贝。在某些情况下，基因组当量可以由细胞或其他生物粒子内的完整基因组提供。
“打开”生物粒子是指，将生物粒子的内容物和粒子外面的流体/试剂组合的任何合适的工艺和/或操作。打开的步骤可以释放粒子的至少一部分内容物和/或允许试剂进入粒子。打开可以，尤其是穿透、破坏、断裂、降解和/或溶解粒子的至少一个结构，诸如处于粒子的周边或周边附近的粒子的至少一个壁、膜、包衣和/或壳。打开可以通过任何合适的处理来执行，尤其是，诸如酶消化(例如，降解碳水化合物的酶(溶菌酶))、渗透性破坏、加热(例如，到至少约50、60、70、80或90摄氏度的温度或在所述温度下加热)或它们的组合。
“光通道”是指通过其检测来自分区的光的特定检测方案。除了其他的以外，该检测方案可以通过，光源、用光源的光照射分区的波长设计、用于检测分区的光的波长设计、光路、照射/检测的至少一个时间间隔或它们的任何组合表征。“波长设计”由光的一个或更多个波长和/或一个或更多个波段定义。不同的光通道的检测方案具有一个或更多个不同的特征。光通道可以使用不同的光源、用于照射每个分区的不同波长设计、用于检测每个分区的光的不同波长设计(例如，用于相同传感器和/或具有不同光谱灵敏度的不同传感器的不同辐射滤光器)、不同的光路、用于检测每个分区的光的不同时间间隔或它们的任何组合。每个光通道可以或可以不包括光源。如果不同的话，这些光路可以穿过不同的光学元件，诸如不同的光谱过滤器行进。光路可以是不重叠或至少部分重叠的。如果重叠的话，光路可以在光源和每个被检测的分区之间重叠，和/或在每个被检测的分区与一个或更多个传感器之间重叠。
被选择的上文定义的术语在下面的部分中进一步描述。
II.系统概述
本部分提供用于对关联靶进行数字测定的示例性方法和设备的概述。
图1示出了执行关联靶的多重数字测定的示例性方法50的流程图。对方法50展示的步骤可以以任何合适的顺序和以任何合适的组合进行。此外，所述步骤可以与本公开的任何其他合适的步骤、方面和/或特征组合和/或被其修改。
A.样本制备
可以制备用于测定的样本，52处所示。样本制备可以包括对样本的任何合适的操作，尤其是，诸如收集、稀释、浓缩、纯化、冻干、冷冻、提取、限制性酶消化、剪切、与一种或更多种测定试剂组合、进行至少一种初步反应或它们的组合。样本制备可以包括使样本能够随后进行一个或更多个反应，诸如一个或更多个酶催化的反应和/或结合反应。
在某些实施方案中，样本制备可以包括，将样本和试剂组合以产生用于执行对每种靶的反应(诸如，扩增反应)和用于报告每个反应的程度(例如，反应是否在超过阈值水平或在范围内发生)的包含样本的混合物。用于扩增的试剂可以包括针对靶的引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如，尤其是，聚合酶、连接酶、逆转录酶、限制性酶或其组合，每种酶可以是或可以不是热稳定的)等的任何组合。因此，该混合物可以具有用于在合适环境条件下(即，能够胜任)扩增每种靶的一组完整的试剂(例如，在升高的温度或温度调节(诸如通过热循环)下孵育)。混合物可能能够扩增样本(或其分区)中的一种或更多种靶中的每一种(如果存在的话)。混合物的制备可能使得能够报告或被分析是否已在靶对靶的基础上发生反应，诸如扩增以及任选地报告任何此类反应的程度。混合物可以包括对扩增每种靶共同地敏感的一种或更多种报告物。每种报告物可以包括标记的探针，所述标记的探针包括用发光团(例如，光致发光部分)诸如荧光团标记的寡核苷酸。可选择地或除此之外，可以利用至少一种通用报告物。在某些情况下，相同的通用报告物可以报告每种靶的扩增。
在某些实施方案中，样本可以包括一种或更多种类型的生物粒子和/或来自其的核酸。生物粒子可以共同提供所述靶中的每一种。生物粒子可以在任何合适的时间被打开。
B.分区的形成
样本的部分可以放置在分区中以形成用于测定两种或更多种关联靶的分区，54处指示。在某些实施方案中，关联的靶可以从同一模板，诸如来自分区中的模板的至少一个拷贝扩增。模板的拷贝可以以部分占有存在于分区中。在某些实施方案中，多种类型的生物粒子中的每一种可以以部分占有存在于分区中，即，仅在包含每种类型的粒子的分区的亚组中。可选择地或除此以外，由生物粒子包含和/或提供的多个靶中的每一种可以以部分占有存在于分区中。
分区可以通过任何合适的程序、以任何合适的方式形成并具有任何合适的特性。例如，分区可以用流体分配器诸如移液器、用至少一个液滴发生器、通过搅拌样本(例如，摇动、搅动、超声处理)等来形成。因此，分区可以串联、并联或成批地形成。分区可以具有任何合适的一种或更多种体积。分区可以具有基本上一致的体积或可以具有不同的体积。具有基本相同体积的示例性分区是单分散性液滴(monodisperse droplet)。分区的示例性体积包括，除了其他体积以外，小于约100、10或1μL，小于约100、10或1nL，或小于约100、10或1pL的平均体积。
能够扩增每种靶的分区可以由包含靶的整体相直接形成，或可以在多个步骤中形成。在某些情况下，形成分区的步骤可以包括将整体相划分为以部分占有包含靶/模板的隔离的流体体积(诸如液滴)。流体体积可以是分区本身或可促成分区。例如，流体体积可以是第一组流体体积，且形成分区的步骤可以包括将第一组的单独的流体体积和第二组的单独的流体体积组合。第二组可以包括用于扩增一种或更多种靶的一种或更多种试剂，诸如，用于扩增至少一种靶的至少一条引物、用于一对靶的引物等。组合的步骤可以包括将第一组的流体体积各自与第二组的流体体积融合，诸如将包含靶的液滴和包含用于扩增靶的引物的液滴融合。
分区可被设置为进行对关联靶诸如连接的靶的至少一对靶测定。连接的靶可以表示任何合适的连接和/或重叠的模板的一对区域。这些区域可以沿模板彼此隔开，尤其是，诸如隔开至少50、100、200或400个核苷酸/碱基对。在某些情况下，这些区域可以隔开大于每个区域的长度的核苷酸的数量。在某些情况下，隔开更大的区域可能是期望的，以减少用针对每种靶的引物(例如，用针对一对靶的会聚性外部引物(convergent outer primer))共扩增相同扩增子中的两种靶。在其他情况下，这些区域可以彼此重叠任何合适数量的核苷酸，诸如小于二十、小于十个核苷酸等。在某些实施方案中，这些区域可以在等位基因变异的部位重叠。可选择地或除此以外，每个区域可以是链特异性的，一个区域表示模板的一条链，而另一区域表示模板的另一条链。链特异性区域可以或可以不沿模板彼此重叠。形成分区的进一步方面在第I和III-V部分中描述。
C.反应的执行
至少一种类型的反应可以在分区中执行，56处指示。例如，靶可以在分区中被扩增。每种靶的放大仅可选择性地(和/或基本上)发生在分区的亚组中，尤其是，诸如小于的四分之三、一半、四分之一或十分之一的分区。每种靶的放大可以选择性地发生在包含靶的至少一个拷贝(例如，包含包括靶的模板的至少一个拷贝)的分区中。
扩增可以等温或可以不等温地进行。在某些情况下，在分区中的扩增可以通过加热分区和/或在室温以上的温度诸如在变性温度、退火温度和/或延伸温度孵育，持续一个或更多个循环来激励。在某些示例中，分区可以是热循环的以促进聚合酶链反应和/或连接酶链式反应。除了其他扩增方法以外，可能合适的示例性等温放大方法还包括基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增、多重置换扩增、链置换扩增、滚环扩增、DNA的环介导的扩增、解旋酶依赖性扩增和单引物扩增。
D.数据收集
数据可以从多个分区中收集，该数据指示每种靶各个分区中的存在或不存在，58处所示。例如，可以收集扩增数据。数据可以通过检测来自各个分区的光来收集。光可以(或可以不)响应于激发光对分区的照射而发出。可以收集任何合适数量的光通道，尤其是，诸如仅一个、仅两个或更多个光通道中的数据。可以收集尤其是与靶相同数量的光通道中的数据，或小于靶数量的光通道中的数据。
数据收集可以包括生成表示从各个分区检测的光的一个或更多个信号。该信号可以表示光的某一方面，诸如光的强度、寿命、偏振和/或能量转移。这些信号可以任选地包括在两个或更多个不同光通道(例如，不同的波长范围(波段)和/或颜色方案)中收集的来自相同和/或不同靶的报告物的数据。从每种报告物检测到的光可以是从发光团(例如，荧光团)发出的光。在给定通道中检测到的光可被检测，使得来自不同报告物的光被加和或累计，而不归属于特定的报告物。因此，给定通道的信号可以表示两种、三种、四种或更多种测定以及由此而来的两种、三种、四种或更多种靶。在其他情况下，用于两种或更多种靶的信号各自可以在不同的光通道中检测。
信号可以基于从分区中的一种或更多种报告物检测到的光产生。一种或更多种报告物可以报告由该信号表示的两种或更多种特定扩增反应中的至少一个扩增反应是否已在分区中发生，以及由此而来的分区中是否存在对应于两种或更多种特定扩增反应的两种或更多种特定靶中的至少一种靶的至少一个拷贝。对应于报告物的信号的水平(可互换地称为幅度)可被分析以确定是否已发生至少一种特定扩增反应以及是否存在一种特定靶的至少一个拷贝。根据所述至少一个特定扩增反应是否已发生或未发生以及所述至少一种特定靶是存在于还是不存在于每个分区中，信号的水平可在分区之间改变。例如，数据中对于特定靶指示为阳性的分区可以具有在大于给定阈值和/或给定范围内的信号值。可以对分区进行分析并在任何合适时间产生信号。示例性时间包括当测定结束时(终点测定)、当反应已运行至完成并且数据不再改变时、或更早的时间，只要数据被充分且可靠地分离。
在任何合适的条件下，数据可以从多个分区(即，仅亚组的分区或全部分区)收集。所有的数据可以在大约相同的温度下从多个分区收集。可选择地或除此以外，所有的数据可以在，除了其他温度以外，低于每种扩增子的解链温度、低于用用于扩增的热循环中的退火温度和/或低于约50或45摄氏度的温度下来收集。扩增数据可以在每种靶已达到扩增端点之后收集。
报告物可以具有任何合适的结构和特征。每种报告物可以是探针，包括寡核苷酸和与该寡核苷酸结合以标记该寡核苷酸的发光团(例如，偶联至该寡核苷酸的发光团)。探针还可以包括或可以不包括发光团的能量转移配偶体，诸如猝灭剂或另一发光团。探针可能能够特异结合通过扩增针对该探针的靶所产生的扩增子。探针也可以或可以不充当测定中的扩增引物。示例性标记探针包括
Figure BDA0004101788870000371
探针、/>
Figure BDA0004101788870000372
探针/引物、/>
Figure BDA0004101788870000373
探针、/>
Figure BDA0004101788870000374
探针、分子信标探针、/>
Figure BDA0004101788870000375
引物、当在扩增子上彼此相邻结合时表现出FRET的靠近性依赖的相关杂交探针对、/>
Figure BDA0004101788870000376
引物等。
在某些情况下，报告物中的至少一种是通用报告物，诸如相对非特异性地结合核酸的光致发光染料或显色染料。例如，染料可以不偶联至赋予基本序列结合特异性的寡核苷酸。染料可以是大沟结合剂、小沟结合剂、嵌入剂或外部结合剂等等。染料可以相对于单链核酸优先结合双链核酸，和/或当相对于单链核酸结合到双链核酸时，可以表现出光致发光特性的更大变化(例如，强度)。可能合适的示例性染料包括发光花菁、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑等，诸如DAPI、
Figure BDA0004101788870000377
33258染料、吖啶橙等。除了其他嵌入染料之外，合适的示例性嵌入染料包括溴化乙锭、碘化丙啶、/>
Figure BDA0004101788870000378
染料、/>
Figure BDA0004101788870000379
绿色染料、/>
Figure BDA00041017888700003710
金染料和7-氨基放线菌素D(7-AAD)。通用报告物可以用于进行本文公开的任一靶的多重测定。利用基因/非特异性报告物的多重测定的进一步的方面如本文其他地方以及上文在交叉引用下所提到的通过引用并入本文的参考文献，尤其是2014年2月26日提交的美国专利申请序列号14/191295中所描述的。
E.分区的分类
对于每种靶，分区可以分类为阳性或阴性的，60处所示。例如，可以从数据中鉴定对于两种靶均是阴性、只对其中的一种靶是阳性(单阳性)以及对于两种或更多种靶均是阳性(双阳性等)的分区群。鉴定可以通过数据处理器使用算法(例如，鉴定数据中的模式(例如，分区簇)的算法)、通过用户，或二者的组合进行。在某些情况下，数据处理器可以产生和输出(例如，显示)所收集的数据的图(例如，2-D散点图或柱状图(参见第III和IV部分)。用户随后可以例如通过界定群边界的图形用户界面，和/或通过界定每个群体的边界的输入值(例如，表示幅度阈值/范围)来基于所述一个或更多个图来定义每个群的边界。每个群的边界可以通过一个或更多个值范围、环绕该群的几何形状(例如，多边形、椭圆形等)等来定义。
分区群的分类可以包括，将每个分区指定成各自对应于不同分区群的多个预先界定的隔室中的一个。预先界定的隔室可以表示对于靶是阳性和阴性的所有可能的组合。
F.获得分区的计数
可以获得对于每个分区群的分区计数。分区计数可以是构成特定分区群或两个或更多个分区群的组的分区的值。因此，分区计数可以，例如，除了其他的方法以外，通过对群或簇的数据点(分区)计数，求来自不同群/簇的分区计数的总和，从实际分区计数中减去计算的/预期的分区计数或它们的组合来确定。
G.确定靶水平
至少一种靶的水平可以基于被分类的分区以及任选地，基于已知、预期或假设的靶的彼此关联度来确定，62处所示。对于关联靶，靶的水平可以是大致相同的，在此情况下，仅一种靶的水平即可表示两种靶的水平。靶水平的确定可以(或可以不)基于在分区之中具有泊松分布的每种靶。每种水平可以尤其是，例如表示靶的阳性分区的总数量的值，或浓度值，诸如表示每分区或单位体积的靶的拷贝平均数的值。使用任何合适的算法，分区数据还可以用于估算拷贝数(CN)(例如，直接和/或作为浓度数据)和拷贝数波动(CNV)或样本的任何其他特性。
每种靶的水平(例如，浓度)可以用泊松统计学来确定。除了其他表示方式以外，浓度可以相对于分区或单位体积和/或相对于提供靶的样本来表示。通过假设靶的拷贝(在扩增前)在分区之中具有泊松分布，分区中靶的浓度可以从对于所述靶是阳性的分区的分数(或等同地，对于靶是阴性的分区的分数)来计算。利用这个假设，具有k个靶的拷贝的分区的分数f(k)通过下列方程式给出：
Figure BDA0004101788870000381
此处，C是靶在分区中的浓度，其被表示为每个分区的靶的拷贝的平均数(扩增前)。简化的泊松方程式可以从上面的更通用方程式导出，并且可以用于从阳性分区的分数确定靶浓度。可以使用如下的示例性泊松方程式：
Figure BDA0004101788870000391
其中，N+是对于给定靶为阳性的分区的数量(即，分区计数)，并且其中Ntot是对于所述靶为阳性或阴性的分区的总数。Ntot等于(a)所述靶的N+和(b)对于所述靶为阴性的分区的数目或N–的和。N+/Ntot(或N+/((N++N–)))等于f+，其是对于靶是阳性的分区的分数(即，f+＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(参见方程式1)，并且是具有模板的至少一个拷贝的分区的概率的测量估值。
可以使用的另一示例性泊松方程式如下：
Figure BDA0004101788870000392
其中，N–和Ntot如上所定义。N–/Ntot等于f–，其是阴性分区的分数(或1–f+)，是没有靶的拷贝的分区的概率的测量估值，并且C是如上所述的靶浓度。
上面的方程式2和3可以重新排列以产生下列方程式：
C＝ln(Ntot)-ln(Ntot-N+) (4)
C＝ln(Ntot)-ln(N-) (5)
多重测定中每种靶的浓度可以例如用方程式2至5中的任一个，使用所获得的对于每种靶的Ntot和N–或N+值(即，分区计数)来确定。在某些情况下，所使用的Ntot(总的分区计数)值可以对于每种靶是相同的。在其他情况下，诸如由于群体重叠，如果群体中的一些分区从总计数中排除，则Ntot值会改变。在某些实施方案中，Ntot可以相当于所有群的组合，即，用于所鉴定的所有群体的分区计数的和。
所用的N–值或N+值对于每种靶通常是不同的，并且可能由对各自包含待在多重测定中检验的靶的不同组合的多个分区群的计数求和而导致。例如，用于方程式2或4，对于多重测定中的三个靶(A、B和C)，对于靶A是阳性的分区的数量N+A可以计算为从单阳性(只有A)、双阳性(AB和AC)以及三阳性(ABC)群体计数的总和。相当于，用于方程式3或5，对靶A是阴性的分区数N-A可以计算为Ntot和N+A之间的差。可选择地，对于A是阴性的分区的数目可以计算为对于靶A是阴性的每个群中的计数的总和，即，在这个实例中，一个三阴性(“空”)群、两个单阳性群体(B和C)以及一个双阳性群体(BC)。对于其他靶中的每种靶，可以使用来自适当亚组的群体的分区计数重复相同的方法。
在某些实施方案中，靶(和/或对应的模板或生物粒子)的水平(例如，浓度)的估值可以从阳性分数直接获得，而无需使用泊松统计。具体地，阳性分数和浓度(每分区的拷贝数)在浓度减少时收敛。例如，对于阳性分数为0.1，浓度用方程式2被确定为约0.105，仅差5％；对于阳性分数为0.01，浓度确定为约0.01005，差小十倍，只有0.5％。不过，使用泊松统计可以提供更精确的浓度估值，尤其是具有相对更高的阳性分数时，因为泊松统计考虑了相同分区中的同一靶的多个拷贝的发生率。
下面是可如何确定一对连接的靶的浓度的非限制性示例。在某些情况下，可以采用另外的术语。
一对连接的靶A和B的浓度可以基于双阳性(AB)的计数和总的分区计数使用上面的方程式5的改良形式来确定。例如，假设100％连接，靶A和/或靶B的浓度可以如下计算：
CA/B＝ln(Ntot)-ln(NA+NB+N0) (6)
其中，NA是经检验只对A为阳性的分区的数量，NB是经检验只对B为阳性的分区的数量，且N0是经检验对两种靶均为阴性的分区的数量。在此情况下，每种单阳性(A或B)被认为是假阳性。
从上面的方程式6获得的浓度可以通过除以连接度(表示为分数)来校正/调节以考虑不完全连接：
CA/Bcorr＝CA/B/linkage (7)
例如，如果连接度是80％，则从方程式6计算的浓度将通过除以0.80向上调节以考虑未共定位于相同分区的靶的未连接的拷贝。
例如，如果假单阳性的比率高，则靶水平的确定还可以包括计算预期双阳性的数量。如果假设每个单阳性分区为假阳性，则假双阳性的数量可以如下计算：
Figure BDA0004101788870000411
其中，NA、NB和N0如上面关于方程式6所定义的。所计算的假双阳性的数量可以和所观察的双阳性的数量比较，以确定靶(和/或模板)是否以显著高于背景的水平存在。而且，可以从所观察的双阳性的数量减去所计算的(假)双阳性的数量以获得真实的双阳性的计数。随后获得的计数可以用在方程式6和/或7中以确定靶的浓度。
在等位基因特异性引物的情况下，其中外侧的引物可以给出不同的信号，诸如在野生型模板上的两个通道中的弱的信号，可以生成第五分区群。该第五群可以当做第二N0群处理，其可以与以上展示的任一个方程式中的的其他N0群组合。
图2示出了用于执行图1的数字测定的示例性系统80。除了其他组件以外，系统80可以包括分区组件，诸如液滴发生器82(“DG”)，热孵育组件，诸如热循环仪84(“TC”)，检测组件(检测器)86(“DET”)，以及数据处理组件(数据处理器)88(“PROC”)，或它们的任何组合。数据处理组件可以是控制器或被包括在控制器中，该控制器与组件通信并控制组件的任何合适组合。组件之间的箭头指示材料诸如流体(例如，乳液的连续相)和/或分区(例如，液滴)或组件之间的信号/数据的移动或传递。组件的任何合适组合可被可操作地彼此连接，和/或一个或更多个组件可不与其他组件连接，使得，例如，材料/数据被手动传递。
检测器86可以提供能够从中收集数据的多个光通道。检测器可以(或可以不)具有不同的用于每个光通道的传感器或检测单元。
系统80可以如下操作。液滴发生器82可以形成以连续相布置的液滴。液滴可以用热循环仪84热循环以促进液滴中靶的扩增。信号可以用检测器86从液滴中检测。信号可以由处理器88处理以确定，尤其是，液滴计数和/或靶水平。该系统还可以包括任选地驻留在计算机可读存储介质上的程序，其用于控制执行测定的方法的任何合适的方面。例如，程序可以包括指令，该指令用于，除了其他的以外，促使液滴发生器形成液滴、促使热循环仪促进靶扩增、促使检测器收集数据、促使处理器处理收集的数据或其任何组合。
可能适合用于本公开的系统的，尤其是，样本制备、测定设计、分区形成、数据收集、群体鉴定、分区分类、获得分区计数和靶水平确定的进一步方面在本公开的其他地方诸如下面在第III-V部分以及在交叉引用中提到的通过引用并入本文的参考文献中描述。
III.关联靶的示例性数字测定
本部分展示了本公开涉及执行具有增加的灵敏度，诸如检测的下限和/或区分单链模板和双链模板的能力的多重数字测定的方法的选择的方面和实施方案。这些测定可以对彼此连接的连接的靶和/或对被相同的生物粒子包含的关联/连接的靶进行。
A.复用分析的改进检测限值
本示例比较了一种靶(靶A)的单重测定和两种连接的靶(靶A和B)的多重测定的检测限值；参见图3、3A、4和4A。
图3示出了阐释在分区中只对一种靶100(靶A)执行的示例性的不太灵敏的单重数字测定的示意图。至少一个整体相102可以划分为直接形成的分区104，诸如液滴106的流体体积(或与来自一个或更多个其他整体相的其他流体体积组合)。整体相102包含以部分占有存在于分区104中的模板108(例如，核酸模板)的拷贝。因此，分区的亚组(诸如所示的“真阳性”液滴)包含模板的至少一个拷贝，而其余的分区不包含模板的拷贝(诸如所示的“阴性”液滴和“假阳性”液滴)。
除了其他形式以外，模板108可以如此处所示的是双链的或单链的。碱基对的存在或可能性存在(但所示的通常不是碱基对的实际数量)在图3以及附图的其他地方，通过跨核酸双链体的互补链的线段示意性地示出。
用于扩增模板108中的靶100的策略在整体相102中表示，但是该过程主要或只能在分区104形成之后发生。因此，扩增及其产物在整体相102中以虚线示出。用于示出整体相中的扩增和报告物构型的变化的这种惯例也已被用在本公开例示本文公开的多种多重测定的其他附图中。
靶100从模板108扩增以生成扩增子110的拷贝(可互换地称为被扩增的靶)。扩增子110的尺寸可以通过用于扩增的至少一种引物来界定。例如，在此处，靶100的一对引物，即，正向引物(FA)和反向引物(RA)确定被扩增的模板108的区域，以界定靶和扩增子110的端点。靶100的扩增可以通过报告物112来检测。
图3A示出了单独的报告物112。报告物的结构可以作为特异性结合靶和/或扩增子的探针114(例如，
Figure BDA0004101788870000431
探针，PA)。此处，探针114包括寡核苷酸116和发光团(例如，荧光团)118以及附接到寡核苷酸的猝灭剂120。寡核苷酸可以通过主要或至少基本唯一地与仅一种靶杂交提供靶特异性。荧光团和猝灭剂中的每一种可以(或可以不)通过共价键偶联至寡核苷酸。探针也可以或备选地可以包括用于DNA双链体的小沟的结合部分(小沟结合剂(minor groove binder))，其可以偶联至寡核苷酸并且发挥允许更短的寡核苷酸用在探针中的功能。在任何情况下，扩增可能修饰报告物，诸如通过降解寡核苷酸116以将荧光团118与猝灭剂120分离。当激发光照射时，荧光团随后能够更亮地发出荧光(在图3和附图的其他地方被示为荧光体的尺寸增加)，因为猝灭剂对光发射的影响减少或消除。
猝灭剂120被构造成以靠近性依赖的方式猝灭荧光团的光发射。因此，除了其他情况外，当相关的寡核苷酸结合被扩增的靶以增加荧光团与猝灭剂之间的距离时，或在靶扩增期间当探针被裂解并且荧光团和猝灭剂被解偶联时，从荧光团检测到的光可能增加。对于每个荧光团，猝灭剂可以是相同或不同的。此处，测定被设计为使得靶的存在导致强度的对应增加，因为扩增减少了猝灭。在其他测定中，相反的情况可能是真实的，使得靶的存在引起强度的对应下降(但是，检测相对于暗的背景的信号通常比检测相对于相反的亮的背景的信号更容易)。此外，某些实施方案可以被构建成没有猝灭剂，只要荧光和/或信号随扩增改变即可。
每个分区可以基于从该分区检测到的至少一个信号的幅度而被视为对于靶100(和/或模板108)是阳性或阴性的。例如，此处，被指定为阳性荧光的两个分区发出比被指定为阴性的分区更亮的荧光。不过，对于该靶被视为阳性的分区可能实际上并不包含模板108。此类假阳性可以通过多种机制发生，诸如在不存在靶扩增时由探针114产生的信号的随机变化、非特异性的探针裂解、引物/探针二聚体或其他脱靶扩增、扩增子拷贝的污染(例如，来自更早的实验的扩增子)等。在任何情况下，由于在标准测定中假阳性不能很容易地与真阳性区分，因此假阳性的存在提供了确定测定的灵敏度和靶检测的限值的噪音。例如，如果特定测定中的假阳性频率是每一千个分区一个，则真实阳性频率通常应当比该测定的真阳性频率明显更高以提供有效的结果。假阳性比率可以确定统计学上显著的结果所需的阳性分区的数量，因此，降低假阳性比率可允许从相同数量的分区获得更高的置信度或从更少的分区获得相同的置信度。
图4示出了例示大体上如在图3中进行，但是具有两个相连接的靶100(靶A和B)的示例性、更灵敏的多重数字测定的示意图。靶A如图3中用正向引物和反向引物FA和RA扩增，并且用靶A特异性探针PA检测。相似地，靶B用正向引物和反向引物FB和RB从模板108的另一区域扩增，并且用靶B特异性探针PB检测。靶特异性探针PA和PB可以因不同的荧光团而在光谱学上是不同的。PA包括荧光团118，而PB包括不同的荧光团122。靶A和B可以表示模板108的重叠或不重叠的区域。如果不重叠，则靶区域可以或可以不隔开超过每种靶区域的长度的长度。靶区域(和/或A和B的扩增子110)可以(或可以不)是大约相同的尺寸，诸如长度相差小于约50％或25％。
附接到探针的各自寡核苷酸的荧光团可以是相同或不同的。荧光团可以在不同的通道中产生信号或在相同通道中产生可检测而且可区分的信号，从而允许在该通道中的多重化。信号是可区分的，因为一个荧光团相对于另一荧光团，荧光的方位(aspect offluorescense)是不同的。例如，在反应后，与一个荧光团相关的强度可以低于或高于与其他荧光团相关的强度。在某些实施方案中，一个探针可以用与该另外的探针不同的多种荧光团标记，和/或探针可以被定位在略微不同的局部环境中，在反应后形成对于每种探针的不同荧光水平。可选择地或除此以外，两个探针可以用相同数量的荧光团(例如，一个荧光团)标记，但是样本中可能存在一个探针的荧光团比另一探针多或少，以便当反应已发生时，形成更大或更小的信号。在某些情况下，荧光团自身可以是不同的，在特定通道中，一个荧光团可能比其他荧光团内在地发出更强或更弱的荧光(例如，由于消光系数、量子产率、光谱输出等的差异)。除了其他荧光团以外，可能合适的示例性荧光团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE等。
每个分区104可以基于该分区对靶A和B两者是否测试为阳性而分类为阳性或阴性。例如，此处，在左侧示出的真阳性(“真AB”)包含模板108的至少一个拷贝并显示出来自两个荧光团118、122特征性靶扩增的光发射。对于任一靶或两种靶的扩增测试为阴性的分区可以视为对于模板108(和两种靶)是阴性的，124处所示。最后，可能发生假双阳性，其中，多个分区显示出对靶A和B两者的阳性信号，却不包含模板108。不过，在上面关于图3所述的单重测定中，此类假双阳性应当远不如单假阳性的发生频繁。例如，只用于例证，仅意在用于解释，如果在特定测定设置中，每种靶的假单阳性的频率是一千个分区一个，那么假双阳性的频率应当接近每一万个分区一个，相对于单一靶分析，灵敏度呈两倍对数增加且检测限值呈两倍对数减少。
在某些情况下，对于连接的靶的外侧引物FA和RB可以一起充当另一引物对。外侧引物可以扩增模板的包括靶A和B两者以及从一种靶延伸到另一种靶的连接序列的较长区域。分区中通过该第三扩增反应产生的信号可能能够与只利用其各自的引物对扩增单独的靶A、单独的靶B以及靶A和B所产生的信号区分开。例如，该第三扩增反应可以产生明显较弱的信号，因为模板的较长区域的扩增可能明显不如对应于每种单独的靶的较短的区域扩增有效。如果任一靶的单独扩增如此有效地超越第三反应以致于第三反应被完全掩盖，则第三放大反应可能是检测不到的。通过选择彼此明显隔开的连接的靶，利用外侧引物的扩增所产生的任何信号的幅度可能被降低或变得检测不到。例如，所述靶可以被置于模板的相对末端附近，以增加靶之间的间隔序列的长度。不过，在某些测定设置(参见下文)中，靶彼此重叠，其中内侧引物(RA和FB)结合并因此不能沿模板彼此隔开，但是可选择外侧引物FA和RB的位置和/或序列含量，使得通过外侧引物扩增所产生的较长产物是不被支持的。在任何情况下，利用外侧引物扩增所生成的信号(如果有的话)可以被忽略或可以明确地用于确定一对相连接的靶是否存在于各个分区中。
图4A示出了图4的多重数字测定中可以从分区收集的荧光强度(fl.int.)数据的示例性散点图。在该图中，数据点的群或簇通过圆圈示意性地表示，各个群中数据点的相对数目通过圆圈的相对尺寸示意性地表示。每个数据点表示一个分区并根据在一对通道(通道1和2)中对该分区收集的信号值在该图中定位。此处，通道1测量来自荧光团118的荧光，并通过通道2测量来自荧光团122的荧光(参见图4)。这些群在该图中被标识为双阴性(-)、单阳性(A或B)以及双阳性(AB)。例如，可以预期靶A和B表现出约90％的连接度。对于这种连接度，只有一小部分的单阳性分区(在A和B群内以虚线中示意性地指示)将是真阳性的，而剩余的单阳性分区将是假阳性的。而且，即使当来自靶A或B的实际模板时，单阳性通常只表示部分模板，而不是通过两个靶的同时检测指示的较长的模板。同样地，基于假单阳性分区的频率，只有一小部分的双阳性分区(AB群内的虚线所指示的)将是假阳性的。
B.用于连接的靶的多重测定的设置
该示例描述了用于连接的靶(靶A和B)的多重测定的示例性设置；参见图5-7。
图5示出了阐释用于图4的多重数字测定的另一示例性整体相102的示意图。图5中示出的测定设置可以在两个方面中的至少一个方面不同于图4的设置。首先，用于扩增靶B的引物可以彼此间隔更远以生成比A扩增子明显更长，诸如长至少50％或是A扩增子至少两倍长的B扩增子。其次，用于靶B的探针PB可以在光谱学上不同于用于靶A的探针(PA)。虽然同一荧光团118可以存在于每种探针中，但是从用于每种靶分析的探针发出的光(降解)可以根据强度来区分。例如，此处，靶B的扩增被示为不如靶A的扩增有效，因为较长模板的扩增可能没有对较短模板的扩增有效。结果是产生比B扩增子的拷贝更多的A扩增子的拷贝，以及比探针B(PB)的降解更多的探针A(PA)的降解。
图6示出了阐释对于图4的多重数字测定的另一示例性整体相102的示意图。图6中示出的测定设置使用了与图5对于两种靶测定使用的荧光团相同的荧光团118，并且基于每种靶测定发出的光的强度将两种测定区分开。不过，扩增子A和B的长度是大约相同的。对于每种靶的存在的可辨认的强度可以通过用不同量的荧光团118标记靶A和B的探针来生成。在本图解中，探针B比探针A包含更多的荧光团118，并且对于靶A的存在产生比靶B更强的信号。两种靶A和B的存在可以产生甚至更强的信号。因此，基于从一个分区测量的荧光强度，可以将该分区分类为(和/或可检测为)对于两种靶阴性(较低信号)，仅对A阳性(较高信号)、仅对B阳性(也是较高信号)或对于靶A和B均为阳性(最高信号)。在其他示例中，对于每种测定，通过调节尤其是，用于测定的至少一种引物浓度、至少一条引物的序列(例如，增加或减少该引物的解链温度(Tm))、探针浓度或它们的任何组合，可以产生可区分的强度。
虽然上述讨论假设对于给定数量的延伸事件的裂解率相同，但是探针的解链温度(Tm)(结合产物)可能导致裂解率不同。通过使这些探针中的一个具有较高的Tm，可以产生可区分的强度，因此每个延伸步骤的裂解概率更高。可选择地，如果Tm较低，则探针将较少地被裂解。因此，可以产生不同的信号强度和/或可通过选择具有不同解链温度的探针调节信号强度。
图7示出了例示图4的多重数字测定的又一示例性整体相102的示意图。在此处所示的测定构型中，图4的序列特异性探针已被报告两种靶的扩增的报告物130(例如，嵌入染料)代替。根据由结合到扩增子A和B的报告物所产生的荧光的不同强度，两个测定是可区分的。通用报告物可以生成与一个分区中扩增子的质量或总长度成比例的针对该分区的荧光发射。在本图解中，每种扩增子的相同数量的拷贝通过扩增每种靶来生成，但是B扩增子比A扩增子长，这使得相对于A阳性分区，B阳性分区产生更强的信号。在其他情况下，如果长度的增加产生扩增效率的不成比例的下降，则较长的扩增子可能产生比较短的扩增子弱的信号。
C.等位基因特异性多重测定
该示例描述针对等位基因的、基于在等位基因处重叠的靶扩增的多重测定的示例性设置；参见图8-10。
图8是示出了阐释对于图4的多重数字测定的另一示例性整体相102的示意图。在所示的设置中，靶A和B在等位基因变异的位点140处重叠，其中，至少两个在位点140处不同的等位基因序列142、144存在于所述样本中，和/或更普遍地存在于获得所述样本的群中。示例性等位基因序列包含单核苷酸多态性、多个核苷酸多态性、缺失、插入、重排等，和/或因单核苷酸多态性、多个核苷酸多态性、缺失、插入、重排等而可彼此区分。在任何情况下，每种靶测定(对于A和B)可能是对同一等位基因特异性的，诸如特异性地检测具有等位基因序列142的突变模板146(或第一等位基因)而不是具有等位基因序列144的野生型模板148(或第二等位基因)。更特别地，由于核苷酸序列在等位基因变异位点的差异，正向B引物(FB)和反向A引物(RA)不引发野生型模板148上的扩增。
图9是阐释如图8中的用于执行对一对等位基因特异性测定的另一示例性整体相的示意图。此处，图8的探针和等位基因特异性引物被也充当扩增报告物的标记的等位基因特异性引物(FB和RA)标记。每个被标记的引物可以具有发夹结构150，该发夹结构150将猝灭剂放置为接近结合的荧光团定位以猝灭来自荧光团的光发射。当引物被并入双链扩增子时，发夹结构可能被消除，从而产生增加的荧光。
图10示出了用于图9的等位基因特异性测定的示例性标记的等位基因特异性引物RA和FB。这些引物被示出与突变型模板146的有义和反义链152、154、野生型模板148的有义和反义链156、158配对并且彼此配对。各个碱基对(实际或潜在的)被示为垂直的条，错配通过字母X指示。
在所示的实施方案中，中心或内部引物RA和FB不在等位基因变异的核苷酸处结束，而是彼此具有高程度的重叠，并且使用有意的错配使引物不稳定。假设单核苷酸多态性将两种靶区分开的话，引物可被选择为各自具有与靶序列(例如，突变的链152、154)的几个错配(例如，两个)，但是与密切相关的模板(例如，野生型链156、158)具有一个额外的(或更多个)错配。因此，虽然引物在突变型序列上是部分不稳定的，但是它们在野生型序列上更加不稳定，导致突变型和野生型之间更好的区分。重叠的引物RA和FB可以同时结合分区中的突变型模板146的一个拷贝的两条链。而且，如果选择适当的话，有意的错配不仅可以导致在突变型序列上比在野生型序列上的更大稳定性(或反之亦然)，而且可以导致由重叠的引物形成的潜在引物二聚体高度不稳定(图10的底部所示)。例如，如果每条引物对于突变型模板具有两个错配而对于野生型模板具有三个错配，则它们可能具有与彼此的四个错配，如此处所示的。这样一来，潜在的引物二聚体是极不稳定的并且因此不干扰多重测定。
等位基因特异性引物可被修饰以防止聚合酶的5’降解。可能合适的示例性改性包括硫代磷酸酯键、2’O-甲基碱基(2'O-methyl base)、锁核酸结构、肽核酸等。此处公开的方法与Competitive Allele-Specific
Figure BDA0004101788870000491
(CAST)和其他竞争性测定兼容。因此，等位基因特异性阻断剂可以存在于测定中以抑制由错误等位基因的扩增所产生的信号(如果有的话)，但是本文公开的等位基因特异性测定可以去除CAST PCR。
D.单链和双链模板的多重测定
该示例描述用于区分和定量单链和双链模板的示例性多重测定；参见图11-13。
图11示出执行单链模板和双链模板的多重数字测定的示例性方法160的流程图。此处展示的方法的步骤可以以任何合适的顺序和组合来执行，并且可以与本公开的任何其他合适的方面组合或被其修改。这些模板可被可互换地称为单链和双链分析物。
以局部占有包含模板的分区可被提供(例如，形成)，162处指示所示。双链模板具有第一链和第二链，二者彼此互补并能够碱基配对形成双链体。单链模板和第一链都包含可用同一引物或引物对扩增的第一靶。第一靶可在序列上可与单链模板和第一链相同或相关，但不同于单链模板和第一链。在任何情况下，单链模板和第一链共享具有序列相同性或相似性的至少一个区域，该区域包括对于相同的一条或更多条扩增引物的一个或更多个引物结合位点。单链模板和第一链可以具有完全的序列相同性或一个或更多个序列不同的区域。
第一靶和第二靶可以被扩增，164处所示。第一靶代表第一模板和第二模板的第一链，而第二靶代表第二模板的第二链。换句话说，每种靶都是链特异性的。可收集用于靶的扩增的数据，166处所示。
每个模板的水平诸如浓度可以基于该数据来确定。在某些情况下，双链模板的浓度可以基于经检验对于两种靶是阳性的分区的计数来确定，而单链模板的浓度可基于经检验只对第一靶为阳性的分数的计数来确定(任选地伴随对预期的偶然包含两个模板的分区的校正/调节)。在任何情况下，该数据可以包括用于单链和双链模板的不同信号，并从而允许两个模板各自的量的定量测量。
图11的方法可用于区分单链模板和双链模板。双链模板在两种靶测定中生成信号并且共定位是非随机的。因为只存在一个链，单链模板示出仅在一种靶测定中的信号，并且与双链模板的共定位是随机的。
在许多情况下，单链模板的量或单链模板对双链模板的比是内在地信息性的。例如，区分前体-miRNA(双链)与成熟miRNA(单链)、区分基因组DNA(gDNA)(双链)和mRNA(单链)(如果对于mRNA到cDNA的逆转录和cDNA的扩增使用一步骤混合)、基因组DNA(gDNA)(双链)和cDNA(单链)等。
基于同源双链形式或异源双链形式的产物的差异化解链表征序列差异的多种技术(DGGE、COLD-PCR、HRM等)是已知的。基于所观察到的连接度，在处理和表征产物是单链还是双链的之后对所述产物进行分区是表征序列差异的另一种方式。
图12示出了阐释用于图11的多重数字测定的示例性整体相102的示意图。存在单链模板180和双链模板182。模板180和模板182的第一链184各自提供相同或相关的第一靶，该第一靶可通过单条引物RA的线性扩增扩增以生成单链扩增子188。扩增子188的生成可用探针PA检测，探针PA被裂解以产生荧光团118的增加的荧光。模板182的第二链186提供第二靶，该第二靶可通过单引物FB的线性扩增而扩增以生成单链扩增子190。扩增子190的生成可用探针PB检测，探针PB被裂解以产生荧光团122的增加的荧光。在其他实施方案中，两种靶的探针可能不是光谱学上不同的。在其他实施方案中，通过支链化的DNA、滚环扩增等，扩增可变成指数级的。
图13示出了例示图11的多重数字测定的另外的示例性方面的示意图。此处，描述了用于指数级扩增链特异性靶的策略。第一轮引物RA或FB可用于执行第一、低严格循环的扩增。每条第一轮引物可以具有不成对的5’末端200和/或与模板的一个或更多个内部错配。第一轮引物可以以较低的严格度(例如，较低的退火温度)而不是以较高的严格度(例如，较高的退火温度)在对应的模板上有效地引发。在该第一轮期间所产生的链并入了完整的引物序列，提供适合在下一轮中以更高严格度结合第一轮引物的修饰的产物模板。因此，在第一、低严格度循环的扩增期间所生成的链生成用于使用引物对FA和RA以及FB和RB在较高严格度下进行的下一轮扩增的产物模板，但是初始模板不能。结果，每种靶的扩增依赖正确的模板链存在于第一循环之前。经检验仅对第一靶为阳性的分区包含单链模板，而对于第一和第二靶两者均为阳性的分区包含双链模板(以及，也随机地包含单链模板)。
E.进一步的方面
本部分描述了关联靶的多重测定的进一步的方面。
多重测定可被设计成区分单链靶与双链靶。多重测定可以包括两个测定。所述双链靶可以在两个测定中生成阳性信号，并且共定位应当以高于单独的偶然性的频率发生。如果其他链不存在于分区中，则单链靶可能展示来自仅一个测定的信号，或可能在两个测定中生成阳性信号(双阳性)，但这是由于与双链靶的拷贝的偶然共定位。
在分区之前变性模板可以使阳性分区的数量翻倍。本公开包括确定单链靶和双链靶的水平，以及任选地确定涉及两种水平的比，因为单链产物的水平在许多情况下是固有地信息性的。例如，区分前体-miRNA(双链)与成熟miRNA(单链)、区分基因组DNA(双链)与RNA(单链)(如果使用一步骤混合)，或基因组DNA(双链)与cDNA(单链)。本领域中基于同源双链或异源双链形式的产物的差异化解链表征序列差异的各种技术(DGGE、COLD-PCR、HRM等)是已知的。在处理和表征产物是单链还是双链的之后对所述产物分区是表征序列差异的另一种方式。
两种等位基因特异性测定的使用提供了多重测定的另一示例。如果
Figure BDA0004101788870000521
探针被充分补偿(offset)，则它们可用于测定。另一实施方案可以使用两条等位基因特异性引物，一条靶向针对每条链，并且各自以各自链的SNP位点上的3’碱基收尾。这些等位基因特异性引物也可以充当探针(例如，/>
Figure BDA0004101788870000522
引物、/>
Figure BDA0004101788870000523
引物、具有内部RNA碱基的荧光引物等)，但是其他实施例是可能的。同样地其可利用嵌入染料，诸如/>
Figure BDA0004101788870000524
染料作为用于两种测定的非特异性报告物完成，并将这些测定设计成具有可区分的荧光终点(不同幅值的)。不过，在每种引物上使用具有不同荧光团的标记的引物是最简单的例示方法。
取决于所使用的聚合酶，等位基因特异性引物各自可具有防止每条引物从其5’端降解的修饰。修饰可以是例如一个或更多个硫代磷酸酯键、2’O-甲基碱基、锁核酸等。在上游约3bp处使用有意的错配碱基或用于等位基因特异性PCR的其他已知的特异性增强子可能是有利的。
除了等位基因特异性引物结合区域，扩增子可以不重叠。如果使用基于探针的测定用于检测，每个扩增子可以具有其自身的反向引物和探针。
该方法的缺点是，等位基因特异性PCR具有假阳性率，并且引物序列并入到扩增子中。因此，一旦发生失误，便丧失了对该扩增子的辨认。如果扩增子被补偿，则在一个测定中的错误并入不会导致其他测定错误引发。结果，将产生一个对于一个分区假阳性，但不是对于该分区中的两种测定的假阳性，除非两条链上都有错误并入。与常规方法相比，这种方法应当大大降低了假双阳性率。
对于检测下限限值的一个基本限值是假阳性率。从根本上讲，LOD不仅需要比假阳性率高，而且它可能需要高到足以使少于5％的最丰富的假阳性低于LOD预期的分布的最低5％。因此，真实或平均LOD可以是比观察到的假阳性的数量高的适当的量。真正降低LOD的一种方法是，使用靶向同一模板的两种测定并寻找共定位以从假阳性中找出真阳性。实际的假阳性率或假双阳性率应当比单假阳性率低得多。因此，真实LOD可被降低到这样的限值，其中测定的假阳性不再是下限的主要限制因素。那么，可以通过steath孔以及其他方法降低的如残留物之类的事物可以是较低的限值。这连同分别定量不同的靶，例如在隔开的孔中检测HIV和人类DNA，是特别有用的。如果两种测定都针对HIV，一种测定通过FAM染料标记的探针且一种通过VIC染料标记的探针，并且只将双阳性表征为阳性，则我们可能能够实现较低的LOD。由于测定失败或DNA降解，可能存在假阴性率。这一点可被单独测量和考虑，或以其他方式被补偿。
数字PCR测定中的假阳性率可以由几类可能的“假”阳性液滴组成：尤其是残留物、样本污染液滴和测定假阳性液滴。甚至低的假阳性率对LOD具有相对大的影响。区分假阳性和对低丰度样本观察到的比率的能力不理想。该两测定方法主要测定假阳性。假阳性可以是引物/探针二聚体、其他脱靶扩增或探针的非特异性裂解。当污染源是在较早的反应中产生的扩增子时，这种方法也可以是有利的，因为不同的靶将无法连接。
多重测定可被设置为包括靶向同一靶(例如，同一模板)的不同区域的至少两种测定。只有对两种测定均为阳性的分区对于感兴趣的模板是阳性的。每种测定可能具有假阳性率，但是除非测定相互作用，否则比率将是彼此独立的。假双阳性率可以通过两种单阳性的丰度来确定，但是可能远低于任一单阳性率。在假阳性是相对少见的方案中，假双阳性的比率可能是极低的。
浓度估值可以以多种方式修正。可以引入一种校正，其基于两种单阳性率，考虑“预期的”双阳性(在LOD是重要的大多数加样条件下可能是小的)。可以引入基于尤其是连接度、模板的降解状态和测定之间的固有测定失败率的对真单阳性的校正(实际是假阴性)。其他靶(诸如HIV测定中的人类gDNA)可以在同一多重测定或不同测定中测量，例如在独立的孔中测量。
IV.基于关联靶鉴定生物粒子
本部分展示了本公开选择的方面和实施方案，涉及对关联靶的数字测定来检测、鉴定和定量生物粒子诸如生物细胞和病毒粒的方法；参见图14-18。
A.引言
可检测来自生物体的核酸和蛋白质以搜索有用的基因、诊断疾病或鉴定生物体。被设计为描述样本中的生物体多样性或鉴定分析物生物体的分子学方法经常依赖对通过PCR(聚合酶链式反应)扩增的异源核酸分类。所得的混合扩增子能够使用T-/RFLP(末端限制性片段长度多态性)、SSCP(单链构象多态性)或T/DGGE(温度/变性梯度凝胶电泳)快速但是粗糙地分类到匿名的组中。这些组可以通过测序来分类，但是这需要另外的劳动来物理分离每个16S RNA型，无法很好地成比例地用于大的对比性研究诸如环境监测，并且仅适合用于复杂性低的环境。而且，足以对样本中的大多数分类单元编目录所需的克隆数太大而不能有效或经济地处理。最终，结合配偶体或其他检测试剂的交叉反应性使得难以明确地鉴定特定的生物体。因此，需要有效地分析多个生物体而无上述技术的缺点的方法。
本公开提供了用于鉴定和定量感兴趣的生物粒子的系统，包括方法、组合物和试剂盒。提供了鉴定感兴趣的粒子类型的示例性方法。在该方法中，可以提供样本，该样本包括至少两种类型的生物粒子或从其制备的核酸。所述样本可以被划分为一组分区。可以检测每个分区内至少两种靶中的每一种靶的存在或不存在。单个分区中所述至少两种靶的特定组或亚组的存在鉴定所述单个分区中的细胞或病毒粒的类型。
使用核酸靶的细菌和其他生物体的分子检测往往受测定的特异性限制。成功区分已知物种的测定可能与其他未知物种交叉反应，无论这些菌种是否密切相关。至于病原体检测，可能与其他物种存在交叉反应，无论它们是否是致病性的。不过，一个结合配偶体组往往不足以实现期望的特异性。定量PCR或qPCR可用以检测和鉴定生物体。不过，特别是对于RNA靶，生物体之间的丰度差异使得难以或不可能实现关于样本中有机体丰度的相对或绝对定量性数据。利用多个结合配偶体的组(引物和/或探针)的方法可以增加特异性，但是可能难以或不可能区分对期望的分析物生物体的检测与两种或更多种不同交叉反应性生物体的混合物。
包括分区步骤的用于检测生物体的方法，通过同时测定分区的两种或更多种靶，可以极大地改善检测。此类方法可以提供测量一组分区中的多种靶(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)的共定位的能力。在某些情况下，所述多种靶是相关联的。例如，所述多种靶可以存在于单个粒子中。又举例，所述多种靶可以存在于单片核酸，例如cDNA、质粒、染色体、RNA转录物、rRNA、cRNA、基因组或线粒体或叶绿体基因组中。因此，检测分区中的多种靶的共定位可以鉴定到包含感兴趣的生物粒子或从其制备的核酸或被包含在感兴趣的生物粒子内的分区。可将共定位的观察频率与随机共定位的预期频率比较，以确定非随机共定位的频率，从而确定包含感兴趣粒子的分区的数量。
在某些实施方案中，本文提供的方法、组合物和试剂盒提供改进的对感兴趣的生物体或生物体的组的检测。在某些情况下，改进的检测通过检测每种靶不是对感兴趣的粒子、生物体或组的类型特异性的多种靶来提供，而且也鉴定不感兴趣的粒子、生物体或组的一种或更多种其他类型(即，靶表现出交叉反应性)。在一组分区的各个分区中检测具有不同的交叉反应性的多种靶的共定位可以对提供不同类型生物粒子之间的区分，即使没有单个靶仅对感兴趣的一种类型是特异的。
通过对样本分区并检测至少两种靶在各个分区中的存在或不存在，提供了用于鉴定样本中的一类或更多类粒子的方法、组合物和试剂盒。此类方法、组合物和试剂盒对于确定样本中某类粒子的存在可能是有用的。在某些情况下，此类组合物和试剂盒对于确定样本中某类粒子的相对丰度和绝对丰度可能是有用的。此类方法、组合物和试剂盒对于诊断与某类感兴趣粒子的存在或不存在相关的疾病或状况也可能是有用的。
B.用于检测感兴趣生物粒子的组合物
在一个方面，本公开涉及使用结合靶(和/或对应产物)的两种或更多种特异结合配偶体检测样本中的某类感兴趣生物粒子的方法，所述靶由该类生物粒子提供或从其形成。不受特定理论束缚地，据信当样本被分区成在每个分区具有少量的靶时(例如，每个分区平均少于约5、4、3、2或1个靶)，可以计算多种不同靶将偶然共定位于特定分区的可能性。由于多种不同特异结合伙伴结合伙伴和感兴趣的颗粒的靶(或来自其的产物)被迫物理接近，其结合产生结合配偶体的共定位。感兴趣粒子的存在增加共定位的频率。
类似地，当样本被分区以使得每分区存在少量的感兴趣的粒子时(例如，每分区具有平均少于约5、4、3、2或1个感兴趣的粒子)，一组粒子中(例如，2个或更多不同的类型)将在一个分区中共定位的可能性可被减到最小或计算并调整，其中所述一组粒子各自与不同组的特异结合配偶体反应。因此，对于被分区为每分区具有少量靶和/或粒子的样本，靶/粒子在分区中共定位的丰度可以用于计算感兴趣粒子的绝对或相对浓度。
在某些实施方案中，该方法包括使用特异结合配偶体检测靶，所述特异结合配偶体可以是报告物。例如，第一靶可以使用第一特异结合配偶体或第一组特异结合配偶体来检测，且第二靶可以使用第二特异结合配偶体或第二组特异结合配偶体来检测。检测步骤可以在适合使第一和第二结合配偶体或组特异结合第一和第二靶(或来自其的产物)的条件下执行。在某些实施方案中，每种特异结合配偶体被连接标记(例如，第一结合配偶体具有第一标记，第二结合配偶体具有第二标记等)并检测两种或更多种标记(例如，第一标记和第二标记)在至少一个分区中的存在、不存在和/或共定位。
在某些实施方案中，本公开提供包括分区的组或组合物，每个分区小于约100nL并且每个分区包含少于约2、3、4、5、6、7、8、9或10个感兴趣的粒子或从其制备的核酸；基团特异性靶检测试剂；物种特异性靶检测试剂；以及核酸扩增试剂。
i.样本
本公开的方法可以用于检测任何类型的样本中一种或更多种类型的生物粒子中的每种粒子的一个或更多个拷贝。在某些实施例中，样本是生物样本。可能合适的样本的进一步的方面在本文的其他地方如上面的第I和II部分描述。
ii.靶
在某些实施方案中，待检测的两种或更多种靶是肽、蛋白质(例如，抗体、酶、生长调节剂、凝结因子、磷蛋白等)、多核苷酸(例如，DNA，诸如rDNA、dsDNA或ssDNA；RNA，诸如rRNA、mRNA或miRNA；DNA-RNA杂合体；等)、适体、免疫原、肽核酸、病毒、病毒样粒子、多糖、碳水化合物、脂质、毒素(例如，病毒毒素或细菌毒素)、微生物、药物化合物或代谢物中的一种或更多种。在某些实施方案中，待检测的靶是蛋白质。在某些实施方案中，靶是RNA，例如基因组RNA、rRNA、前体-mRNA、mRNA或miRNA。
在某些实施方案中，靶是rRNA或rDNA序列(即，核糖体RNA或DNA序列)。例如，靶可以是5S rRNA或rDNA、16S rRNA或rDNA、18S rRNA或rDNA、23S rRNA或rDNA、28S rRNA或rDNA或其组合。因此，本公开的靶可以检测来自所有生物界的所有病毒和分析物生物体。在某些情况下，一种靶是rRNA或rDNA序列且另一靶不是rRNA或rDNA序列。例如，一种或更多种rRNA或rDNA序列可被检测以鉴定细菌的属或种，且第二靶可以经检测以鉴定毒力岛(pathogenicity island)的存在。因此，该属和种的靶以及毒力岛靶在分区中的共定位将提示携带毒力岛的该属或种的生物体的存在。
在某些情况下，至少两种靶对应于rRNA或rDNA。例如，一种靶可以是具有交叉反应性特征的群特异靶或对应于具有交叉反应性特征的结合配偶体的群特异性靶，所述靶对应于在一组分子物生物体之间保守的rRNA或rDNA序列。另一种靶也可以是具有不同交叉反应性特征的群特异靶或对应于具有不同交叉反应性特征的结合配偶体的群特异性靶，对应于在相同群的分析物生物体之中保守的rRNA或rDNA序列，所述另一种靶对应于在同一群的分子物生物体之间保守的rRNA或rDNA序列。因此，检测出两种靶的分区将被标识为包含该群的分析物生物体的成员。相反，仅检测出两种靶中的一种靶的分区将被标识为不包含该群分析物生物体的成员。
在某些实施方案中，二、三、四、五或更多种不同的靶要被检测。在其中两种或更多种不同靶待被检测的某些实施方案中，所述两种或更多种不同靶是相同类型的分子(例如，细胞中存在的两种或更多种蛋白质或两种或更多种的DNA多核苷酸)。在其中两种或更多种不同靶待被检测的某些实施方案中，两种或更多种不同的分子是不同类型的分子(例如，与细胞相关的蛋白质相互作用的药物化合物或rRNA和质粒)。
待分析的样本中特定靶的拷贝数可以是0或约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000或50000或更多。在某些实施方案中，样本包含低浓度和/或低拷贝的两种或更多种靶。
在某些实施例中，在同一靶分子上发现两种或更多种靶。例如，各自处于或靠近靶分子的不同末端的两种或更多种靶可以提供对全长靶的检测或对全长与截短的靶分子之间的区别。例如，一种靶可以包含核酸的5’端，而第二靶可以包含核酸的3’端。包含两种靶的分区包含具有全长靶分子的分析生物体。例如，包含不存在5’调控序列的癌基因的肿瘤细胞可以使用两种或更多种靶鉴定。此类细胞可以与包含存在5’调控序列的原癌基因形式的非肿瘤细胞区分开来。
在某些实施方案中，靶包含突变、多态性、常常被突变的蛋白质或核酸的区域。包含常见多态性的靶的检测可以提供对包含该多态性的生物体的检测。例如，靶可以是携带相对于野生型的点突变(例如，SNP)的核苷酸序列。靶在分区中的检测鉴定具有该点突变的分析物生物体。具有一种生物体特异性靶的生物体在未检测出该点突变靶的分区中的检测鉴定野生型生物体。可选择地，所述靶可以是野生型序列。在该示例中，野生型序列在分区中的检测鉴定野生型生物体。相反，具有生物体特异性靶的生物体在未检测出野生型序列靶的分区中的检测鉴定包含突变的生物体。
在某些实施方案中，用于检测全长与截短的核酸或蛋白质的两种或更多种靶可以与用于检测突变或野生型序列的一种或更多种靶组合。例如，分析物生物体可以包含蛋白质的氨基末端的靶、相同蛋白质的羧基末端的靶以及突变热点的野生型序列的靶。氨基和羧基末端在分区中的检测可以鉴定具有全长蛋白质的生物体。野生型序列靶在同一分区中的检测可以将该生物体鉴定为具有野生型蛋白质。相反，野生型序列靶在同一分区中不存在的检测可以将分析物生物体鉴定为具有该蛋白质中的突变。
本公开的靶包括群特异性靶。群特异性靶包括对应于靶分子的组的靶。例如，群特异性靶可以对应于一组靶分子的保守区域。在其它情况下，群特异性靶是对应于一群分析物生物体并因此鉴定该分析物生物体(例如，对应于一个属的生物体)的靶或靶的组。群特异性靶可以检测与不止一种分析物生物体或一种分析物生物体以及非分析物生物体相关的靶。
例如，群特异性靶可以对应于一个属或其他分类(例如种、科、纲、目、门、界)的生物体。在某些实施方案中，群特异性靶可以对应于特定分析学类别的病毒(例如，RNA病毒、DNA病毒、腺病毒科(adenoviridae)、小病毒科(parvoviridae)、呼肠病毒科(reoviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)等)。可选择地，群特异性靶可以对应于未由特定分类单元或分类单元的组界定的生物体群。例如，群特异性靶可以对应于共享特定毒力岛的生物体或共享在该群之间保守的任何靶的生物体。
群特异性靶还可以对应于多种细胞类型，诸如癌细胞、免疫细胞、T细胞或特定组织或器官的细胞。在某些情况下，群特异性靶可以对应于特定类型的癌细胞(例如，淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肝癌)。
在某些实施方案中，群特异性靶表现出对分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些群特异性靶可以对应于分析物生物体金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的株，而且还可以对应于非分析物生物体表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的多种株。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种群特异性靶可以提供改进的对特定株、种、属或其他群的分析物生物体的鉴定。
本公开的靶也包括种特异性靶。种特异性靶是对应于数量更受限制的分析物生物体的群特异性靶。例如，某些种特异性靶对应于分析物生物体的特定种或亚种。例如，本发明的某些种特异性靶可被检测以鉴定金黄色葡萄球菌的多个株，但是不能被检测以鉴定总体的葡萄球菌属。
在某些实施方案中，种特异性靶表现出分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些种特异性靶对应于分析物生物体金黄色葡萄球菌的多个株，而且还可以对应于非分析物生物体表皮葡萄球菌的多个株。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种种特异性靶，或一种或更多种群特异性和一种或更多种种特异性靶的组合可以提供改进的对分析物生物体的特定株、种或其他群的鉴定，其中至少一种群特异性靶和一种种特异性靶表现出不同的交叉反应性。
本公开的靶也包括株特异性靶。株特异性靶是对应于特定分析物生物体的靶。例如，某些株特异性靶对应于分析物生物体的特定株。例如，本发明的某些株特异性结合配偶体对应于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的特定株，而不对应于总体的金黄色葡萄球菌的多个株。
又例如，本公开的某些株特异性靶对应于与特定分析物生物体相关的特定突变或其他分子靶。例如，本公开提供对应于一种或更多种致癌突变(例如，Ras、KRAS、p53、SRC、MYC等的突变)或肿瘤抑制因子(例如，BRCA1、BRCA2等)的一种或更多种突变的靶。又例如，提供了对应于癌症恶性病变、侵袭性或转移的一种或更多种指示物的靶。再例如，提供了对应于组织类型(例如，肝细胞、皮肤细胞、骨髓细胞等)或细胞类型(例如，T-细胞、B-细胞、造血细胞等)的一种或更多种指示物的靶。
在某些实施方案中，株特异性靶表现出分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些株特异性靶可以对应于分析物生物体甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的特定菌株，而且还可以对应于非分析物生物体的一个或更多个株。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种株特异性靶，或至少两种表现出不同的交叉反应性的群、种或株特异性靶的组合可以提供改进的对分析物生物体的特定株、种或其他群的鉴定。
株特异性靶包括对应于病原性或恶性病变的标志物的靶。例如，株特异性靶包括对应于和甲氧西林抗性相关的标志物的靶。又例如，株特异性靶包括对应于毒力岛诸如溶血素、细胞毒性坏死因子、肾盂肾炎特异蛋白质、与病原性相关的菌毛蛋白序列、鼠疫耶尔森氏杆菌(Yersinia pestis)强毒力岛、鼠疫耶尔森氏杆菌pPCP1和pMT1、沙门氏菌(Salmonella)SP1和SP2、马红球菌(Rhodococcus equi)毒性质粒、金黄色葡萄球菌毒力岛的SaPI家族、中毒性休克综合征毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)的神经毒素、绿脓杆菌(Psuedomonas aureginosa)的细胞毒素、或幽门螺旋杆菌(H.pylori)的Cag毒力岛的靶。
iii.结合配偶体
适合根据本文所述的方法使用的结合配偶体是与靶或来自其的产物特异相互作用或特异结合的任何分子。因此，本公开的结合配偶体可以用于检测其所结合的靶。本公开的方法利用两种或更多种结合配偶体(例如，2、3、4、5或更多种结合配偶体)。在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体中的每一种结合由同一分析物生物体提供的靶。
本公开的结合配偶体可以与分析物和非分析物生物体交叉反应。在某些情况下，具有不同交叉反应性的多种结合配偶体可以提供对分析物生物体的改进的检测。例如，检测具有不同交叉反应性的两种或更多种结合配偶体在同一分区中的共定位可以提供该分区中该分析物生物体的明确鉴定。在某些情况下，结合配偶体的交叉反应性与对应靶的交叉反应性有关。例如，结合配偶体对应存在于多种生物体(例如，分析物或非分析物生物体)中的靶。可选地，在某些情况下，结合配偶体的交叉反应性与可能对应靶的交叉反应性无关。例如，结合配偶体可以对应于对于分析物生物体的群、种或株是独特的靶，但是它也可以结合或以其他方式检测非分析物生物体。
在某些实施方案中，在对样本分区之前，样本用两种或更多种结合配偶体孵育。在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体存在于混合物中。包括两种或更多种结合配偶体的混合物可以包括一种或更多种缓冲液(例如，含水缓冲液)和任选地一种或更多种添加剂(例如，阻断剂或生物防腐剂)。
如下所述，在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体中的每一种被设计为特异性结合同一靶，如果存在的话(例如，在同一靶的不同靶位上(例如，位置或序列)。例如，两种或更多种结合配偶体中的每一种可以结合同一rRNA或rDNA的不同区域。在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体被设计为特异性结合不同靶，如果存在的话。例如，一种结合配偶体可以结合到rRNA或rDNA，而另一种结合配偶体可以结合毒力岛。样本在适合使两种或更多种结合配偶体特异结合一种或更多种靶的条件下用所述两种或更多种结合配偶体孵育(例如，在具有两种或更多种结合配偶体的混合物中)，从而结合所述两种或更多种靶。
在某些实施方案中，2、3、4、5或更多种结合配偶体是相同类型的分子(例如，所有的抗体)。在某些实施方案中，2、2、3，4、5或更多种结合配偶体中的至少两种是相同类型的分子(例如，至少两种是抗体)。在某些实施方案中，2、3、4、5或更多种结合配偶体是不同类型的分子(例如，抗体和核酸)。
在某些实施例中，结合配偶体是肽、多肽或蛋白质。如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地指两个或更多个氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在某些实施方案中，结合配偶体是抗体。如本文所使用的，“抗体”指免疫球蛋白族的多肽，或包括能够非共价、可逆地并以特异性的方式结合相应抗原的免疫球蛋白片段的多肽。术语抗体也包括通过修饰完整抗体所产生的抗体片段或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库(参见，例如McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))鉴定的抗体片段。用于制备抗体的方法是现有技术中已知的；参见，例如Kohler&Milstein Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96页，Alan R.Liss,Inc.1985。在某些实施例中，结合配偶体是非抗体蛋白质支架。如本文所使用的，“非抗体蛋白质支架”是指能够以高特异性结合靶的非免疫原性多肽。在某些实施方案中，蛋白质支架衍生自蛋白质A、脂质运载蛋白、纤粘蛋白结构域、锚蛋白共有重复域或硫氧还蛋白的结构。制备非抗体支架的方法是现有技术中已知的；参见，例如Binz和Pluckthun，Curr Opin Biotechnol16:459-469(2005)；Koide等人，J Mol Biol 415：393-405(2012)；以及Gilbreth和Koide，Curr OpinStruct Biol 22:413-420(2012)。
在某些实施方案中，探针是核酸。在某些实施方案中，结合配偶体是适体。如本文所用的“适体”指对于靶诸如蛋白质或核酸具有特异结合亲和力的DNA或RNA分子。在某些实施方案中，适体基于其以高亲和力特异性结合其他分子的能力、基于和靶分子的非沃森和克里克的相互作用从随机的集中选择(参见，例如Cox和Ellington，Bioorg.Med.Chem.9：2525-2531(2001)；Lee等人，Nuc.Acids Res,32：D95-D100(2004))。例如，适体可以使用称为指数富集配体的系统演化(SELEX)的选择方法来选择。参见，例如，Gold等人的US5270163。可以选择结合例如核酸、蛋白质、小的有机化合物、维生素或无机化合物的适体。
在某些实施方案中，结合配偶体是一种核酸引物或一组核酸引物。例如，结合配偶体是被设计为杂交到靶分子和引发扩增反应的核酸引物。在某些情况下，引物是PCR引物或用于本领域中已知的其他核酸扩增技术的引物，包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、超分支(HRCA)和嗜热性解旋酶依赖的DNA扩增(tHDA)。
本公开的结合配偶体包括群特异性结合配偶体。群特异性结合配偶体包括结合靶分子的多个组的结合配偶体。例如，群特异性结合配偶体可以结合一组靶分子的保守区域。在其他情况下，群特异性结合配偶体是结合与一群分析物生物体相关的靶并因此检测该靶的结合配偶体或结合配偶体的组。群特异性结合配偶体可以检测与不止一种分析物生物体或一种分析物生物体以及非分析物生物整体相关的靶。
例如，群特异性结合配偶体可以检测一个属或其他分类(例如种、纲、目、门、界)的生物体。在某些实施方案中，群特异性结合配偶体可以检测特定分类学类别的病毒(例如，RNA病毒、DNA病毒、腺病毒科、小病毒科、呼肠病毒科、黄病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科等)。另选地，群特异性靶结合配偶体检测包含未由特定分类单元或分类单元的群界定的靶的生物体。例如，群特异性结合配偶体可以检测共享特定毒力岛的生物体或共享任何保守的靶(例如，任何保守核酸、蛋白质、碳水化合物等)的生物体。
群特异性结合配偶体还可以检测多种细胞类型，诸如癌细胞、免疫细胞、T细胞或特定组织或器官的细胞。在某些情况下，群特异性结合配偶体可以检测特定类型的癌细胞(例如，淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肝癌)。
在某些实施方案中，群特异性结合配偶体表现出对分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些群特异性结合配偶体可以检测与分析物生物体炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的多个株相关的靶，而且还可以检测与非分析物生物体苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的多个株相关的靶。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种群特异性结合配偶体可以提供改进的对分析物生物体的特定株、种或其他群的鉴定。在某些情况下，群特异性结合配偶体表现出交叉反应性，因为它们检测分析物和非分析物生物体中存在的靶。在其他情况下，群特异性结合配偶体表现出交叉反应性，因为它们检测独特的靶，而且也结合或检测非分析物生物体。又在其他情况下，群特异性结合配偶体可以表现出两种类型的交叉反应性。
本公开的结合配偶体也包括种特异性结合配偶体。种特异性结合配偶体是检测数量更为有限的靶的群特异性结合配偶体。例如，某些种特异性结合配偶体可以检测与分析物生物体有关的特定种或亚种相关的靶。例如，本发明的某些菌种特异性结合配偶体可以用于检测炭疽杆菌的菌株的靶，但是无法检测对应于一般的杆菌的靶。
在某些实施方案中，种特异性结合配偶体表现出对分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些种特异性结合配偶体可以检测与分析物生物体炭疽杆菌的多个株相关的靶，而且还可以检测与非分析物生物体苏云金杆菌的多个株相关的靶。可选择地或除此以外，表现出交叉反应性的某些菌种特异性结合配偶体可以检测对分析物物种特有的靶，而且也检测非分析物物种的靶。相似地，表现出交叉反应性的某些种特异性结合配偶体检测不是分析物物种特有的靶。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种菌种特异性结合配偶体，或各自表现出不同的交叉反应性的群和种特异性结合配偶体可以提供改进的对分析物生物体的特定株、种或其他群的鉴定。
结合配偶体也可以包括株特异性结合配偶体。株特异性结合配偶体是检测特定靶或与特定分析物生物体相关的特定靶的结合配偶体。某些株特异性结合配偶体可以检测与分析物生物体的特定株相关的靶。例如，本发明的某些株特异性结合配偶体检测炭疽杆菌的特异株的靶，但是无法检测存在于普遍的炭疽杆菌的菌株中的靶。
在某些实施方案中，株特异性结合配偶体表现出对分析物和非分析物生物体的交叉反应性。仅以举例的方式，表现出交叉反应性的某些株特异性结合配偶体可以检测与分析物生物体炭疽杆菌的特定株相关的靶，而且还可以检测与非分析物生物体的一种或更多种菌株相关的靶。在某些情况下，各自表现出不同的交叉反应性的多种株特异性结合配偶体或各自表现出不同的交叉反应性的群、种或株特异性结合配偶体的组合可以提供改进的对分析物生物体的特定株、种或其他群的鉴定。
在某些情况下，株特异性结合配偶体表现出交叉反应性，因为它们检测分析物和非分析物生物体中存在的靶。在其他情况下，株特异性结合配偶体表现出交叉反应性，因为它们检测独特的靶，而且也结合或检测非分析物生物体。又在其他情况下，株特异性结合配偶体可能表现出两种类型的交叉反应性。
株特异性结合配偶体包括检测具有病原性或恶性病变相关的特定靶的结合配偶体。例如，株特异性结合配偶体包括检测与甲氧西林抗性相关的靶的结合配偶体。又例如，株特异性结合配偶体包括检测与毒力岛诸如溶血素、细胞毒性坏死因子、肾盂肾炎特异蛋白质、与病原性相关的菌毛蛋白序列、鼠疫耶尔森氏杆菌强毒力岛、鼠疫耶尔森氏杆菌pPCP1和pMT1、沙门氏菌SP1和SP2、马红球菌的毒性质粒、金黄色葡萄球菌毒力岛的SaPI家族、中毒性休克综合征毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肉毒梭状芽孢杆菌的神经毒素、绿脓杆菌的细胞毒素、幽门螺旋杆菌的Cag毒力岛相关的靶的结合配偶体。
iv.检测标记
本文所述的结合配偶体可以通过检测连接和/或包括在结合配偶体中的标记来检测。标记可以直接与结合配偶体连接(例如，通过共价键)或者连接可以是间接的(例如，使用螯合剂或连接头分子)。术语“标记”和“可检测的标记”在本文同义使用。在某些实施方案中，每种结合配偶体标记(例如，连接到第一结合配偶体的第一标记，连接到第二结合配偶体的第二标记等)生成可检测的信号并且这些信号(例如，由第一标记生成的第一信号，由第二标记生成的第二信号等)是可区分的。在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体的标记包括相同类型的物质(例如，是第一荧光剂的第一标记，和是第二荧光剂的第二标记)。在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体的标记(例如，第一标记，第二标记等)组合以产生可检测的信号，该可检测的信号在一种或更多种标记不存在时无法生成。
检测标记的示例包括但不限于，生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如，寡核苷酸)标记、化学反应性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点(quantum dot)、聚合物点(polymer dot)、质量标记(mass label)及其组合。在某些实施方案中，标记可以包括光学物质，诸如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。很多种物质(例如，染料、结合配偶体或指示剂)是本领域中已知的并且可用于本公开。(参见，例如Invitrogen，The Handbook—A Guideto Fluorescent Probes and Labeling Technologies，第十版(2005))。荧光剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白质及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于，花菁、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩噁嗪、苯基氧杂蒽、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如，FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸、二吡咯嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、罗丹明(例如，TAMRA、TMR和罗丹红)、吖啶、蒽醌、chalcogenopyrylium类似物、二氢卟吩、酞菁、次甲基染料(methine dye)、indolenium染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂薁(azaazulenes)、三苯甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚碳菁、苯并吲哚碳菁、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物及其类似物。在某些实施方案中，荧光剂是AlexaFluor染料。在某些实施方案中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记试剂包括例如Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,OR)和Pierce Biotechnology(Rockford，IL)公司商购获得的那些染料和试剂。在某些实施方案中，光学物质是嵌入染料。在某些实施方案中，用于检测靶分子的2、3、4、5或更多种结合配偶体各自标记有光学物质诸如荧光剂(例如，用第一荧光标记标记的第一结合配偶体，用第二荧光标记标记的第二结合配偶体等)，并且标记有光学物质的每种结合配偶体通过检测由所述光学物质生成的信号(例如，由荧光标记生成的荧光信号)来检测。在某些实施方案中，用于检测靶分子的所有结合配偶体标记有光学物质，并且每种标记有光学物质的结合配偶体通过检测由所述光学物质生成的信号来检测。
在某些实施方案中，所述标记是放射性同位素。放射性同位素包括发出γ射线、正电子、β和α粒子以及X-射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在某些实施方案中，用于检测靶的2、3、4、5或更多种结合配偶体各自标记有放射性同位素(例如，标记有第一放射性同位素的第一结合配偶体，标记有第二放射性同位素的第二结合配偶体等)，并且标记有放射性同位素的每种结合配偶体通过检测由该放射性同位素生成的放射性来检测。例如，一个结合配偶体可以用γ发射器来标记，且一个结合配偶体可以用β发射器来标记。可选择地，结合配偶体可以用在不同能量下发射相同粒子(例如，α、β或γ)的放射性核素来标记，其中，不同能量是可区分的。在某些实施方案中，用于检测靶的所有结合配偶体用放射性同位素来标记，并且每种标记的结合配偶体通过检测由该放射性同位素所生成的放射性来检测。
在某些实施方案中，标记是酶，并且结合配偶体通过检测所述酶生成的产物来检测。合适酶的示例包括但不限于尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解荧光素二醋酸酯的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可以使用显色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在过氧化氢存在下产生可在450nm处检测到的可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可以使用显色底物p-磷酸对硝基苯酯，其产生可在405nm处检测到的可溶产物。β半乳糖苷酶检测系统可以使用显色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，其产生可在410nm处检测到的可溶产物。尿素酶检测系统可以使用底物诸如尿素-溴甲酚红紫(Sigma Immunochemicals；St.Louis,MO)。在某些实施方案中，用于检测2、3、4、5或更多种靶的2、3、4、5或更多种结合配偶体各自用酶标记(例如，用第一酶标记的第一结合配偶体，用第二酶标记的第二结合配偶体等)，并且用酶标记的每种结合配偶体通过检测由所述酶生成的产物来检测。在某些实施方案中，用于检测靶分子的所有结合配偶体用酶来标记，并且每种酶标记的结合配偶体通过检测由所述酶所生成的产物来检测。
在某些实施方案中，标记是亲和力标记。合适的亲和力标记的示例包括但不限于，生物素、肽标签(例如，FLAG-标签、HA-标签、His-标签、Myc-标签、S-标签、SBP-标签、Strep-标签)和蛋白质标签(例如，GST-标签、MBP-标签、GFP-标签)。
在某些实施方案中，标记是核酸标记。合适标记的示例包括但不限于寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(例如，mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂合体。在某些实施方案中，核酸标记的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
在某些实施方案中，标记是核酸条形码。如本文所使用的，“条形码”是独特地定义结合配偶体分子或结合了结合配偶体的靶的短核苷酸序列(例如，长度是至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。例如，包含两种或更多种靶序列的分区中的一种或更多种靶可以使用在每个分区中包含不同条形码序列的引物来扩增，从而将独特的条形码并入到每个分区的被扩增的靶中。可选地，在包含至少两种靶的分区中的一种或更多种靶可以使用在每个分区中包含不同条形码序列的引物逆转录，从而将独特的条形码序列并入每个分区中的被逆转录的靶中。随后可将分区组合，并且被任选扩增，而不丢失对包含两种或更多种靶的分区的跟踪。因此，包含每个条形码的靶的存在或不存在可以被计数(例如，通过测序)，而无需保持物理分区。
条形码序列的长度确定可以区分多少不同的样本。例如，4核苷酸条形码可以区分44个或256个或更少的样本，6核苷酸条形码可以区分4096个不同的样本或更少的样本，且8核苷酸条形码可将65,536个不同的样本或更少的样本编索引。另外，通过用于第一和第二链的合成的条形码化的引物或通过连接，条形码可以附接至双链核酸的两个链。在两个链上使用两个不同的条形码增加可区分的独立事件的数量。
可选地，相同的条形码可以附接至第一和第二链。例如，通过将同一条形码并入每个分区中用于第一和第二链合成的引物中，使用同一条形码可在两条链上产生相同的条形码。双重条形码化可以提供对随后的检测错误诸如使下游测定混淆的测序或扩增错误的检查，并允许在不损害定量的情况下检测任一链或两条链。条形码技术的使用在本领域中是众所周知的，参见，例如Katsuyuki Shiroguchi等人，Digital RNA sequencing minimizessequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes,PNAS(2012)；and Smith,AM等人，Highly-multiplexed barcodesequencing:an efficient method for parallel analysis of pooled samples,Nucleic Acids Research Can 11,(2010)的示例。
在某些实施方案中，标记是“点击(click)”化学结构部分。点击化学使用简单、稳健的反应，诸如铜催化的叠氮化物和炔烃形成分子内键合的环加成作用。对于点击化学的概述，请参见Kolb等人，Agnew Chem40:2004-2021(2001)。在某些实施方案中，点击化学部分(例如，叠氮化物或炔烃部分)可以使用另一可检测的标记(例如，荧光标记的、生物素化的或放射标记的炔烃或叠氮化物部分)来检测。
用于将可检测的标记附接到结合配偶体的技术是众所周知的。例如，对常用的蛋白质标记技术的概述可见于Biochemical Techniques:Theory and Practice,JohnF.Robyt和Bernard J.White,Waveland Press,Inc.(1987).其他标记技术被概述于例如，R.Haugland,Excited States of Biopolymers,Steiner ed.,Plenum Press(1983)；Fluorogenic Probe Design and Synthesis:A Technical Guide,PE AppliedBiosystems(1996)；和G.T.Herman,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)。
在某些实施方案中，两种或更多种结合配偶体的标记(例如，第一标记，第二标记等)组合以产生在一种或更多种标记不存在时不生成的可检测的信号。例如，在某些实施方案中，所述标记中的每一种是酶，且酶的活性组合以生成表示标记的存在的可检测的信号(且因此，指示特异结合靶的每种结合配偶体)。组合以生成可检测的信号的酶的示例包括偶联测定(coupled assay)，诸如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的偶联测定；以及对于偶联至葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶的NAD(P)H的化学发光测定，或碱性磷酸酶测定。例如参见Maeda等人，J Biolumin Chemilumin 1989，4:140-148。
C.用于检测生物粒子的方法
在某些实施方案中，本公开的方法包括：提供包含至少两种细胞或病毒粒或从其制备的核酸的样本；将所述样本划分为一组分区；和检测至少两种靶在每个分区内的存在或不存在，从而鉴定单个分区中的细胞或病毒粒。
在某些实施方案中，至少两种靶在分区中的存在或不存在鉴定该分区中的分析物细胞或病毒粒。在某些情况下，靶在分区中的存在或不存在鉴定分析物细胞或病毒粒子不存在于该分区中。例如，分区可以被鉴定为不包含甲氧西林抗性葡萄球菌属的生物体，或不包含肠出血性细菌。本文提供的方法在下文被进一步阐述。
i.提供样本
在某些实施方案中，本发明提供了用于提供样本的方法。如上所述，样本基本上可以从任何生物来源或环境来源获得。样本可以包含待鉴定的分析物细胞或病毒粒，或被怀疑包含待鉴定的分析物细胞或病毒粒。提供样本包括获得样本和制备用于本文提供的方法的样本。例如，样本可以被纯化、分级分离或富集。在某些实施方案中，样本可以被离心以清除碎屑或去除可溶性物质。在某些实施方案中，样本可以被过滤。例如，包含细胞和病毒粒的样本可以被过滤以去除细胞，且可以从该样本检测病毒粒子。
ii.分区
样本可以被划分为多个分区。分区可以包括多种类型的分区中的任一个，所述多种类型的分区包括固态分区(例如，孔或管)和流体分区(例如，油相内的含水液滴)。在某些实施方案中，分区是液滴。在某些实施方案中，分区是微通道。用于对样本分区的方法和组合物在例如已公布的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US2011/0092376中被描述，上述每个专利申请的全部内容通过引用并入本文。
在某些情况下，样本被分区且检测试剂(例如，结合配偶体)被掺入被分区的样本中。在其他情况下，样本与检测试剂(例如，结合配偶体)接触并且随后对样本分区。在某些实施方案中，在分区之前，试剂诸如结合配偶体、引物、缓冲液、酶、底物、核苷酸、盐等被混合在一起，然后对样本分区。在某些情况下，在将试剂混合在一起不久之后，随即的样本分区，以便基本上所有或大多数的反应(例如，逆转录、DNA扩增、DNA裂解等)在分区之后发生。在其他情况下，试剂在反应缓慢进行或丝毫不进行的温度下被混合，随后对样本分区，并将反应温度调节以允许反应进行。例如，试剂可在冰上、小于5℃下或在0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、20℃-25℃、25℃-30℃或30℃-35℃或更高的温度下被组合。一般来讲，本领域的技术人员将知道如何选择一种或更多种反应被抑制的温度。在某些情况下，温度和时间的组合被用于避免分区之前的实质性反应。
另外，试剂和样本可以使用一种或更多种热启动酶诸如热启动逆转录酶或热启动DNA聚合酶来混合。因此，样本可以和一种或更多种缓冲液、盐、核苷酸、结合配偶体、标记、酶等混合并随后被分区。随后，通过热启动酶催化的反应可以通过加热所述分区的混合物来启动以激活一种或更多种热启动酶。
另外，样本和试剂(例如，缓冲液、盐、核苷酸、结合配偶体、标记、酶等中的一种或更多种)可被混合在一起，而没有引发期望的反应的一种或更多种试剂(例如，逆转录或DNA扩增)。随后可将混合物划分为一组第一分区的混合物，然后可以通过将该组第一分区的混合物与提供必需试剂的一组第二分区的混合物混合来提供一种或更多种必需的试剂。可选地，必需试剂可被添加至第一分区的混合物，而不形成第二分区的混合物。例如，必需试剂可以扩散到该组第一分区的混合物，油包水液滴中。又例如，缺少的试剂可以被引导到包含该组第一分区混合物的一组微通道中。
在某些实施方案中，样本被划分为多个液滴。在某些实施方案中，液滴包含乳液组合物，即，不可混溶的流体的混合物(例如，水和油)。在某些实施方案中，液滴是被不可混溶的载体(例如，油)环绕的含水液滴。在某些实施方案中，液滴是被不可混溶的载体(例如，含水溶液)环绕的油滴。在某些实施方案中，本文所述的液滴是相对稳定的并且在两个或更多液滴之间具有最小限度的汇合。在某些实施方案中，从一个样本产生的液滴的小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴汇合。乳液还可以具有有限的絮凝，分散相以薄片的形式从悬浮液中出现的过程。
在某些实施方案中，液滴通过使油相穿过包括待检测靶的含水样本形成。在某些实施方案中，包括待检测靶的含水样本还包括缓冲的溶液和用于检测靶的两种或更多种结合配偶体。
油相可以包括氟化基础油，其可以另外通过与氟化表面活性剂诸如全氟化聚醚组合被稳定。在某些实施方案中，所述基础油包括HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70中的一种或更多种，或另一种常见的氟化油。在某些实施方案中，油相包括阴离子含氟表面活性剂。在某些实施方案中，阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在某些实施方案中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在某些实施方案中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。Krytox-FSH的吗啉代衍生物可以以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)的浓度存在。在某些实施方案中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在某些实施方案中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。
在某些实施方案中，油相还包括用于调节油性质诸如蒸汽压、粘度或表面张力的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在某些实施方案中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇被添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在某些实施方案中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇被添加至约0.18％(w/w)的浓度。
在某些实施方案中，乳液被配制为产生高度分散的液滴，该液滴具有液体样界面膜，所述可以液体样界面膜可通过加热具有固体样界面膜的微胶囊来转化；此类微胶囊可表现为能够在孵育期间保持其内容物的生物反应器。微胶囊形式的转化可以在加热时发生。例如，此类转化可以在大于约40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或95℃的温度下发生。在加热过程期间，流体或矿物油覆盖层可用于阻止蒸发。在加热前，多余的连续油相可被去除或可不被去除。微胶囊可以在宽泛的热处理和机械处理范围内耐受聚结和/或絮凝。
在转化后，微胶囊可在约-70℃、-20℃、0℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度下储存。在某些实施方案中，这些胶囊可用于分区混合物的储存或运输。例如，样本可以在一个位置收集，被划分为包含酶、缓冲液和/或引物的液滴，任选地，可以执行一个或更多个逆转录反应，然后可对分区加热以执行微胶囊化，且微胶囊可以被储存或运输以供进一步分析。
微胶囊分区可以包含一种或更多种结合配偶体(例如，如本文所述的标记的结合配偶体)并且可以耐受聚结，尤其是在高温时。因此，胶囊可以以非常高的密度(例如，每单位体积的分区数)孵育。在某些实施方案中，每毫升可以孵育大于100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个分区。在某些实施方案中，样本-结合配偶体孵育可以在单个孔例如微量滴定板的孔中发生，而不在分区之间相互混合。微胶囊还可以包含孵育所需的其他组分。
在某些实施方案中，样本被划分为至少500个分区、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。
在某些实施方案中，样本被划分为足够数量的分区，使得至少大多数分区具有不超过5-10个分析物生物体(例如，不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个分析物生物体)。在某些实施方案中，样本被划分为足够数量的分区，使得至少大多数分区具有不超过5-10个分析物和/或非分析物生物体(例如，不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个分析物和/或非分析物生物体)。在某些实施方案中，大多数分区具有不超过5-10个(例如，不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)至少两种待检测的靶。在某些实施方案中，平均不超过5-10个(例如，不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的至少两种靶存在于每个分区中。在某些实施方案中，平均约0.5、1、2、3、4或5个靶存在于每个分区中。在某些实施方案中，平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个靶存在于每个分区中。在某些实施方案中，平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个结合配偶体存在于每个分区中。
在某些实施方案中，所生成的液滴的形状和/或尺寸是基本上均一的。例如，在某些实施方案中，液滴的平均直径是基本上均一的。在某些实施方案中，所生成的液滴具有约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米的平均直径。在某些实施方案中，所生成的液滴具有小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米或小于约25微米的平均直径。在某些实施方案中，所生成的液滴的形状和/或尺寸是不均一的。
在某些实施方案中，所生成的液滴的体积是基本上一致的。例如，液滴体积的标准差可以小于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或小于约10nL。在某些情况下，液滴体积的标准偏差可以小于平均液滴体积的约10-25％。在某些实施方案中，所生成的液滴具有约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL的平均体积。
iii.洗涤
在某些实施方案中，在样本用两种或更多种结合配偶体在适合使所述两种或更多种结合配偶体特异性结合一种或更多种靶的条件下孵育之后，样本被洗涤以去除未特异性结合它们的靶的结合配偶体。在某些实施方案中，样本用第一结合配偶体孵育，然后任选地，在用第二结合配偶体孵育样本之前经受洗涤条件。在某些实施方案中，连续地用结合配偶体孵育样本，然后任选地使样本经受洗涤条件，然后用不同的结合配偶体孵育样本，可以对两种、三种、四种或五种或更多种结合配偶体执行。
适当洗涤条件、洗涤缓冲液等的选择将基于诸如结合配偶体、靶分子等的条件而改变，并且可以由本领域技术人员决定。例如，在其中结合配偶体-靶复合物比单独的结合配偶体密集的某些实施方案中，样本可以通过离心以沉淀结合配偶体-靶分子复合物来洗涤，接下来重悬在缺乏结合配偶体的缓冲液中。又例如，在某些实施方案中，结合配偶体-靶分子复合物可以通过使样本经过密度梯度或其他梯度(例如，通过电荷分离)而与未结合的结合配偶体分离。又例如，在某些实施方案中，结合配偶体-靶分子复合物可通过使样本经过柱(例如，尺寸排阻柱)以将复合物和未结合的结合配偶体分离来洗涤。在必要时，可以重复洗涤过程以额外洗涤。在某些实施方案中，在对样本分区之前洗涤。在某些实施方案中，在对样本分区之后洗涤。在某些实施方案中，在用结合配偶体孵育样本之后和检测结合配偶体之前，不进行中间的洗涤步骤。
在某些实施方案中，在对样本分区之前、期间和/或之后，样本被保持在受控的温度下或温度范围内。在某些实施方案中，在对样本分区之前、期间和/或之后，样本被保持在约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃的温度，例如，被保持在允许放大由一种或更多种标记结合配偶体生成的信号的温度下。在某些情况下，样本温度在分区之前或之后是循环的。在某些情况下，温度循环提供结合配偶体、标记和/或靶的扩增。
iv.检测
结合配偶体或可检测的标记可以使用多种检测器装置中的任一种来检测。示例性检测方法包括放射性检测、光吸收检测(例如，荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性示例，荧光标记可以使用配备有生成可以被荧光团吸收的激发光的模块以及检测由荧光团发出的光的模块的检测器装置来检测。
在某些实施方案中，被分区的样本中的可检测的标记可以批量检测。例如，被分区样本(例如，液滴)可以组合到滴定板的一个或更多个孔中，诸如96-孔或384-孔滴定板，并且可以使用读板机来检测信号(例如，荧光信号)。在某些情况下，在分区组合之后，条形码可以用于保持分区信息。
在某些实施方案中，检测器还包括对分区样本(例如，液滴)的处理能力，各个分区样本进入检测器、经受检测，然后离开检测器。在某些实施方案中，分区样本(例如，液滴)可在分区样本正在流动时被连续检测。在某些实施方案中，分区样本(例如，液滴)陈列在表面上，并且检测器相对于该表面移动，从而检测包含单个分区的每个位置处的信号。检测器的示例在WO 2010/036352中提供，该专利的内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，分区样本中的可检测的标记可以被连续检测而无需使分区样本流动(例如，使用腔室载玻片(chamber slide))。
在获取荧光检测数据之后，通用目的计算机系统(在本文称为“主机”)可以用于存储和处理该数据。可以采用计算机可执行的逻辑学执行诸如减去背景信号、分配靶和/或参考序列以及定量数据的功能。主机可用于显示、存储、检索或计算来自分子特征谱的诊断结果；或、存储、检索或计算表达分析的原始数据；或显示、存储、检索或计算在本公开的方法中有用的任何样本或患者信息。
主机可以配置有许多不同的硬件组件并且可以以许多尺寸和样式(例如，台式PC、膝上型电脑、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)制造。可包括标准的部件诸如显示屏、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。在主机连接到网络时，连接可以经由任何合适的传输介质(例如，有线、光学和/或无线介质)和任何合适的通信协议(例如，TCP/IP)来提供；主机可以包括合适的联网硬件(例如，调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可以用运行多种操作系统，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS中的任一种或任何其他操作系统。
计算机代码可以以能在主机上执行或可被编译成在主机上执行的各种语言包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他脚本或编程语言来编写。代码也可以以低级语言诸如汇编语言或机器语言编写或分发。
主机系统有利地提供用户藉此控制工具的操作的界面。在本文所述的示例中，软件工具作为脚本(例如，使用PERL)实施，软件工具的执行可以由用户从操作系统诸如Linux或UNIX的标准命令行界面启动。本领域技术人员将明了，所述命令可视情况被调整以适应操作系统。在其他实施方案中，可以提供图形用户界面，从而允许用户使用定点装置控制操作。因此，本公开并不限于任何特定的用户界面。
并入本公开的多种特征的脚本或程序可编码在多种用于储存和/或传输的计算机可读介质上。合适介质的示例包括磁盘或磁带、光学存储介质诸如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)、闪速存储器和适于经由符合各种协议，包括互联网的有线、光纤和/或无线网络传输的载波信号。
在某些实施方案中，主机可以包含数据库，诸如计算机可读介质上的数据库。此类数据库可以包含靶或靶所对应的分析物生物体或生物体的群的列表。在某些情况下，计算机可读介质上的数据库包括靶和所述靶对应的分析物生物体或分析物生物体基团的列表。在某些情况下，数据库还可以包含检测数据库的靶的结合配偶体。数据库还可以包含和/或结合配偶体的交叉反应性信息。
在某些实施方案中，一个分区或一组分区可以经历检测步骤以检测至少两种不同靶的存在或不存在。然后，可以使用计算机对至少两种靶的存在或不存在的模式与包括靶和交叉反应性的数据库的计算机可读介质比较。该比较可以提供对该分区中存在或不存在分析物生物体或群的鉴定。D.对生物粒子的类型的示例性测定
该部分描述用于鉴定、区分和/或定量不同类型的生物粒子的示例性多重数字测定；参见图14-18。
图14示出了例示包含样本的流体或整体相250以及所形成的具有包含样本的流体的部分的分区252的示意图，254处所示。分区可以是例如布置在连续相258中的包括油的液滴256以形成乳液259。
流体250可以包括一种或更多种类型的生物粒子(例如，不同类型的细胞)，诸如A、B和C型(分别是260、262和264)。图14中仅示出每种粒子类型的一个拷贝，但是每种类型的任何合适的拷贝数可以存在于包含样本的流体中，诸如大于2、5、10、100、1000个拷贝等。而且，每种粒子类型的拷贝数可以是不同的。如此处所示，形成分区时，每种类型的生物粒子可以是基本上完整的，诸如，每种类型的大多数拷贝是完整的(即，未裂解/闭合的)，或如下文进一步描述的，在分区形成之前，每种类型可以被打开以释放粒子的内容物。
A、B和C型中的每一种可以包含两种或更多种靶266和268(此处，也分别标为靶1和靶2)的不同组或亚组。例如此处，每个A型的粒子包含仅靶1的至少一个拷贝，每个B型的粒子包含仅靶2的至少一个拷贝，而每个C型的粒子包含靶1和2中的每一种的至少一个拷贝。所述靶可以是由每个粒子内的DNA或RNA提供的核酸序列。C型粒子中的靶1和2彼此关联，因为两种靶的拷贝包含在相同的各个C型粒子中。靶1和2可以彼此共价连接和/或通过每个C型粒子内碱基配对连接，或可以以单独的核酸存在于每个粒子内(例如，分散的染色体或RNA)。
流体250还可以包括用于检测每种靶在分区252中的存在或不存在的检测试剂270。试剂270可以包括用于扩增每种靶的一种或更多种引物272(诸如用于靶1的F1和R1和用于靶2的F2和R2)。试剂还可以包括对于每种靶的特异性报告物274a或274b，诸如分别用于靶1和2的探针P1和P2。每种报告物可以是光致发光的。此处，每种特异性报告物包括特异性结合对应靶(和/或通过扩增靶所产生的扩增子)的核酸276、光致发光团278a或278b以及针对该光致发光团的猝灭剂280。在其他实施方案中，报告物可以是非特异性报告物，诸如结合每种靶(和/或通过扩增靶产生的扩增子)的嵌入染料。检测试剂还可以包括扩增酶(例如，热稳定聚合酶或连接酶)、dNTP(或NTP)等等。
示意性地例示了乳液259。乳液可以包含任何合适数量的液滴，诸如尤其是大于100或1000个液滴。乳液259的每个液滴256可以包含完整的一组检测试剂270。不过，液滴256可包含局部占有的生物粒子A到C型中的每一种。换句话讲，每种类型的生物粒子可能以只存在于液滴的亚组中。在所示乳液中，仅液滴282和284包含A型粒子，仅液滴284和286包含类型B粒子，且仅液滴288包含C型粒子。液滴290和292不包含所述类型粒子中的任一种的拷贝。液滴284表现出两种不同粒子类型即A和B型的随机共定位。
可处理乳液259的液滴以便检测靶1和2。例如，可加热液滴以打开生物粒子，使检测试剂270与靶组合。可将液滴加热到任何合适的温度诸如至少约60、70、80或90摄氏度以打开粒子。在某些实施方案中，可将液滴加热到90摄氏度以上的变性温度。液滴还可被热循环，以激发靶的扩增。可检测来自液滴的光(以及特别地，来自其的报告物)以收集扩增数据。对于每个液滴被检测的靶内容物294呈现在每个液滴的底部附近，第一靶的存在/不存在给出在斜线前，而第二靶的存在/不存在给出在斜线后(“+”意指阳性/存在，而“–”意指阴性/不存在)。
图15示出了可以从较大的一组液滴收集的荧光强度信号(FL INT)的图形，所述液滴按照上面对于图14所描述的形成和处理。可收集打开液滴中的粒子并扩增由所述粒子提供的核酸的靶之后的来自如图14中形成的一组分区的两个光通道(CH1和CH2)中的数据。每个光通道可选择性地检测来自液滴中的仅一种报告物/发光团的光。此处，通道1检测靶1的报告物且通道2检测靶2的报告物(例如，主要检测从降解形式的每个报告物发出的光)。可对数据做图，每个液滴在图中产生一个数据点。根据靶含量，数据点可如所示地簇集。每种类型的生物粒子的水平可由各个簇中的液滴的数量(液滴计数)确定(例如，参见以上第III部分)。更具体地，A型粒子的水平可由簇300和302的液滴计数确定。B型粒子的水平可由簇300和304的液滴计数确定。C型粒子的水平可以从所有四个簇(300、302、304和306)的液滴计数来确定，校正了相同液滴中A和B型粒子的靶1和靶2的偶然共定位(参见，例如第III部分中的方程式8)。
图16示出了一组分区的单个光通道中的可收集的荧光强度信号(FL INT)作为时间或分区的规则(“事件数”)的函数的图形。分区可以是如图14中形成的液滴，但是一对序列特异性报告物274a和274b被单非特异性报告物诸如嵌入染料代替。四个簇或条带可以彼此分辨，每个簇或带的靶含量如图15所指示。因此，从图16的图形获得的分区计数可以以与图15相同的方式处理。
图17示出了例示包含样本的流体或整体相320以及分区322的示意图，部分具有包含样本的流体，324处所示。分区可以例如是液滴326。除了包含样本的流体包含从A、B和C型粒子制备的核酸，而不是从完整粒子，图17的示意图与图14类似。靶1和2可以在粒子中彼此连接，并且足够接近使得当从所述粒子制备核酸时，靶保持基本上彼此连接。可如上文对于图14和15所描述的处理液滴并且收集和分析数据。
图18示出了可以存在于按照本文描述地被测定的样本中的不同类型的生物粒子的示意图。每种类型仅示出一个拷贝以简化展示。这些类型按分类学群(分类单元)(第I、II、III、…N群)排列，其每一群可以包括至少一种或两种或更多种类型。这些群可以是相同等级的两个或更多个群，诸如两个或更多个纲、目、科、属、种等。样本中的大多数类型的粒子对于待测定的至少一对靶中的每种可能是阴性的(此处为，靶1和2)。靶1可以是第I群的标志物，第I群包含感兴趣的类型340和不感兴趣的其他类型342。靶2可以是对第I群中的类型340特异的标志物，但是也存在于第I群之外的一种或更多种其他类型344中。(类型340和344各自属于比第I-N群的分类学等级高的分类单元，而且也属于靶2阳性类型的组。)可鉴定和定量来自对于两个靶为阳性的分区的类型340，具有对来自相同分区中的不同粒子类型的靶1和2的偶然共定位的校正。
E.进一步的方面
使用核酸靶的细菌和其他生物体的分子检测往往受测定的特异性限制。成功区分已知物种的测定往往可能与其他未知物种交叉反应，无论那些菌种是否密切相关。针对病原体检测，可能存在交叉反应，不管另一物种是否是致病性的。一种引物/探针往往不足以实现期望的特异性。数字PCR通过同时使用2种或更多种靶提供了极大地改善了检测的提高。在qPCR中，靶向相同生物体的两种测定或两种探针提出了理解上的挑战。所述靶可能处于不同的丰度，即使生物体不是(尤其是对于RNA靶)，且效率的差异意味着定量的数目不可能准确匹配。因此，难以从两种不同交叉反应性靶的混合物中辨别预期的靶。一般来讲，液滴数字pcr和数字PCR可以通过测量多个测定的共定位的能力对此改进，并且如同其他共定位方法一样，观察的双阳性的频率可以与预期的双阳性数比较以确定由于非随机原因引起的共定位频率。在这种情况下，因为两种靶是物理连接的并且共同出现是由于它们在分区时彼此接近造成的。这将产生更好的鉴定和特异性检测特定靶的能力。
分类学(物种鉴定)鉴定本身往往不足以鉴定病原体或其他功能性群体，因为相关的功能性基因可能在毒力岛上。同样地，这些相同基因的存在可能不会在不同物种中产生病原性。通常正是多种因素的组合的相交导致了致病性或感兴趣的表型。
其中这是特别有用的一个示例是MRSA检测。MRSA检测常常通过一对PCR测定进行。靶向金黄色葡萄球菌，但检测MRSA和对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌两者的一种测定与检测负责甲氧西林抗性(其为若干非病原性细菌所携带)的基因的测定搭配。因此，该检测需要两个测定对样本均为阳性的，但这可以通过存在期望的分析物生物体或存在其与非分析物生物体的组合发生。这种测定方法可以通过先将细菌划分为液滴或其他分区并接着测定两种靶得而大大加强。由于两种靶存在于一个孔中，MRSA细菌将导致两种靶在同一分区中。假阳性将得以降低，除非产生假阳性的两种不同细菌是物理结合的，导致非随机共定位。
另一用途和示例将是使用针对相同核酸分子的两种探针或测定来鉴定物种，例如，对相同基因的两个测定，对rRNA的两个测定，或对位于相同核酸分子(可以是基因组DNA、染色体外元件、质粒、mRNA链)上的不同靶的两个测定。例如，技术人员可以对16S rDNA的一个区域使用群特异性测定，而对不同的区域使用种特异性测定并寻找共定位。即使种特异性测定示出对不相关的细菌的交叉反应性，两者的共定位将指示分析物生物体。用于改进的鉴定的这类共定位的进一步应用是，降低鉴定所需的测定的多重性，并提高定量混合的聚集物的水平。再次使用群特异性和种特异性测定作为示例，对感兴趣的群特异但无法区分该群的三个成员的群特异性测定可以与依次地区分A成员和其他成员或区分B成员和其他成员的测定配对。由于c成员可从单阳性鉴定，对其进行测定将是不必要的。另外，这种测定组合将允许同时定量难以在qPCR或其他方法中区分的所有三种靶，尤其是如果所述成员中的一个(例如，A)以相对于其他成员低的丰度存在的话。
这也将体现当存在对感兴趣的特定分析物生物体的两个或更多个测定，但是无一本身是特异性的，但是交叉反应性是不同的时候的益处。对于两个测定为阳性的共定位可以用于确定对两种测定反应的生物体的丰度。
该方法可以应用于非微生物细胞，例如哺乳动物细胞。通常，正是特定亚群的细胞是感兴趣的，所述亚群不能通过一个测定被特异性地鉴定，而是可通过多个测定的同时共定位来鉴定。示出细胞之间或可能的转录产物之间的交叉反应性的测定可相似地通过其共定位来区分。即使测定本身不是特异性的，但是如果它们的交叉反应性是不同的，那么在组合时可能是特异性的。
V.实施例
本部分展示本公开涉及对关联靶的数字测定的选定的方面和实施方案。这些实施例仅用于例示的目的，并且不应限制或定义本公开的整体范围。
实施例1.选择的实施方案I
本部分展示了作为一系列编索引的段落的本公开的另外选择的实施方案，涉及对关联靶的数字测定。
1.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成以局部占有包含模板的分区，每个分区被设置为扩增来自所述分区中的模板的单个拷贝(如果存在的话)的第一靶和第二靶；(B)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(C)收集扩增所述靶的数据；和(D)基于所述数据和期望的或假设的靶彼此的连接度确定所述靶中的至少一种靶(和/或模板)的水平。
2.根据段落1所述的方法，其中，所述连接度表示分区形成时所述靶彼此的连接度。
3.根据段落1或2所述的方法，其中，确定至少一种靶的水平的步骤基于每个只对所述靶中的一个靶检验为阳性的分区是假阳性的假设。
4.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述连接度是至少80％。
5.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述连接度是至少90％。
6.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述连接被假设为100％。
7.根据前述任一段落所述的方法，其中，形成分区的步骤包括提供包含所述模板的整体相的步骤和将所述整体相划分为以局部占有包含模板的流体体积的步骤。
8.根据段落7所述的方法，其中，所述流体体积是液滴。
9.根据段落7或8所述的方法，其中，所述流体体积是所述分区。
10.根据段落7所述的方法，其中，所述流体体积是第一组流体体积，并且其中，形成分区的步骤包括将第一组的各个单独流体体积和第二组的各个流体体积混合的步骤。
11.根据段落10所述的方法，其中，第二组的流体体积包括用于扩增所述靶中的至少一种靶的至少一种引物。
12.根据段落10或11所述的方法，其中，所述第一组和第二组的流体体积是液滴。
13.根据段落1所述的方法，其中，所述模板由样本提供，所述方法还包括在形成分区的步骤之前降低所述样本中的核酸的平均尺寸的步骤。
14.根据段落13所述的方法，其中，降低平均尺寸的步骤包括用至少一种限制性酶消化所述样本中的核酸的步骤。
15.根据段落14所述的方法，其中，消化的步骤产生模板的具有均一长度的拷贝。
16.根据前述任一段落所述的方法，其中，只对所述靶中的一种靶检验为阳性的分区比对所述两个靶为阳性的分区多。
17.根据前述任一段落所述的方法，其中，收集数据的步骤包括生成对于每个分区的一个或更多个信号值的步骤，还包括通过比较对于每个分区的一个或更多个信号值与一个或更多个阈值或范围值以确定所述分区对每种靶检验为阳性还是阴性的处理数据的步骤，并且其中，任选地，对所述靶中的一种靶检验为阳性的分区多于对所述两种靶为阳性的分区。
18.根据前述任一段落所述的方法，还包括步骤：处理所述数据以致于如果所述数据指示给定分区包含两种靶，则所述给定分区被算作对两种靶为阳性，且如果所述数据指示给定分区仅包含所述靶中的一种或不包含任一种靶，则所述给定分区被算作对两种靶为阴性，其中，确定水平的步骤基于所处理的数据。
19.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述水平是至少一种靶的浓度。
20.根据段落1-18中的任一项所述的方法，其中，所述水平是指示所述至少一种靶是否高于背景存在的定量性水平。
21.根据前述任一段落所述的方法，其中，确定水平的步骤包括(a)基于分区对单独的每种靶为阳性的相应计数计算对所述两种靶检验为阳性的假双阳性的预期数量的步骤，以及(b)比较假双阳性的预期数量和观察到的双阳性的计数以确定观察到的双阳性的计数是否明显大于假双阳性的预期数量的步骤。
22.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述水平是对于第一靶的并且包括第一靶连接到第二靶的连接的形式和第一靶未连接到第二靶的未连接的形式。
23.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述水平部分基于预期为只对所述靶中的一种靶检验为阳性的真阳性的分区的数量。
24.根据段落23所述的方法，其中，所述分区的数量基于对所述两种靶为阳性的分区计数和所述靶的假设或预期的连接来确定。
25.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述水平表示考虑所述第一和第二靶的未连接的形式的对所述模板计算的水平的调节。
26.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述连接至少部分地通过一个或更多个共价键形成。
27.根据前述任一段落所述的方法，其中，每种靶通过所述模板的不同链选择性提供，并且其中，所述连接至少部分地通过不同链彼此碱基配对来形成。
28.根据前述任一段落所述的方法，其中，每种靶对相同等位基因是特异性的。
29.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成以局部占有包含模板的分区，每个分区被设置为扩增来自所述分区中的模板的单个拷贝(如果存在的话)的第一靶和第二靶；(B)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(C)收集扩增所述靶的数据；和(D)基于所述数据确定所述靶中的至少一种靶的水平，并且至少大多数仅对所述靶中的一种靶检验为阳性的分区被视为假阳性。
30.根据段落29所述的方法，其中，对于确定所述靶中的至少一种靶的水平的步骤，仅对所述靶中的一种靶检验为阳性的每个分区被视为假阳性。
31.根据段落29或30所述的方法，其中，所述水平是指示至少一种靶是否高于背景存在的定量性水平。
32.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)提供以局部占有包含模板的分区，每个分区被设置扩增来自所述分区中的模板的单个拷贝(如果存在的话)的第一靶和第二靶；(B)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(C)收集所述分区中扩增第一靶和第二靶的数据；(D)处理所述数据以致于如果所述分区对所述两种靶检验为阳性，则所述给定分区被算作为对所述两个靶为阳性的，且如果所述分区仅对所述靶中的任一种或不对任一种靶检验为阳性，则其被算作对所述两个靶为阴性的，和(E)基于所处理的数据确定所述靶的至少一种靶的浓度。
33.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述模板的单个拷贝具有彼此互补的第一链和第二链，并且其中，所述第一靶可从所述第一链选择性扩增，且所述第二靶可从所述第二链选择性扩增。
34.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述分区包括参与扩增所述第一靶的荧光团标记引物。
35.根据段落34所述的方法，其中，所述荧光团标记引物包括发夹结构。
36.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述模板中所述第一靶由此被扩增的区域共价连接至所述模板中所述第二靶由此被扩增的区域。
37.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述第一靶和所述第二靶在等位基因变异的位点重叠。
38.根据段落37所述的方法，其中，所述等位基因变异的位点是单核苷酸多态性。
39.根据段落37或38所述的方法，其中，所述第一靶和所述第二靶用各自的第一引物和第二引物扩增，所述第一引物和所述第二引物中各自在每种引物的3’端的三个核苷酸内与等位基因变异位点重叠。
40.根据段落37-39中的任一项所述的方法，其中，所述第一引物和所述第二引物中的每一种结合所述模板的不同链以形成具有至少一个内部错配的碱基配对结构。
41.根据段落40所述的方法，其中，所述碱基配对结构具有至少两个内部错配。
42.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述第一靶不与所述第二靶重叠。
43.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述第一靶与所述第二靶重叠少于30个核苷酸。
44.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述扩增步骤产生对应于所述第一靶的第一扩增子和对应于所述第二靶的第二扩增子，并且其中，每种扩增子具有小于所述模板长度的四分之一的长度。
45.根据前述任一段落所述的方法，其中，所述第一靶和所述第二靶对应于所述模板的彼此隔开大于每种靶的长度的区域。
46.一种执行多重数字测定的方法，所述方法包括：(A)提供包含单链第一模板和双链第二模板的分区，所述双链第二模板具有第一链和第二链，所述第一模板和所述第二模板各自以局部占有存在于所述分区中，所述第一模板和所述第一链各自提供第一靶且所述第二链提供第二靶；(B)扩增所述分区中的第一靶和第二靶；(C)收集扩增各个分区中的所述第一靶和所述第二靶的数据；并且(D)基于所述数据确定单链第一模板和双链第二模板中的每一种的水平。
47.根据段落46所述的方法，其中，所述扩增的步骤通过线性扩增生成扩增子。
48.根据段落46所述的方法，其中，所述扩增的步骤包括用不太严格的退火温度执行至少一个热循环，然后用较严格的退火温度进行多个热循环的步骤。
49.根据段落48所述的方法，其中，所述第一模板用第一引物扩增，所述第一引物在不太严格的退火温度下结合所述第一模板，但在较严格的退火温度下基本上不结合所述第一模板。
50.根据段落49所述的方法，其中所述引物是具有与所述第一模板互补的3’端区域和基本上不与所述第一模板互补的5’端区域的加尾引物。
51.根据段落50所述的方法，其中，所述5’端区域的长度是至少三个核苷酸。
52.根据段落49所述的方法，其中，当与所述第一模板碱基配对时，所述引物与所述第一模板具有一个或更多个内部错配。
53.根据段落46-52中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板和所述第二模板的第一链在序列上是彼此不同的，并且二者用相同引物或引物对扩增。
54.根据段落46-53中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括cDNA且所述第二模板是基因组DNA。
55.根据段落46-54中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括RNA以及所述第二模板包括DNA。
56.根据段落46-53中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括成熟miRNA且所述第二模板包括前体-miRNA。
实施例2选择的实施方案II
本部分展示了作为一系列编索引的段落的本公开的的另外选择的实施例，涉及对关联靶的数字测定。
1.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成分区，每个分区包括样本的包含与第二靶关联的第一靶的部分；(B)收集指示每种靶在各个分区中的存在或不存在的数据；(C)基于所述数据将多个分区中的每个分区分类为对所述靶中的每种靶是阳性或阴性的，其中，所述数据中仅指示第一靶的存在的分区被分类为对两种靶是阴性的；以及(D)确定所述第一靶的水平。
2.根据段落1所述的方法，其中，所述数据中仅指示第二靶的存在的分区被分类为对于两种靶是阴性的。
3.根据段落1或2所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％与所述第二靶关联。
4.根据段落3所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％共价连接至所述第二靶。
5.根据段落1-4中的任一项所述的方法，其中，所述分类步骤包括将在所述数据中指示至少一种靶的不存在的至少大多数分区分类为对所述两种靶为阴性的步骤。
6.根据段落5所述的方法，其中，所述分类的步骤包括将在所述数据中指示至少一种靶的不存在的每个分区分类为对所述两种靶为阴性的步骤。
7.根据段落1-6中的任一项所述的方法，其中，所述确定水平的步骤基于被分类的分区的总数的第一值和被分类为对所述两种靶为阳性的分区的数量的第二值或对被分类为所述两种靶为阴性的分区的数量的第二值。
8.根据段落7所述的方法，其中，所述确定步骤包括从所述第一值和第二值计算所述第一靶的水平的步骤。
9.根据段落8所述的方法，其中，所述计算水平的步骤基于泊松统计。
10.根据段落8或9所述的方法，其中，所述水平是每分区的拷贝的平均数。
11.根据段落1-10中的任一项所述的方法，其中，所述分区是液滴。
12.根据段落1-11中的任一项所述的方法，其中，所述数据指示具有所述第一靶的存在的分区多于存在所述两种靶的分区。
13.根据段落12所述的方法，其中，所述数据指示具有所述第二靶的存在的分区多于存在所述两种靶的分区。
14.根据段落1-13中的任一项所述的方法，还包括绘制所述数据的至少一部分以形成图的步骤，其中，所述分类步骤至少部分地基于数据点的簇在所述图中的位置。
15.根据段落1-14中的任一项所述的方法，其中，收集数据的步骤包括获得每个分区的一个或更多个信号值的步骤，其中，所述分类步骤包括比较对于每个分区的一个或更多个信号值和一个或更多个阈值或范围值以对所述分区分类的步骤。
16.根据段落1-15中的任一项所述的方法，其中，所述水平是指示所述第一靶是否高于存在的存在或不存在。
17.根据段落1-16中的任一项所述的方法，其中，所述样本包括生物粒子，并且其中，当所述分区形成时，所述第一靶和所述第二靶被所述生物粒子包含。
18.根据段落17所述的方法，其中，所述生物粒子选自由生物细胞、病毒和细胞器组成的组。
19.根据段落1-18中的任一项所述的方法，其中，确定水平的步骤包括(i)基于指示具有单独的每种靶的存在的相应分区的计数计算双阳性的预期数量的步骤，和(ii)比较双阳性的预期数量和观察到的双阳性的计数以确定观察到的双阳性的计数是否明显大于双阳性的预期数量的步骤。
20.根据段落1-19中的任一项所述的方法，其中，所述第一靶是第一靶序列且所述第二靶是第二靶序列，并且其中，所述样本包括包含所述第一靶序列和所述第二靶序列的模板，并且其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列在所述模板中至少部分地彼此重叠。
21.根据段落20所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列重叠以定义重叠区域，并且其中，所述重叠区域包括对于提供所述靶的分类学种的至少一个序列变异位点。
22.根据段落21所述的方法，其中，所述至少一个序列变异位点包括单核苷酸多态性。
23.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：(A)形成分区，所述分区仅在分区的亚组中包含模板的至少一个拷贝，所述模板包含第一靶序列和第二靶序列；(B)扩增所述分区中的第一靶序列和第二靶序列；(C)收集扩增所述分区中的所述第一靶序列和所述第二靶序列的数据；(D)处理所述数据，使得如果给定分区对所述两种靶检验为阳性，则所述分区被分类为对所述两个靶为阳性的，且如果给定分区仅对所述靶中的任一种或不对任一种靶检验为阴性，则所述分区被分类为对所述两个靶为阴性；和(E)基于所处理的数据确定所述第一靶的浓度。
24.根据段落23所述的方法，其中，所述模板的单个拷贝具有彼此互补的第一链和第二链，并且其中，所述第一靶序列可从所述第一链选择性扩增，且所述第二靶序列可从所述第二链选择性扩增。
25.根据段落24所述的方法，其中，所述分区包括参与扩增所述第一靶序列的荧光团标记的引物。
26.根据段落25所述的方法，其中，所述荧光团标记的引物包括发夹结构。
27.根据段落24-26中的任一项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列重叠以定义重叠区域，并且其中，所述重叠区域包括对于提供所述靶的生物物种的至少一个序列变异位点。
28.根据段落27所述的方法，其中，所述至少一个位点是单核苷酸多态性。
29.根据段落27或28所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列分别用第一对引物和第二对引物扩增，其中，第一对引物和第二对引物各自在各自引物的3’端的三个核苷酸内与基因变异位点重叠。
30.根据段落29所述的方法，其中，所述第一对引物结合与所述第二对引物不同的模板链，以形成具有至少一个内部错配的碱基配对结构。
31.根据段落30所述的方法，其中，所述碱基配对结构具有至少两个内部错配。
32.根据段落23-31中的任一项所述的方法，其中，所述扩增步骤产生对应于所述第一靶序列的第一扩增子和对应于所述第二靶序列的第二扩增子，并且其中，每种扩增子具有小于所述模板长度的四分之一的长度。
33.根据段落23-32中的任一项所述的方法，其中，所述第一靶序列和所述第二靶序列对应于所述模板的彼此隔开大于每种靶序列的长度的区域。
34.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：(A)提供包含单链第一模板和双链第二模板的分区，所述双链第二模板具有第一链和第二链，所述第一模板和所述第二模板各自仅存在于所述分区的亚组中，所述第一模板和所述第一链各自包括第一靶序列且所述第二链包括第二靶序列；(B)扩增所述分区中的第一靶序列和第二靶序列；(C)收集扩增各个分区中的所述第一靶序列和所述第二靶序列的数据；和(D)基于所述数据确定单链第一模板和双链第二模板中的每一种的水平。
35.根据段落34所述的方法，其中，所述扩增的步骤通过线性扩增生成扩增子。
36.根据段落34或35所述的方法，其中，所述扩增的步骤包括用不太严格的退火温度执行至少一个热循环，然后用较严格的退火温度进行多个热循环的步骤。
37.根据段落36所述的方法，其中，所述第一靶序列用引物扩增，所述引物在不太严格的退火温度下结合所述第一模板，但在较严格的退火温度下基本上不结合所述第一模板。
38.根据段落37所述的方法，其中所述引物是具有与所述第一模板的至少一个区域互补的3’端区域和基本上不与所述第一模板互补的5’端区域的加尾引物。
39.根据段落38所述的方法，其中，所述5’端区域的长度是至少三个核苷酸。
40.根据段落37-39中的任一项的方法，其中，当与所述第一模板碱基配对时，所述引物与所述第一模板具有一个或更多个内部错配。
41.根据段落34-40中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板的第一靶序列和所述第一链的第一靶序列在序列上彼此不同，并且均用相同的一对引物扩增。
42.根据段落34-41中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括cDNA且所述第二模板包括基因组DNA。
43.根据段落34-41中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括RNA且所述第二模板包括DNA。
44.根据段落34-41中的任一项所述的方法，其中，所述第一模板包括成熟miRNA且所述第二模板包括前体-miRNA。
实施例3选择的实施方案III
本实施例描述了本公开的选择的实施方案，涉及生物粒子或从其制备的核酸的数字测定以及用于执行该数字测定的组合物或组。所选择的实施方案以一系列编号的段落描述。
1.一种用于鉴定靶细胞或靶病毒粒的方法，所述方法包括：(A)提供样本，所述样本包括至少两个细胞或病毒粒和/或从其制备的核酸；(B)将所述样本划分为一组分区；和(C)检测至少两种鉴别标识物在每个分区内的存在或不存在；其中，所述至少两种鉴别标识物在单个分区中的存在或不存在鉴定所述单个分区中的细胞或病毒粒。
2.根据段落1所述的方法，其中，所述样本包括至少两个细胞或从其制备的核酸。
3.根据段落1所述的方法，其中，所述样本包括至少两个病毒粒或从其制备的核酸。
4.根据段落1所述的方法，其中，所述至少两种鉴别标识物选自由以下组成的组：核酸序列、代谢产物和蛋白质。
5.根据段落4所述的方法，其中，一种鉴别标识物是包括核糖体序列的核酸序列，所述核糖体序列选自由以下组成的组：5S rRNA或5S rDNA序列、16S rRNA或16S rDNA序列、18S rRNA或18S rDNA序列、23S rRNA或23S rDNA序列以及28S rRNA或28S rDNA序列。
6.根据段落1或2所述的方法，其中，检测到一种鉴别标识物指示病原性指示物的存在或不存在。
7.根据段落1或2所述的方法，其中，所述至少两种鉴别标识物包括核糖体序列和病原性指示物。
8.根据段落1或2所述的方法，其中，所述鉴别标识物中的至少两种包括核糖体序列。
9.根据段落8所述的方法，其中，包括核糖体序列的一种鉴别标识物是种特异性的，且包括核糖体序列的一种鉴别标识物是群特异性的。
10.根据段落9所述的方法，其中，所述群特异性鉴别标识物是属特异性鉴别标识物。
11.根据段落2所述的方法，其中，所述细胞包括细菌细胞。
12.根据段落11所述的方法，其中，所述细菌细胞是葡萄球菌细胞。
13.根据段落1或12所述的方法，其中，所述鉴别标识物中的至少一种包括检测耐甲氧西抗性的标识物。
14.根据段落13所述的方法，其中，所述鉴别标识物中的至少一种包括一组种特异性标记。
15.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，每种标识物检测靶和非靶细胞或病毒粒，而检测到两种标记特异性地检测指定靶细胞或病毒粒。
16.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，鉴定的细胞或鉴定的病毒粒在分区中的平均数小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
17.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，所述分区步骤生成至少1000个分区的组。
18.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，至少两种鉴别标识物在分区中的存在或不存在鉴定驻留在所述分区中的单个细胞或病毒粒中的所述至少两种鉴别标识物的存在或不存在，统计学置信度大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、67％、75％、80％、90％、95％或99％。
19.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，所述方法还包括比较两种鉴别标识物在单个分区中的共定位的频率和共定位的频率，从而确定包含所述靶细胞或病毒粒的分区的数量。
20.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，所述检测步骤通过扩增至少一个分区中的所述至少两种鉴别标识物来执行。
21.根据段落20所述的方法，其中，所述被扩增的至少两种鉴别标识物包括核酸。
22.根据段落21所述的方法，其中，所述扩增包括使探针与所述至少两种鉴别标识物杂交。
23.根据段落1-19中的任一项所述的方法，其中，检测所述至少两种鉴别标识物包括使用第一探针检测一种鉴别标识物和使用第二探针检测另一鉴别标识物。
24.根据段落23所述的方法，其中，所述探针包括核酸、抗体、适体或酶。
25.根据段落24所述的方法，其中，包括核酸、抗体、适体或酶的所述探针被偶联至可检测的标记。
26.根据段落24所述的方法，其中，所述检测包括在包含所述至少两种鉴别标识物的分区中扩增所述探针中的至少一种。
27.根据段落24所述的方法，其中，所述检测包括在包含所述至少两种鉴别标识物的分区中扩增所述探针中的至少两种。
28.根据段落24所述的方法，其中，所述检测包括使用所述探针中的至少一种扩增在包含至少两种鉴别标识物的分区中的鉴别标识物。
29.根据段落24所述的方法，其中，所述检测包括使用所述探针中的两种扩增在包含至少两种鉴别标识物的分区中的所述至少两种鉴别标识物。
30.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，将至少两种鉴别标识物在至少一个分区中的存在或不存在与鉴别标识物模式的数据库比较，其中，所述比较鉴定至少一个分区中的细胞或病毒粒。
31.根据段落2所述的方法，其中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
32.根据段落31所述的方法，其中，一种鉴别标识物是组织类型的鉴别标识物且另一种鉴别标识物是肿瘤标志物。
33.根据段落31所述的方法，其中，一种鉴别标识物是表观遗传标志物。
34.根据段落33所述的方法，其中，所述表观遗传标志物通过差异化DNA分裂或化学检测来检测。
35.根据段落34所述的方法，其中，所述化学检测包括重亚硫酸盐转化。
36.根据段落34所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA接触核酸酶。
37.根据段落36所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA与甲基化特异性或甲基化敏感性核酸酶接触。
38.根据段落32所述的方法，其中，所述肿瘤标志物是化疗耐受标志物、转移潜能性标志物或异常调节的细胞增殖标志物。
39.根据以上段落中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括检测每个分区内的至少三种鉴别标识物。
40.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过群特异性检测试剂的存在或不存在检测作为群的成员的靶细胞或病毒粒，以及通过至少一种种特异性检测试剂的存在或不存在检测所述细胞或病毒粒的种。
41.根据上述段落中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过至少一种群特异性检测试剂的存在或不存在检测作为群的成员的靶细胞或病毒粒，以及通过至少一种菌特异性检测试剂的存在或不存在排除靶细胞或病毒粒的特定种。
42.一种组合物，包含小于约100nL的分区混合物，所述混合物包含：(A)小于约2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶细胞或病毒粒或从其制备的核酸；(B)群特异性鉴别标识物检测试剂；(C)种特异性鉴别标识物检测试剂；以及(D)核酸扩增试剂。
43.根据段落42所述的组合物，其中，所述群特异性检测试剂和种特异性检测试剂检测16S rRNA或16S rDNA。
44.一组分区，其中，至少一个分区包含段落42所述的分区的混合物。
45.根据段落44所述的组，其中，至少100、200、300、500或1000个分区包含段落42所述的分区混合物。
实施例4选择的实施方案IV
本实施例描述本公开选择的实施方案，涉及生物粒子或从其制备的核酸的数字测定，以及用于执行数字测定的组合物或组。这些所选择的实施方案作为一系列编号的段落展示。
1.一种样本分析的方法，所述方法包括：(A)提供样本，所述样本包括至少两种类型的生物粒子和/或从其制备的核酸，其中，每种类型的生物粒子包含不同的靶组或亚组，所述不同的靶组或亚组包括两种或更多种靶中的至少一种；(B)形成各自包含所述样本的一部分的分区；(C)确定多个分区中的每个分区中所述两种或更多种靶中的每种靶的存在或不存在；和(D)确定包含所述两种或更多种靶的特定的靶组或亚组的生物粒子类型的水平。
2.根据段落1所述的方法，还包括在形成分区的步骤后打开所述分区中的生物粒子的步骤。
3.根据段落2所述的方法，其中，所述打开步骤包括加热所述分区的步骤。
4.根据段落3所述的方法，其中，所述加热步骤包括将所述分区加热到至少约50摄氏度的温度的步骤。
5.根据段落3所述的方法，其中，所述加热步骤包括将所述分区加热到至少约90摄氏度的温度的步骤。
6.根据段落2-5中的任一项所述的方法，其中，所述打开步骤包括用酶降解部分所述生物粒子的步骤。
7.根据段落1-6中的任一项所述的方法，其中，所述生物粒子的至少两种类型包括包含特定的靶组或亚组的类型和至少两种其他类型，并且其中，确定水平的步骤包括，如果存在的话，校正由各个分区中至少两种其他类型的生物粒子或来自其的核酸中的每一种的共定位导致的各个分区中的特定的靶组或亚组的偶然发生率的步骤。
8.根据段落1-7中的任一项所述的方法，其中，所述水平是所述类型的生物粒子在所述样本中的存在或不存在。
9.根据段落1-7中的任一项所述的方法，其中，所述水平是浓度，并且其中，所述浓度是每个分区所述类型的生物粒子的的平均拷贝数。
10.根据段落1-9中的任一项所述的方法，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括至少两种类型的细胞。
11.根据段落10所述的方法，其中，所述至少两种类型的细胞包括至少两种类型的细菌细胞。
12.根据段落11所述的方法，其中，所述细菌细胞包括葡萄球菌细胞。
13.根据段落12所述的方法，其中，所述靶中的至少一种表示甲氧西林抗性。
14.根据段落1-9中的任一项所述的方法，其中，所述至少两种类型的生物粒子包括至少两种类型的病毒粒。
15.根据段落1-14中的任一项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶选自由以下组成的组：核酸序列、代谢产物和蛋白质。
16.根据段落1-15中的任一项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶中的至少一种靶是由RNA提供的靶序列。
17.根据段落16所述的方法，其中，所述两种或更多种靶中的每种靶是由RNA提供的靶序列。
18.根据段落16或17所述的方法，还包括在形成分区的步骤后从所述RNA生成互补DNA的步骤。
19.根据段落18所述的方法，还包括扩增所述互补DNA的序列的步骤。
20.根据段落18或19所述的方法，其中，生成互补DNA的步骤用具有逆转录酶活性的酶来执行。
21.根据段落1-20中的任一项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶包括第一靶和第二靶，其中，生物粒子的至少两种类型包括包含所述第一靶而不包含所述第二靶的类型，包含所述第二靶而不包含所述第一靶的类型，以及包含所述第一靶和第二靶两者的类型，并且其中，确定一种类型的生物粒子的水平的步骤包括确定包含所述第一靶和所述第二靶的类型的水平的步骤。
22.根据段落21所述的方法，其中，包含所述第一靶和所述第二靶的类型和包含所述第一靶而不包含第二靶的类型属于相同分类单元，所述相同分类单元不包括包含所述第二靶而不包含所述第一靶的类型。
23.根据段落22所述的方法，其中，所述分类单元是属或种。
24.根据段落1-23中的任一项所述的方法，其中，所述靶中的至少一种是包括核糖体RNA或DNA序列的核酸序列。
25.根据段落24所述的方法，其中，所述核糖体RNA或DNA序列是选自由以下组成的组的序列：5S核糖体RNA或DNA序列、16S核糖体RNA或DNA序列、18S核糖体RNA或DNA序列、23S核糖体RNA或DNA序列以及28S核糖体RNA或DNA序列。
26.根据段落24或25所述的方法，其中，所述核酸序列是由基因组DNA提供的DNA序列。
27.根据段落24或25所述的方法，其中，所述核酸序列是由核糖体RNA提供的RNA序列，所述方法还包括扩增从RNA序列形成的互补DNA序列的步骤。
28.根据段落1-27中的任一项所述的方法，其中，至少两种靶中的每一种包括核糖体RNA或DNA序列。
29.根据段落28所述的方法，其中，至少一种所述靶包括相对于一个属的其他种，对所述属的特定种特异的核糖体RNA或DNA序列，并且其中，至少一种所述靶包括存在于所述属的多个种中的核糖体RNA或DNA序列。
30.根据段落24-29中的任一项所述的方法，其中，至少一种所述靶包括病原性指示物。
31.根据段落1-30中的任一项所述的方法，其中，两种或更多种靶包括两种或更多种种特异性靶的组。
32.根据段落1-31中的任一项所述的方法，其中，每个分区平均包含来自每种类型的生物粒子的核酸的少于三个基因组当量。
33.根据段落1-32中的任一项所述的方法，其中，形成分区的步骤生成至少1000个分区。
34.根据段落1-33中的任一项所述的方法，其中，只有分区的亚组包含所述靶中的任一种的至少一个拷贝。
35.根据段落1-34中的任一项所述的方法，其中，每种靶包括核酸，所述方法还包括扩增所述分区中的每种靶的步骤。
36.根据段落35所述的方法，其中，所述分区包括对每种靶的扩增共同地敏感的一种或更多种报告物。
37.根据段落36所述的方法，其中，所述分区包括对于每种靶的不同报告物，并且其中，所述不同报告物只特异结合所述靶中的一种和/或只结合对应于所述靶中的一种靶的扩增子。
38.根据段落36所述的方法，其中，所述分区包括对每种靶的扩增敏感的相同的通用报告物。
39.根据段落36所述的方法，其中，每种报告物包括核酸、抗体、适体、酶或其组合。
40.根据段落1-39中的任一项所述的方法，其中，将至少两种或更多种靶在至少一个分区中的存在或不存在与靶的模式的数据库比较，其中，所述比较鉴定所述至少一个分区中的生物粒子的类型。
41.根据段落1-40中的任一项所述的方法，其中，所述生物粒子包括哺乳动物细胞。
42.根据段落41所述的方法，其中，所述靶中的至少一种提供组织鉴定并且所述靶中的至少另一种是肿瘤标志物。
43.根据段落42所述的方法，其中，所述肿瘤标志物是化疗抗性标记物、转移潜能性标记物或异常调节的细胞增殖标志物。
44.根据段落41所述的方法，其中，至少一种靶是表观遗传标志物。
45.根据段落44所述的方法，其中，表观遗传标志物通过差异化DNA分裂或化学检测来检测。
46.根据段落45所述的方法，其中，所述化学检测包括重亚硫酸盐转化。
47.根据段落45所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA接触核酸酶。
48.根据段落47所述的方法，其中，所述差异化DNA分裂检测包括使DNA接触甲基化特异性或甲基化敏感性核酸酶。
49.根据段落1-48中的任一项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶包括至少三种靶。
50.根据段落1-49中的任一项所述的方法，还包括通过群特异性靶的存在或不存在将所述样本中一种类型的生物粒子鉴定为群的成员，以及通过至少一种种特异性靶的存在或不存在排除所述类型的生物粒子的特定种的步骤。
51.根据段落1-50中的任一项所述的方法，还包括确定每种类型的生物粒子的水平的步骤。
52.包括多个分区的组，每个分区包含相同样本的一部分并且每个分区具有小于100nL的体积，所述样本包括至少两种类型的生物粒子和/或从其制备的核酸，其中，每种类型的生物粒子包含包括所述两种或更多种靶中的至少一种的不同的靶组或亚组，所述两种或更多种靶包括存在于相同分类等级的多个分类单元中的第一靶和仅存在于多个分类单元中的一个分离单元中的第二靶，其中，只有分区的亚组包含所述靶中的任一种的至少一个拷贝，并且其中，每个分区也包括检测第一靶的第一报告物和检测第二靶的第二报告物以及足以扩增每种靶的试剂。
53.根据段落52所述的组，其中，所述群特异性报告物和种特异性报告物各自特异性结合16S核糖体RNA或DNA序列。
54.根据段落52或53所述的组，其中，所述多个分区包括至少1000个分区。
55.根据段落52-54中的任一项所述的组，其中，每个分区是液滴，还包括封围所有液滴的连续相。
以上阐述的公开内容可以覆盖具有单独的实用性的多个不同的发明。虽然这些发明中的每一个已经以优选的形式公开，但是，如本文公开和例示的具体实施方案不应以限制性意义被考虑，因为很多种变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元素、特征、功能和/或性质的所有新颖且非显而易见的组以及亚组。所附权利要求书特别地指出了被视为新颖且非显而易见的特定组和亚组。以所述特征、功能、元素和/或性质的其他组以及亚组体现的发明可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。此类权利要求，无论其是否针对不同的或相同的发明，并且无论其是否比原始权利要求的范围更宽、更窄、相等或不同，也都应认为包含在本公开的发明的主题范围内。此外，除非另有特别指出，对于所提到的元素的序号，诸如第一、第二或第三被用来区分这些元件，而不指示此类元件的特定位置或顺序。

Claims (10)

1.一种执行数字测定的方法，所述方法包括：
形成分区，每个分区包括样本的一部分，所述样本包含与第二靶相关联的第一靶；
收集指示每种靶在各个分区中的存在或不存在的数据；
基于所述数据将多个分区中的每个分区分类为对于每种靶为阳性或阴性的，其中，在所述数据中具有仅指示所述第一靶的存在的分区被分类为对于两种靶为阴性的；和
确定所述第一靶的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述数据中具有仅指示所述第二靶的存在的分区被分类为对于两种靶为阴性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％与所述第二靶相关联。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，当形成所述分区时，所述第一靶的至少80％共价连接至所述第二靶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分类步骤包括将在所述数据中具有指示至少一种靶的不存在的至少大多数分区分类为对于所述两种靶为阴性的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述分类步骤包括将在所述数据中具有指示至少一种靶的不存在的每个分区分类为对于所述两种靶为阴性的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，确定水平的步骤基于被分类的分区的总数的第一值和被分类为对于所述两种靶为阳性的分区的数量的第二值或被分类为对于所述两种靶为阴性的分区的数量的第二值。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述确定步骤包括从所述第一值和所述第二值计算所述第一靶的水平的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述计算水平的步骤基于泊松统计。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述水平是每分区的拷贝的平均数。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP2530168B1 (en) 2006-05-11 2015-09-16 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
US10351905B2 (en) * 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
EP3392349A1 (en) 2010-02-12 2018-10-24 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP2614160B1 (en) 2010-09-10 2016-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of rna-interacting regions in dna
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP3412778A1 (en) 2011-02-11 2018-12-12 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675913B1 (en) 2011-02-15 2016-12-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detecting methylation in a subpopulation of genomic dna
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
EP2714970B1 (en) 2011-06-02 2017-04-19 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2015023677A1 (en) * 2013-08-12 2015-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Amplification reporter with base-pairing oligomers
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US20160273027A1 (en) * 2013-11-26 2016-09-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for detecting nucleic acids proximity
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2016061398A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, kits & compositions to assess helicobacter pylori infection
CN107250382A (zh) * 2015-02-17 2017-10-13 生物辐射实验室股份有限公司 使用分裂循环扩增的小核酸定量
US11004540B2 (en) * 2015-06-05 2021-05-11 Life Technologies Corporation Determining the limit of detection of rare targets using digital PCR
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
TWI570242B (zh) * 2015-12-28 2017-02-11 華聯生物科技股份有限公司 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法
CN108603193B (zh) 2015-12-30 2022-07-22 生物辐射实验室股份有限公司 分裂循环和tape扩增
WO2017120531A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
US11397882B2 (en) 2016-05-26 2022-07-26 Becton, Dickinson And Company Molecular label counting adjustment methods
CN109906274B (zh) 2016-11-08 2023-08-25 贝克顿迪金森公司 用于细胞标记分类的方法
CN106636370A (zh) * 2016-11-30 2017-05-10 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类hla‑b*5701等位基因的核酸、试剂盒及方法
US11047854B2 (en) * 2017-02-06 2021-06-29 Abbott Japan Llc Methods for reducing noise in signal-generating digital assays
EP3838268B1 (en) 2017-02-24 2023-05-10 The Regents of the University of California Particle-drop structures and methods for making and using the same
WO2019204357A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 ChromaCode, Inc. Methods and systems for multiplex analysis
US11358137B2 (en) 2018-12-26 2022-06-14 Industrial Technology Research Institute Tubular structure for producing droplets and method for producing droplets
CN114829625A (zh) * 2019-12-09 2022-07-29 凸版印刷株式会社 检测方法
CA3167725A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Fluent Biosciences Inc. Single cell sequencing
US11866782B2 (en) 2020-03-16 2024-01-09 Fluent Biosciences Inc. Multi-omic analysis in monodisperse droplets
EP4340947A1 (en) * 2021-05-18 2024-03-27 Fluent Biosciences Inc. Perturbed genomic expression in pretemplated instant partitions
WO2024068399A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Oncobit Ag Detection method, computer program product, data processing unit and detection system for detecting mutations of a polynucleotide in a biological sample

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US20120252015A1 (en) * 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US9156010B2 (en) * 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9127312B2 (en) * 2011-02-09 2015-09-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
US20130023433A1 (en) * 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
EP2686449B1 (en) * 2011-03-18 2020-11-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
WO2012129436A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Life Technologies Corporation Identification of linkage using multiplex digital pcr

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