JP6956012B2 - 標的核酸及び多様体の検出 - Google Patents
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Description
a)鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
b)標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、当該プライマーセットは少なくともプライマーHとプライマーLを含有しており、プライマーHの融点は、プライマーLの融点よりも少なくとも15℃高く、プライマーLは、プライマーHの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
c)伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
d)区分化PCR反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、PCR試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
e)以下の工程を含む、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)を行うこと:
i.変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
ii.高いアニーリング温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできないようにすること
iii.任意で、伸長温度で区分化PCR反応物をインキュベートすること
iv.任意で、工程i〜iiiを繰り返すこと
v.それによって、標的核酸配列の1つの鎖のみを増幅させること
f)以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行うこと:
1)変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートすることであって、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
2)低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHとプライマーLの両方のアニーリングを可能にさせること
3)伸長温度でPCRをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
4)任意で、工程II〜IVを繰り返すこと
5)それによって、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、PCR産物を得ること
g)PCR産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
増幅:核酸の増幅は、当該核酸のコピーの生成である。「標的核酸の増幅が可能なプライマー対」という用語は、本明細書において使用される場合、当該プライマー対が標的核酸、ヌクレオチド、及び核酸ポリメラーゼと共にPCRに加えられた場合に、当該PCRに標的核酸の生成をもたらすプライマー対を指す。
本発明は、サンプルにおいて標的核酸中の多様体配列の存在を検出するための方法を提供する。
a)鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること、
b)例えば本明細書において以下の「プライマーセット」の項に記載されているプライマーセットのいずれかであり得る、プライマーセットを提供すること、
c)伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供することであって、当該ポリメラーゼは、例えば本明細書において以下の「PCR試薬」の項に記載されている核酸ポリメラーゼのいずれかであり得ること、
d)例えば本明細書において以下の「区分化PCR反応物」の項に記載されている区分化PCR反応物を調製すること、
e)例えば本明細書において以下の「非対称性漸増ポリメラーゼ反応」の項に記載されている、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)を行うこと、
f)ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、好ましくは本明細書において以下の「指数関数的PCR」に記載されている指数関数的PCR反応を行うこと、
g)PCR産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出することであって、当該検出は例えば、本明細書において以下の「検出」の項に記載されるように行われてもよい。
本発明はまた、以下を含有する部分キットを提供する:
a)プライマーセット。例えば本明細書において以下の「プライマーセット」の項に記載されているプライマーセットのいずれかであってもよい。
b)標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブ。当該プローブは、少なくとも1つのフルオロフォアと少なくとも1つのクエンチャーが連結しており、この場合において当該検出プローブは例えば本明細書において以下の「検出」の項に記載されている検出プローブのいずれかであってもよい。
c)核酸ポリメラーゼ。例えば、本明細書において以下の「PCR試薬」の項に記載されている核酸ポリメラーゼのいずれかであってもよい。
d)PCR試薬。例えば、本明細書において以下の「PCR試薬」の項に記載されている試薬のいずれかであってもよい。
e)区分化PCR反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。例えば、本明細書において以下の「区分化PCR反応物」の項に記載されている試薬のいずれかであってもよい。
上述のように、本発明方法は、標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出に有用である。
本明細書に記載される方法は、プライマーセットの使用を含む。プライマーセットは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも1つのプライマー対を含有し、当該プライマーセットは、少なくともプライマーHとプライマーLを含有する。
a)プライマーHの融点の、±15℃の範囲、好ましくは±20℃の範囲、例えば±25℃の範囲、例えば±10℃の範囲、例えば±8℃の範囲、例えば±6℃の範囲、例えば±4℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
b)プライマーHと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
本発明の方法及びキットは、プライマーH及びプライマーLを含有するプライマーセットの使用を含むものであり、この場合においてプライマーHの融点は、プライマーLの融点よりも少なくとも10℃、好ましくは少なくとも15℃高く、プライマーLは、プライマーHの伸長産物に対して相補的な配列を含有している。プライマーセットは他のプライマー、例えば本明細書において上記の「プライマーセット」の項に記載されている他のプライマーを含有してもよいが、プライマーセットは、プライマーHとプライマーLからなっていてもよく、この場合においてプライマーHとプライマーLは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる。
本発明方法はPCRを行う工程を含む。当業者であれば、どのようにPCRを実行するか、及びどの試薬がPCRの実行に有用であり得るかを良く認識している。かかる試薬は本明細書においてPCR試薬と呼称される。本発明の部分キットもまたPCR試薬を含有する。
−非特異的ブロッキング剤、例えばBSA又はウシの皮膚由来のゼラチン、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、又は他の普遍的なブロッキング剤、
−非特異的バックグラウンド/ブロッキング核酸(例えばサケの精子DNA)、
−バイオプリザバティブ(例えばアジ化ナトリウム)
−PCR増強剤(例えば、ベタイン、トレハロースなど)
−阻害剤(例えば、RNAse阻害剤)。
本発明方法は概して、区分化PCR反応物を調製する工程を含有する。区分化PCR反応物はその後、AIPR工程に供され、その後、本明細書に記載されるように1回以上のPCRに供される。区分化PCR反応物の調製は、サンプルを複数の小さな画分に分割することを含み、それら各々がプライマーセット、核酸ポリメラーゼ、PCR試薬、及び任意で検出試薬を含有している。
本発明方法は、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)の工程を含む。指数関数的PCRのいずれの工程よりも前にAIPRが行われることが重要である。従って、概して、工程e)は、工程f)の前に行われる。AIPRは、以下の工程を含む:
i)変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子へと変性させること、
ii)高いアニーリング温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHをアニーリングさせるが、プライマーLはアニーリングさせないこと、
iii)任意で、伸長温度で区分化PCR反応物をインキュベートすること、
iv)任意で、工程i〜iiiを繰り返すこと。
i.変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子へと変性させること、
ii.高いアニーリング温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってプライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできず、この場合において当該高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、当該アニーリングされたプライマーHの伸長が可能となること、
iii.工程i〜iiを繰り返すこと。
i.変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子へと変性させること、
ii.高いアニーリング温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってプライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできないこと、
iii.区分化PCR反応物を伸長温度でインキュベートし、それによって、アニーリングされたプライマーHの伸長を可能とすること、
iii.工程i〜iiiを繰り返すこと。
本発明の一部の実施形態において、当該方法は、低い温度のPCRの工程を含み、当該工程は、AIPRの完了後、及び指数関数的PCRの前に行われる。
1)変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってDNAを一本鎖分子に変性させること、
2)非常に低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHと、プライマーLの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能とさせること、
3)伸長温度でPCRをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能とすること、
4)任意で、工程1)〜3)を繰り返し、それによってPCR産物を得ること。
本発明方法は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行う工程を含む。この工程とAIPRを区別するため、この工程は「指数関数的PCR」とも呼称され得る。本発明方法において、ポリメラーゼ鎖反応は、AIPRの後に行われる。指数関数的PCRは、概して、以下の工程を含む:
I.変性温度で区分化PCR反応物をインキュベートし、DNAを一本鎖分子に変性させること、
II.低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHとプライマーLの両方のアニーリングを可能とすること、
III.伸長温度でPCRをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能とすること、
IV.任意で工程I〜IIIを繰り返し、PCR産物を得ること。
本発明方法は概して、PCR産物が多様体配列、及び/又は標的核酸配列を含有しているか否かを、検出する工程を含有する。当該検出は、当業者に公知の任意の適切な方法で達成され得る。例えば、多くの有用な検出方法が先行技術として公知であり、それらを本発明に使用することができる。
・多様体プローブが、少なくとも1つのフルオロフォア、及び当該フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる少なくとも1つのクエンチャーに連結されている;
・核酸ポリメラーゼが、5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼである;及び/又は
・当該方法が、標的核酸配列中の多様体配列の存在を検出する方法である。
・野生型検出プローブが、少なくとも1つのフルオロフォア、及び当該フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる少なくとも1つのクエンチャーに連結されている;
・核酸ポリメラーゼが、5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼである;及び/又は
・当該方法が、標的核酸配列の存在を検出する方法である。
一部の例において、検出プローブは、分子ビーコンである。分子ビーコン(MB)は、標的核酸(例えば、標的DNA)の検出と定量を目的として設計されたオリゴヌクレオチドであり得る。MBの5’末端と3’末端は、集合的に部分の対を含有しており、それらが、MBに検出特性を寄与し得る。その末端のうちの1つはフルオロフォアに付加され、他方が当該フルオロフォアの蛍光発光をクエンチすることができるクエンチャー分子に付加され得る。例えば、フルオロフォア/クエンチャーの対は、例えばEDANS又はフルオレセインなどのフルオロフォアを例えば5’末端に使用することができ、及び例えばDabcylなどのクエンチャーを例えば3’末端に使用することができる。
本発明方法は、多くの様々な応用を有し得る。事実、当該方法は、標的核酸配列の存在を検出することが望まれる、及び/又は多様体配列を含有する、もしくは含有しない標的核酸を識別することが望まれる、すべての応用に有用である。
a)鋳型核酸を含有する当該個体由来のサンプルを提供すること、
b)本明細書に記載される標的核酸配列中の多様体配列の検出方法を実行すること、
ここで、当該標的核酸中の多様体配列の存在は、当該臨床状態の存在の指標である。
・プライマーHは、配列番号69、70、71又は72の50〜100個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、プライマーLは、配列番号69、70、71又は72に相補的な配列の10〜20個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有するか、又は
・プライマーHは、配列番号69、70、71又は72に相補的な配列の50〜100個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、プライマーLは、配列番号69、70、71又は72の10〜20個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、
ここで、プライマーHとプライマーLは共に、本明細書に言及される変異のいずれかをコードするヌクレオチドの少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる。
a)鋳型核酸を含有する当該個体由来のサンプルを提供すること、
b)本明細書に記載される標的核酸配列中の多様体配列の検出方法を実行すること、
ここで、当該標的核酸の存在は、当該臨床状態の存在の指標である。
本発明は以下の実施例によりさらに解説されるが、それらは本発明に対する限定であるとみなされないものとする。
本発明は、以下の項目によりさらに規定され得る:
1.以下の工程を含有する、サンプル中の標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法:
a)鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
b)標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーHとプライマーLを含有しており、前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高く、前記プライマーLは、プライマーHの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
c)伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
d)区分化PCR反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、PCR試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
e)以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)を行うこと:
i.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
ii.高いアニーリング温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできないようにすること
iii.任意で、伸長温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすること
iv.任意で、工程i〜工程iiiを繰り返すこと
f)以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行うこと:
I.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすることであって、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
II.低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHとプライマーLの両方のアニーリングを可能にさせること
III.伸長温度でPCRをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
IV.任意で、工程II〜IVを繰り返し、それによってPCR産物を得ること
g)PCR産物が、標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
2.工程e)は、標的核酸配列のうちの1つの鎖のみを増幅させる、項目1に記載の方法。
3.工程f)は、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、PCR産物を得る、項目1〜2のいずれかに記載の方法。
4.前記多様体配列が、一塩基変異である、項目1〜3のいずれか1つに記載の方法。
5.前記多様体配列が、一塩基多型(SNP)である、項目1〜3のいずれか1つに記載の方法。
6.前記PCR産物が、多様体配列を含有する標的核酸配列と、多様体配列を有しない標的核酸配列の両方を含有し得る、項目1〜5のいずれか1つに記載の方法。
7.以下の工程を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在を検出する方法:
a)鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
b)標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーHとプライマーLを含有しており、前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高く、前記プライマーLは、プライマーHの伸長産物に対し相補的な配列を含有していること
c)伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供することであって、前記伸長温度は、プライマーHの融点よりも高いこと
d)区分化PCR反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、PCR試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
e)以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)を行うこと:
i.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
ii.高いアニーリング温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできないようにすること
iii.任意で、伸長温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすること
iv.任意で、工程i〜工程iiiを繰り返すこと
f)以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行うこと:
I.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすることであって、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
II.低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHとプライマーLの両方のアニーリングを可能にさせること
III.伸長温度でPCRをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
IV.任意で、工程II〜IVを繰り返し、それによってPCR産物を得ること
g)PCR産物が、標的核酸配列を含有しているか否かを検出すること。
8.前記工程e)のAIPRが、以下の工程を含む、項目1〜7のいずれか1つに記載の方法:
i.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子へと変性させること、
ii.高いアニーリング温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってプライマーHのアニーリングは可能にさせるが、プライマーLのアニーリングは可能にさせず、この場合において前記高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、アニーリングされたプライマーHの伸長が可能になること、
iii.工程i〜iiを繰り返すこと。
9.前記工程e)のAIPRが、以下の工程を含む、項目1〜7のいずれか1つに記載の方法:
i)変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子へと変性させること、
ii)高いアニーリング温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHのアニーリングを可能にさせるが、プライマーLのアニーリングは可能にさせないこと、
iii)伸長温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、アニーリングされたプライマーHの伸長が可能になること、
iv)任意で、工程i〜iiiを繰り返すこと。
10.前記プライマーHが、プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高い融点を有する、プライマーセット中の唯一のプライマーである、項目1〜9のいずれか1つに記載の方法。
11.前記プライマーセットが、プライマーHとプライマーLからなり、この場合において前記プライマーHと前記プライマーLは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる、項目1〜10のいずれか1つに記載の方法。
12.前記プライマーHが、標的核酸配列の5’末端の配列と同一であり、前記プライマーLが、標的核酸配列の3’末端の相補配列と同一である、項目1〜11のいずれか1つに記載の方法。
13.前記工程e)が、前記プライマーHの伸長は生じさせるが、前記プライマーLの検出可能な伸長は生じさせない、項目1〜12のいずれか1つに記載の方法。
14.前記工程e)が、前記プライマーHの伸長は生じさせるが、他のすべてのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない、項目1〜13のいずれか1つに記載の方法。
15.前記プライマーHの融点が、前記プライマーLの融点よりも少なくとも15℃高い、項目1〜14のいずれか1つに記載の方法。
16.前記プライマーHの融点が、前記プライマーLの融点よりも少なくとも16℃高い、好ましくは少なくとも18℃高い、例えば少なくとも20℃高い、例えば15〜50℃の範囲で高い、例えば15〜25℃の範囲で高い、項目1〜15のいずれか1つに記載の方法。
17.前記プライマーHの融点が、60〜90℃の範囲である、例えば60〜80℃の範囲である、好ましくは70〜85℃の範囲である、例えば70〜80℃の範囲である、項目1〜16のいずれか1つに記載の方法。
18.前記プライマーLの融点が、30〜55℃の範囲である、例えば35〜55℃の範囲である、好ましくは40〜50℃の範囲である、項目1〜17のいずれか1つに記載の方法。
19.プライマーHが、プライマーHと共に標的核酸配列を増幅させることができるプライマーセット内の他のすべてのプライマーの融点よりも少なくとも15℃高い融点を有している、項目1〜18のいずれか1つに記載の方法。
20.前記プライマーセットが、以下のプライマーをいずれも含有しない、項目1〜19のいずれか1つに記載の方法:
a)プライマーHの融点の、±15℃の範囲、好ましくは±20℃の範囲、例えば±25℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
b)プライマーHと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
21.前記プライマーセットが、2つ以上のプライマーHと、プライマーHのいずれかと共にプライマー対を形成する任意のプライマーを含有し、前記プライマーは、前記プライマー対のうちの前記プライマーHの融点よりも少なくとも15℃低い融点を有する、項目1〜20のいずれか1つに記載の方法。
22.プライマーHが、例えば1つ以上のLNAなど、1つ以上のヌクレオチドアナログを含有する、項目1〜21のいずれか1つに記載の方法。
23.前記区分化PCR反応物の各々が、標的核酸配列を含有する鋳型核酸を平均で最大で10個、例えば最大で5個、含有する、項目1〜22のいずれか1つに記載の方法。
24.前記区分化PCR反応物の各々が、ドロップレット生成機を使用して調製されたドロップレット中に含有される、項目1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25.前記区分化PCR反応物の各々が、例えば1〜10,000ピコリットルの範囲の量、例えばおよそ1000ピコリットルの量のドロップレット中に含有される、項目1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26.前記区分化PCR反応物が、マイクロタイタープレート中に含有される、項目1〜23のいずれか1つに記載の方法。
27.工程e)は、8〜256回の範囲で、好ましくは16〜128回の範囲で、例えば32〜128回の範囲で、例えばおよそ64回、例えば64回、工程i〜iiiを繰り返すことを含む、項目1〜26のいずれか1つに記載の方法。
28.工程e)は、8〜256回の範囲で、好ましくは16〜128回の範囲で、例えば32〜128回の範囲で、例えばおよそ64回、例えば64回、工程i〜iiiを繰り返すことを含む、項目9及び10〜27のいずれか1つに記載の方法。
29.工程e)の高いアニーリング温度が、プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高い、好ましくは少なくとも15℃高い、例えば少なくとも20℃高い、項目1〜28のいずれか1つに記載の方法。
30.工程f)が、15〜60回の範囲で、好ましくは20〜40回の範囲で、例えば20〜30回の範囲で、例えば25〜30回の範囲で工程I〜IIIを繰り返すことを含む、項目1〜29のいずれか1つに記載の方法。
31.プライマーLが、ミスマッチ改変プライマーLであり、前記方法が、工程e)とf)の間に低い温度のPCRの工程を含有する、項目1〜30のいずれか1つに記載の方法であって、前記低い温度のPCRが以下の工程を含む、前記方法:
I)変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってDNAを一本鎖分子に変性させること、
II)非常に低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHと、プライマーLの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能にさせること、
III)伸長温度でPCRをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること、
IV)任意で、工程I〜IIIを繰り返し、それによってPCR産物を得ること。
32.前記非常に低いアニーリング温度はが、低いアニーリング温度よりも少なくとも5℃低い、項目31に記載の方法。
33.前記非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも少なくとも20℃低い、項目31〜32のいずれか1つに記載の方法。
34.プライマーLが、以下からなるオリゴヌクレオチドである、項目31〜33のいずれか1つに記載の方法:
・1〜10個のヌクレオチドの5’配列、及び
・標的核酸配列の断片と同一、又は相補的な、7〜15個のヌクレオチドの範囲の連続配列。
35.前記区分化PCR反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、多様体検出プローブであり、前記多様体検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも有意に高いアフィニティーで、多様体配列を含有する標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、項目1〜34のいずれか1つに記載の方法。
36.前記区分化PCR反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、野生型検出プローブであり、前記野生型検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、項目1〜35のいずれか1つに記載の方法。
37.各区分化PCR反応物が、多様体検出プローブと野生型検出プローブを含有する、項目35〜36のいずれか1つに記載の方法。
38.前記多様体検出プローブが、フルオロフォアとクエンチャーに連結されており、この場合において前記クエンチャーが、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができ、及び前記フルオロフォアとクエンチャーが、前記プローブの異なるヌクレオチドに連結されている、項目35〜37のいずれか1つに記載の方法。
39.前記野生型検出プローブが、フルオロフォアとクエンチャーに連結されており、この場合において前記クエンチャーが、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができ、及び前記フルオロフォアとクエンチャーが、前記プローブの異なるヌクレオチドに連結されている、項目36〜38のいずれか1つに記載の方法。
40.前記多様体検出プローブが、野生型検出プローブとは異なるフルオロフォアに連結されている、項目37〜39のいずれか1つに記載の方法。
41.工程g)が、多様体検出プローブに連結されたフルオロフォアの蛍光を検出することを含む、項目35〜40のいずれか1つに記載の方法。
42.前記プライマーHが、表3に列挙されるプライマーHからなる群から選択される、項目1〜41のいずれか1つに記載の方法。
43.前記プライマーLが、表3に列挙されるプライマーLからなる群から選択される、項目1〜42のいずれか1つに記載の方法。
44.前記多様体検出プローブが、表3に列挙されるProbe−MUTからなる群から選択される、項目35〜43のいずれか1つに記載の方法。
45.前記野生型検出プローブが、表3に列挙されるProbe−WTからなる群から選択される、項目36〜44のいずれか1つに記載の方法。
46.個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含む、前記方法:
・鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
・項目1〜45のいずれか1つに記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸中の前記多様体配列の存在が、前記臨床状態の存在の指標であること。
47.前記臨床状態が、癌である、項目46に記載の方法。
48.前記変異が、癌に関連した変異である、項目46に記載の方法。
49.前記サンプルが、血液サンプル又はその分画であり、前記鋳型核酸が、セルフリーDNA、ヌクレオソームDNA、及び循環腫瘍DNAからなる群から選択される、項目45〜48のいずれか1つに記載の方法。
50.前記サンプルが、唾液サンプル、尿サンプル、膣液サンプル、腹水サンプル、脳脊髄液サンプル、及び組織滲出液サンプルからなる群から選択される、項目45〜49のいずれか1つに記載の方法。
51.前記変異が、以下からなる群から選択される、項目45〜50のいずれか1つに記載の方法:
A.例えば変異H1047R又は変異E542K又は変異E545Kのうちのいずれか1つなどの、PIK3CAにおける変異、
B.例えばV600EなどのBRAF変異、
C.例えば変異G12D、変異G12V、変異G12C、又は変異G13Dのうちのいずれか1つなどのKRAS変異、及び
D.変異L858R、又は変異T790Mのうちのいずれか1つなどのEGFR変異。
52.前記変異が、表3に列挙される変異からなる群から選択される、項目45〜50のいずれか1つに記載の方法。
53.個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含む、前記方法:
・鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
・項目7〜45のいずれか1つに記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸の存在が、前記臨床状態の存在の指標であること。
54.前記臨床状態が、感染性病原体による感染症である、項目53に記載の方法。
55.前記標的核酸が、前記病原体のゲノム由来の核酸配列である、項目54に記載の方法。
56.以下を含有する部分キット:
・標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、少なくともプライマーHとプライマーLを含有し、前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高く、プライマーLは、プライマーHの伸長産物に対して相補的な配列を含有する、前記プライマーセット、
・標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブであって、前記プローブは、少なくとも1つのフルオロフォアと少なくとも1つのクエンチャーに連結されている、前記検出プローブ、
・核酸ポリメラーゼ
・PCR試薬
・区分化PCR反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。
57.前記プライマーセットが、項目10〜22のいずれか1つに規定されるプライマーセットである、項目56に記載の部分キット。
58.前記プライマーHが、項目10〜22のいずれか1つに規定されるプライマーHである、項目56〜57のいずれか1項に記載の部分キット。
59.前記プライマーLが、項目10〜22のいずれか1つに規定されるプライマーLである、項目56〜58のいずれか1項に記載の部分キット。
60.前記検出プローブが、項目35〜45のいずれか1つに規定されるプローブである、項目56〜59のいずれか1項に記載の部分キット。
61.前記プライマーHが、表3に列挙されるプライマーHからなる群から選択される、項目56〜60のいずれか1項に記載の部分キット。
62.前記プライマーLが、表3に列挙されるプライマーLからなる群から選択される、項目56〜61のいずれか1項に記載の部分キット。
63.前記多様体検出プローブが、表3に列挙されるProbe−MUTからなる群から選択される、項目56〜62のいずれか1つに記載の部分キット。
64.前記野生型検出プローブが、表3に列挙されるProbe−WTからなる群から選択される、項目56〜63のいずれか1つに記載の部分キット。
65.項目56〜60のいずれか1項に記載の部分キットであって、
・前記プライマーHが、配列番号69の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号69の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーHが、配列番号69の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号69の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号69のヌクレオチド3140、1624、又は1633の内の少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
66.前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目65に記載の部分キット:
・配列番号69のヌクレオチド3140のAからGへの変異、
・配列番号69のヌクレオチド1624のGからAへの変異、及び/又は
・配列番号69のヌクレオチド1633のGからAへの変異。
67.
・前記プライマーHが、配列番号70の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号70の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーHが、配列番号70の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号70の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号70のヌクレオチド1799を含有する標的配列を増幅することができる、項目56〜60のいずれか1項に記載の部分キット。
68.前記部分キットが、配列番号70のヌクレオチド1799のTからAへの変異を検出することができるプローブを含有する、項目67に記載の部分キット。
69.
・前記プライマーHが、配列番号71の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号71の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーHが、配列番号71の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号71の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号71のヌクレオチド2573又は2369の内の少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる、項目56〜60のいずれか1項に記載の部分キット。
70.前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目69に記載の部分キット:
・配列番号71のヌクレオチド2573のTからGへの変異、及び/又は
・配列番号71のヌクレオチド2369のCからTへの変異。
71.
・前記プライマーHが、配列番号72の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号72の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーHが、配列番号72の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号72の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号72のヌクレオチド34、35、又は38の内の少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる、項目56〜60のいずれか1項に記載の部分キット。
72.前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目71に記載の部分キット:
・配列番号72のヌクレオチド38のGからAへの変異、
・配列番号72のヌクレオチド34のGからTへの変異、
・配列番号72のヌクレオチド34のGからCへの変異、
・配列番号72のヌクレオチド34のGからAへの変異、
・配列番号72のヌクレオチド35のGからTへの変異、
・配列番号72のヌクレオチド35のGからCへの変異、及び/又は
・配列番号72のヌクレオチド35のGからAへの変異。
73.プライマーHが、50〜100個のヌクレオチドの範囲の前記連続配列からなり、この場合において20個以下、例えば15個以下、例えば10個以下のヌクレオチドが、例えばLNAなどのヌクレオチドアナログで置換され得る、項目65〜73のいずれか1項に記載の部分キット。
74.プライマーHが、前記配列番号の50〜100個のヌクレオチドの範囲、例えば50〜75個のヌクレオチドの範囲の連続配列からなる、項目65〜73のいずれか1項に記載の部分キット。
75.プライマーLが、10〜20個の範囲のヌクレオチドの前記連続配列と、10個以下の追加ヌクレオチドからなる、項目65〜74のいずれか1項に記載の部分キット。
76.前記方法が、項目55〜75のいずれか1項に記載の部分キットを使用して行われる、項目1〜55のいずれか1項に記載の方法。
IBSAFE(前に漸増性、後対称性、忠実性増強(Incremental Before, Symmetric After, Fidelity Enhanced))方法
IBSAFE法は、任意の潜在的なDNAポリメラーゼエラーの結果を信頼可能に減少させる革新的な方法であり、真の陽性反応が、偽陽性反応と比べて優位な一貫したシグナルを有している。
低い温度のPCRの追加工程も使用した点を除き、原則として実施例1に記載されるようにIBSAFE法が行われた。IBSAFE法の本実施例において、プライマーLに対しミスマッチ配列が使用される。これによって、AIPR段階の間、プライマーHとプライマーLの間の融点の効果的な差異にさらなる乖離が生じる。
この結果は、図7Bに示されており、変異特異的シグナルはあるが、偽陽性シグナルは無いことを示している。
Claims (24)
- 以下の工程を含有する、サンプル中の、標的核酸配列の存在の検出方法、又は標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法:
a)鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
b)標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーHとプライマーLを含有しており、前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも16℃高く、前記プライマーLは、プライマーHの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
c)伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
d)区分化PCR反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、及びPCR試薬を含有していること
e)以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応(AIPR)を行うこと:
i.変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
ii.前記一本鎖分子にプライマーHをアニーリングするが、プライマーLをアニーリングしないで、その後プライマーHを伸長すること
iii.それによって、標的核酸配列の1つの鎖のみを増幅させること
f)以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を行うこと:
1)変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによって、DNAを一本鎖分子に変性させること
2)低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHとプライマーLの両方のアニーリングを可能にさせること
3)伸長温度でPCRをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
4)それによって、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、PCR産物を得ること
g)PCR産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。 - 工程e)の工程iiが以下を含有する、請求項1に記載の方法:
高いアニーリング温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、プライマーHはアニーリングできるが、プライマーLはアニーリングできないようにし、
その後前記伸長温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすること、
ここで、前記高いアニーリング温度および前記伸長温度は異なる。 - 工程e)の工程iiが以下を含有する、請求項1に記載の方法:
プライマーHのアニーリングを可能にさせるが、プライマーLのアニーリングは可能にさせず、そしてアニーリングされたプライマーHの伸長を可能にさせる、単一温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートすること、
ここで、プライマーHは前記伸長温度と同じである高いアニーリング温度を有する。 - 工程e)がさらに工程iからiiを繰り返すことを含有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 工程d)の前記区分化PCR反応物がさらに検出試薬を含有する、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- 工程f)がさらに工程1)から3)を繰り返すことを含有する、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも20℃高い、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記多様体配列が、一塩基変異である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プライマーHが、プライマーLの融点よりも少なくとも16℃高い融点を有するプライマーセット中の唯一のプライマーである、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プライマーセットが、異なる標的核酸配列を増幅することができる2つ以上のプライマー対を含有している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- プライマーHが、プライマーHと共に標的核酸配列を増幅させることができるプライマーセット内の他のすべてのプライマーの融点よりも少なくとも16℃高い融点を有している、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、以下のプライマーをいずれも含有しない、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法:
c)プライマーHの融点の±15℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
d)プライマーHと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。 - 工程e)の高いアニーリング温度が、プライマーLの融点よりも少なくとも10℃高い、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 工程e)が、プライマーHの伸長は生じさせるが、他のいずれのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- プライマーLが、ミスマッチ改変プライマーLであり、前記方法が、工程e)とf)の間に低い温度のPCRの工程を含有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法であって、前記低い温度のPCRが以下の工程を含む、前記方法:
1)変性温度で前記区分化PCR反応物をインキュベートし、それによってDNAを一本鎖分子に変性させること、
2)非常に低いアニーリング温度でPCRをインキュベートし、それによって、プライマーHと、プライマーLの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能にさせること、
3)伸長温度でPCRをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること、
4)それによってPCR産物を得ること。 - 工程1)〜3)が繰り返される、請求項15に記載の方法。
- 前記非常に低いアニーリング温度が、低いアニーリング温度よりも少なくとも5℃低い、請求項15または16に記載の方法。
- プライマーLが、以下からなるオリゴヌクレオチドである、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法:
a)1〜10個のヌクレオチドの5’配列、及び
b)標的核酸配列の断片と同一、又は相補的な、7〜15個のヌクレオチドの範囲の連続配列。 - 前記区分化PCR反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、多様体検出プローブであり、前記多様体検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも有意に高いアフィニティーで、多様体配列を含有する標的核酸配列にハイブリダイズすることができるか、及び/又は前記区分化PCR反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、野生型検出プローブであり、前記野生型検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 以下を含有する部分キット:
a)標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも1つのプライマー対を含有するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、少なくともプライマーHとプライマーLとを含有し、前記プライマーHの融点は、前記プライマーLの融点よりも少なくとも16℃高く、プライマーLは、プライマーHの伸長産物に対して相補的な配列を含有する、前記プライマーセット、
b)標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブであって、前記プローブは、少なくとも1つのフルオロフォアと少なくとも1つのクエンチャーとに連結されている、前記検出プローブ、
c)核酸ポリメラーゼ
d)PCR試薬
e)区分化PCR反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。 - 請求項20に記載の部分キットであって、
a)前記プライマーHが、配列番号69の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号69の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
b)前記プライマーHが、配列番号69の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号69の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号69のヌクレオチド3140、1624、又は1633の内の少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。 - 請求項20に記載の部分キットであって、
a)前記プライマーHが、配列番号70の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号70の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
b)前記プライマーHが、配列番号70の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号70の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号70のヌクレオチド1799を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。 - 請求項20に記載の部分キットであって、
a)前記プライマーHが、配列番号71の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号71の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
b)前記プライマーHが、配列番号71の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号71の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、配列番号71のヌクレオチド2573又は2369の内の少なくとも1つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。 - 請求項20に記載の部分キットであって、
a)前記プライマーHが、配列番号72の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号72の相補配列の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
b)前記プライマーHが、配列番号72の相補配列の50〜100個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーLが、配列番号72の10〜20個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーHとプライマーLはともに、少なくとも、配列番号72のヌクレオチド34、35、又は38を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
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