JP2004283141A - 遺伝子診断装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たす構成とした。
【選択図】 図１
【解決手段】本発明は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たす構成とした。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子変異の有無を簡単、正確に検出できる遺伝子診断装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての疾患には、遺伝性要因と環境要因が種々の確率で関与しているが、先天性代謝異常症・癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマー・自己免疫疾患・アトピー・肥満・アルコール依存などの疾患は、遺伝性要因が非常に大きな割合を占めている。一方、環境要素の寄与が大きい疾患は感染症や外傷の後遺症から誘因される疾患等である。
【０００３】
ところで、近年分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素、すなわち遺伝子の関与がかなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。現在、最も注目されているのはＳＮＰｓ（スニップス）と呼ばれるものである。これは、ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、個人間の遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。
【０００４】
人を含め地球上の全ての生命体遺伝子（または遺伝子の全集合体を意味するゲノム）は、共通の４つの塩基から成り立っており、この塩基の配列によって様々なタンパク質が作られ、各生物特有の生命活動が行われている。全ての生物に共通する４つの塩基とは、アデニン（Ａと表記される）、グアニン（Ｇと表記される）、チミン（Ｔと表記される）、シトシン（Ｃと表記される）である。人の遺伝子は、約３０〜３２億塩基配列で構成されているといわれているが、各個人で数百から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で他の人と１つの塩基が異なっている場所が存在する。通常、この１塩基の変化が、あるヒト集団の全人口中１％以上の頻度で存在しているものを、ＳＮＰｓと呼んでいる。
【０００５】
従って、全遺伝子（ゲノム）中には、３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しているといわれ、現在世界中でＳＮＰｓの探索が続けられている。ＳＮＰｓが注目されている理由は、ＳＮＰｓの分類により、統計的に各個人の遺伝子が関与しているといわれている多くの疾患に対する罹患率が推測できると考えられているからである。例えば、乳がんを例にとると、乳がんにかかった患者群と正常な群とのＳＮＰｓの比較により、乳がんにかかりやすい人に共通のＳＮＰｓを特定することができる。そして、健康診断時に、遺伝子を調査しそのＳＮＰｓを持った人、すなわち現在は正常でも将来乳がんにかかりやすい体質の人を見つけることが可能になる。
【０００６】
この診断によって、乳がんにかかりやすい体質の人は、頻繁に検査をすることで万一癌に罹患しても、超早期に治療が行え生存の可能性が向上する。それと同様のことが、糖尿病や高血圧などの生活習慣病についても言え、世界中で多くの人が苦しんでいる病気に対して発病の前から食事や生活指導を正確にすることが可能になる。
【０００７】
また、病気の治療に用いている薬剤に関してもＳＮＰｓは重要な役割を期待されている。治療の際に用いられる薬剤は全ての人に均等に効果を示すものではない。一般に薬剤は、ある割合の人には効果があっても他の人には全く効果が無く、かえって副作用等で逆の結果を招くことがあることも広く知られている。因みに、アメリカにおける死亡原因の中で薬剤による副作用が上位に位置しているのは周知のことである。薬剤の効果はその人がもつ体質に深く関与しており、その体質もＳＮＰｓの分類によって区別可能であると言われている。すなわち、ＳＮＰｓの解析による分類で、ある薬剤に対してあらかじめ効果や感受性が予測でき適正な処方をすることが可能になり、患者個々人の体質に合わせた最適な薬剤の投与や副作用の危険性の回避が期待されている。このような医療のことをテーラーメイド医療またはオーダーメイド医療と呼び、将来の実用化が確実視されている。
【０００８】
また癌は、正常な細胞においては重要な役割をする遺伝子上の特定の部位に例えば紫外線や変異原性物質の作用によって突然変異が生じることによって引き起こされることがわかっている。ある特定の遺伝子上の変異を読み取ることで細胞が癌化しているか否かを早い段階から診断できるようになる。そして、犯罪捜査における犯人の特定や曖昧な親子関係の確定さらには本人であるか否かの識別にもＳＮＰｓは、威力を発揮する。前述したように、各個人には３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しており、両親からそれぞれ別々のＳＮＰｓを引き継ぐため、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓをもつ人間は絶対に存在しないと言われている。これが個人の完全な特定を可能にする理由である。
【０００９】
このように、特定の遺伝子中の１塩基に起きた変異を観察することで医療をはじめ様々の事柄に多大な貢献をもたらす可能性がある。しかしながら現在、特定の遺伝子の変異を観察する方法は以下に述べるような非常に複雑な操作あるいは高価な装置を必要とし、ランニングコストも非常に嵩むため、広く利用されるまでには至っていない状況にある。
【００１０】
現在最も一般的に用いられているＳＮＰｓを調べる方法は、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）と呼ばれている方法である。遺伝子は１種類のタンパク質を形成するための塩基配列情報をもったＤＮＡの単位であるから、塩基配列を端から読んでいけばＳＮＰｓが解明することができる。シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、最も一般的に行われているのは以下に述べるジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。この方法を含めいずれの方法も、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動かキャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別できる技術が基になって成り立っている。
【００１１】
ジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）は、酵素的シーケンシングとも呼ばれ、１本鎖鋳型ＤＮＡの相補的鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを用い、さらに人工的につくった特殊な４種類のジデオキシヌクレオチドを利用するのが特徴である。シーケンシング操作としては、塩基配列を行いたい１本鎖ＤＮＡの３’末端を相補する合成塩基配列をプライマーとして用い、そのプライマーからＤＮＡポリメラーゼと均等に加えられたデオキシヌクレオチドを酵素反応によって伸長させる操作を行うが、この時同時に４つの反応容器を準備しておき、それぞれにＡＴＧＣ４つの塩基の３’末端に水酸基を持たない、従ってこれ以上ＤＮＡ伸長反応を続けることができない塩基アナログであるジデオキシヌクレオチドを別々に少量混入させておく。これにより、伸長中のＤＮＡの末端にジデオキシヌクレオチドが付加された時点でＤＮＡ合成がストップし、それぞれの反応容器中に様々な長さを持った、しかし端は必ず加えた塩基アナログである２本鎖ＤＮＡが形成される。この反応容器にＳ１エンドヌクレアーゼを反応させ、１本鎖ＤＮＡを全て消化し２本鎖ＤＮＡのみとする。こうして得られた４つの反応容器のＤＮＡ鎖をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動し、分離されたＤＮＡを短い方（速く移動したもの）から順に読めば、鋳型鎖と相補的なＤＮＡの塩基配列がわかる。この際、泳動結果の識別は、例えば加えるジデオキシヌクレオチドのリンまたはイオウを放射性標識したり蛍光を発する化学物質を結合させたりして行う。放射性標識の場合はフィルムへの露光での検出、蛍光化学物質の場合はレーザービームを照射し蛍光を検出する。最近では、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種類の塩基アナログを、それぞれ４種類の蛍光波長の異なる試薬により標識し、その４色の蛍光を同時に検出する方法も開発されている。
【００１２】
このように、従来は被験者から分離・精製した遺伝子の正確な塩基配列をこのジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）あるいはその他の塩基配列決定法により決定し、正常あるいは標準的な塩基配列と比較することによってＳＮＰｓの有無や突然変異の有無の確認、個人の識別等を行っている。
【００１３】
以上説明したように、従来からの遺伝子配列決定法を利用した、遺伝子診断や遺伝子による個人の識別は、ターゲットとする遺伝子を単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行っていたため、実験に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要していた。また塩基配列決定のための自動化した装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、しかも高価な試薬を大量に必要とするものであった。
【００１４】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法では比較的小さい。これは、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるためである（例えば、特許文献１参照）。すなわち、キャピラリー管の中の泳動溶液に相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じるので、これに着目して分析を行うものである。
【００１５】
【特許文献１】
特開平７−３１１１９８号公報
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖を使うが、ポリヌクレオチドを成分とするアフィニティリガンドは負電荷を有しているため電圧を印加するとキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため１本鎖をキャピラリー内に固定化する必要があった。この固定化の方法として、ビニル化ＤＮＡをポリアクリルアミドと共重合し、キャピラリー内壁に共有結合的に固定化する方法が提案された。被検体ＤＮＡは固定的オリゴヌクレオチドと強く相互作用し、キャピラリー内に吸着され、ノイズ分は吸着されずに検出されることになる。しかし、この方法はアフィニティリガンドがキャピラリー内壁にしかコーティングできないので、リガンドと試料の相互作用が壁面近傍に限られるという問題があった。そして、測定が難しく、精度が悪くなると言う問題がある。
【００１７】
そこで、従来のこのような問題を解決するため本発明は、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子診断装置は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たされ、電圧を印加することにより、密閉流路内に導入された試料ＤＮＡが電気泳動され、検出部で正常型ＤＮＡ及び／または変異型ＤＮＡの通過を検知する構成としたものである。
【００１９】
これによって、密閉流路の長さも自由に変更することが可能であり、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の発明は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たされ、電圧を印加することにより、密閉流路内に導入された試料ＤＮＡが電気泳動され、検出部で正常型ＤＮＡ及び／または変異型ＤＮＡの通過を検知することを特徴とする遺伝子診断装置であって、ＤＮＡコンジュゲートは、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合したものであり、このＤＮＡは、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとのいずれか一方と相補結合可能であり、他方とは１塩基分結合力が弱い。そして、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡは、それぞれＤＮＡコンジュゲートとの結合力の差が生じ、これは電気泳動の泳動速度の差として現れる。よって、試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離することができる。更に、第１の容器から密閉流路が下方に延設されている、即ち、直線であるので、密閉流路が曲線を描く場合に比べて短くすることができ、泳動時間を短縮できる。また、密閉流路の長さも自由に変更することが可能である。よって、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２１】
請求項２に記載の発明は、請求項１において、密閉流路の温度を制御する温度制御部を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡと、ＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールすることができる。
【００２２】
請求項３に記載の発明は、請求項１，２において、ＤＮＡコンジュゲート溶液を収容する第３の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第３の容器に収容されたＤＮＡコンジュゲート溶液に任意に浸されるように、第２の容器と前記第３の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２３】
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３において、試料ＤＮＡを収容する第４の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第４の容器に収容された試料ＤＮＡに任意に浸されるように、第２の容器と第４の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２４】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４において、密閉流路を洗浄する蒸留水等の洗浄液を収容する第５の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第５の容器に収容された洗浄液に任意に浸されるように、第２の容器と第５の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能であり、密閉流路を洗浄できる。
【００２５】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５において、密閉流路内のＤＮＡコンジュゲート溶液等が排出される第６の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第６の容器に任意に浸されるように、第２の容器と前記第６の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、不要な溶液等を排出することができ、連続して複数の測定を行うことができる。
【００２６】
請求項７に記載の発明は、請求項３〜６において、第２の容器と、第３の容器、或いは、第４の容器、或いは、第５の容器、或いは、第６の容器とは、共に同一トレー上に配置されたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、目的別の容器を複数配置でき、簡単な構成で精度の良い測定ができる。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、請求項３〜６において、第１の容器及び第１の容器から下方に延設された密閉流路を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２８】
請求項９に記載の発明は、請求項１〜８において、第１容器内を負圧にして密閉流路内に試料を注入する吸引手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を所定量注入することが可能である。
【００２９】
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９において、検出部が、少なくとも波長２５４ｎｍの光を発する発光部と、波長２５４ｎｍを含む感度域を持つ受光部で構成されたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、ＤＮＡの吸光領域である２５４ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡの存在を確認することができる。
【００３０】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０において、検出部が、密閉流路内の高分子化合物の吸光領域を含まない波長光を発する発光部を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、波長２００ｎｍ近辺に吸光特性を持つ高分子化合物による影響を受けることもなく、分光器を設けることなく、ＤＮＡの波長２５４ｎｍの吸光度を安価に単純な構成で検出することができる。
【００３１】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１において、ＤＮＡコンジュゲート溶液が、密閉流路内を下方にある第２容器側へ移動することのない程度の高粘度であることを特徴とする遺伝子診断装置であって、測定中に泳動方向とは逆に重力により泳動場が移動することがなく、また電気浸透流も防げ、精度良い測定が可能となる。
【００３２】
請求項１３に記載の発明は、請求項１〜１２において、第１容器に緩衝液および蒸留水等の注入口ならびに排液口を設け、更に第１容器内に水位検出部を設けたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、容器内の緩衝液等を交換する場合に、装置から容器を取り出すことなく中の液を交換できるので、簡便な測定が可能となり、連続的かつ多量の測定に大変有利である。
【００３３】
請求項１４に記載の発明は、請求項１〜１３において、密閉流路をキャピラリー管としたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、効率の良い電気泳動が可能となる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、請求項１４において、キャピラリー管の内壁をアクリルアミドでコーティングしたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、電気浸透流を防止できる。
【００３５】
請求項１６に記載の発明は、請求項１４，１５において、キャピラリー管の外壁はポリイミド等のコーティングがなされていないことを特徴とする遺伝子診断装置であって、安価である。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態における遺伝子診断装置について、図面を参照しながら説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観斜視図である。
【００３８】
図１において、１は遺伝子診断装置本体、２は結果および各種情報を表示する表示部、３は測定開始等を行なう操作部である。
【００３９】
図２は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の内部斜視図である。
【００４０】
図２において、４はＤＮＡサンプル等を収容した容器をセットするためのトレー、５は吸引ポンプ、６は加圧ポンプであり、７はキャピラリーカセット、８はキャピラリー管である。キャピラリーカセット７は、キャピラリー管８や、検出部（２０）等を内部に備えている。更に、９ａは発光部であり、発光部９ａと受光部（９ｂ）とで検出部（２０）を構成する。
【００４１】
図３は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図であり、図２に示すキャピラリーカセット７の内部構成及びその周辺構成を示したものである。
【００４２】
図３において、１０と１１は電極である。本実施の形態１においては、電極１０は正電極（陽極）であり、電極１１は負電極（陰極）となる。更に、１２はファン、１３はヒータ、１４は緩衝液等の注入口、１５は緩衝液トラップ用容器、１６は水位センサ、１７は容器、１８ａ，１８ｂは緩衝液である。なお、電極１０は本発明の第１の電極、電極１１は本発明の第２の電極となる。更に、容器１７は本発明の第１の容器である。
【００４３】
電極１０、水位センサ１６はともに容器１７内の所定の位置に設置されており、更に緩衝液１８ａは測定時には所定の水位まで満たされている。なお、電極１０，１１や水位センサ１６等は、通信や電源供給が行われる接続コードを介して制御装置等に接続されている。この接続コードは、図３において点線で示している。
【００４４】
また、１９はシール材であり、キャピラリー管８は容器１７内へシール材１９を介し数ｃｍ突出した状態になっている。ここで、キャピラリー管８が従来のような曲線を描いた形状ではなく垂直方向（容器１７（第１の容器）から下方）に延設することで、キャピラリー管８の長さを自在に調節することが容易となり、泳動時間を最小限にすることができる。また、キャピラリー管８を湾曲させることがないので、折れ防止のポリイミドコーティング等を行うことがなく安価である。
【００４５】
そして、２０はキャピラリー管８内のＤＮＡの通過を検出する検出部であり、詳細は後述するが、検出部２０は発光部９ａと受光部（９ｂ）とで構成される。
【００４６】
２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄは電磁弁、２２は測定後の廃液を収めるための廃液タンクである。電磁弁２１ａは加圧ポンプ６と容器１７間、電磁弁２１ｂは吸引ポンプ５と容器１７間、電磁弁２１ｃは注入口１４と容器１７間、電磁弁２１ｄは容器１７と廃液タンク２２間の流路にそれぞれ設けられている。
【００４７】
更に、２３は温度センサであり、ヒータ１３を介してファン１２から送風される加温された空気の温度を検出している。
【００４８】
次に、トレー４について説明する。３０は緩衝液１８ｂを収めた容器、３１は蒸留水３１ａを収めた容器、３２は廃液用容器、３３はＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを収めた容器、３４は試料ＤＮＡ３４ａを収めた容器である。そして、容器３０には電極１１が配置される。なお、容器３０は本発明の第２の容器、容器３３は本発明の第３の容器、容器３４は本発明の第４の容器にそれぞれ相当し、容器３１が本発明の第５の容器、廃液用容器３２が本発明の第６の容器である。
【００４９】
また、これらの種々の試料や溶液を収容した容器は、図３においては、１つずつ設けた例で示しているが、それぞれ複数設けてもよいのは言うまでもなく、ここで例示していない試料や溶液、例えば、試薬などを収容する他の容器を設けてもよいのは言うまでもない。特に、試料ＤＮＡ３４ａを収めた容器３４を複数設けることで、同種サンプルの複数回の測定や多種サンプルの測定を行うことが可能となり利便性が向上する。
【００５０】
また、図示はしていないが、トレー４はアクチュエータ等により、図中矢印で示す上下左右の動作が可能となっている。
【００５１】
更に、実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部２０について説明する。図４は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部の装置構成図である。図４において、９ｂは受光部を示し、２４はＵＶランプ等の紫外線照射器、２５はフォトダイオード等の光センサ、２６，２７はスリットであり、２８は集光レンズである。
【００５２】
図４に示すように、発光部９ａは紫外線照射器２４を、受光部９ｂは光センサ２５をそれぞれ備えており、発光部９ａと受光部９ｂとで検出部２０が構成されている。そして、発光部９ａと受光部９ｂとの間に、それぞれスリット２６，２７を介して、キャピラリー管８が配置される。発光部９ａの紫外線照射器２４から発せられた紫外光は集光レンズ２８で集光され、更に、スリット２６を通過して、キャピラリー管８に照射される。この照射光はキャピラリー管８及びスリット２７を通過し、受光部９ｂの光センサ２５に到達する。なお、照射光の光路は、図４において点線で示している。
【００５３】
このように構成された検出部２０のＤＮＡの検出原理は、ＤＮＡのＵＶ吸光特性を利用したものであり、波長２５４ｎｍの吸光度の変化によりＤＮＡの通過を検出することができる。即ち、紫外光が照射される所定位置のキャピラリー管８内におけるＤＮＡの有無が、紫外線照射器２４から照射され、該キャピラリー管８を通過し、光センサ２５で受光される紫外光の強度変化として検出される。
【００５４】
図５は本実施の形態１における遺伝子診断装置の制御ブロック図である。図５において、４０は制御部、４１は駆動部である。制御部４０は操作部３から入力された信号を駆動部４１に出力し、駆動部４１は制御部４０からの指令によりアクチュエータ４２等の各種機器を動作させる。例えば、操作部３の測定開始ボタンを押すことにより、各種機器が動作する等である。
【００５５】
また、４３はＤ／Ａコンバータ、４４はＤ／Ａコンバータ４３からの信号に比例した電圧を発生させ各電極１０，１１に印加する電源部であり、制御部４０によって制御される。
【００５６】
更に、４５はＡ／Ｄコンバータであり温度センサ２０、光センサ２５等の信号を増幅部４６により増幅した値を入力しデジタル変換して制御部４０へ出力する。制御部４０はこれらの信号から駆動部４１に制御信号を出力する。例えば、温度センサ２０から出力された信号に基づき、ファン１２やヒータ１３に制御信号を送り、温度調整を行う等の制御が行われる。更に、表示部２の表示制御を行い種々の情報が表示部２で表示される。
【００５７】
ここで、電気泳動の基本原理を簡単に説明すると、ＤＮＡは負に帯電しており周囲に電界を発生させると陽極側へ移動しようとする。この時ポリアクリルアミドやアガロース等のゲル中にＤＮＡが存在した場合、ゲルとＤＮＡの抵抗関係により塩基長の短い（分子量の小さい）ものから移動をはじめる。同じ塩基長であれば同じ速度で移動し、異なる長さであれば移動速度が異なるため徐々に分離していく。最終的に各塩基長毎にバンドを形成するものである。
【００５８】
次に、ＤＮＡの結合について説明すると、ＤＮＡはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ４種の塩基配列からなり、通常二本鎖を形成する。またＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合し易い性質があるため二本鎖においてはＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。従って、一方の鎖が５’−ＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ−３’（配列番号１に記載）という配列の場合、もう一方の鎖は、３’−ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ−５’（配列番号２に記載）という塩基配列になる。この関係は相補的関係と呼ばれるもので、この相補関係が１塩基でも崩れた場合、極端に結合力が低下し、二本鎖が形成しづらくなる。またＤＮＡの結合力は温度にも依存する。ＤＮＡは高温（摂氏９４度）にすると二本の鎖がほどけて一本ずつばらばらになり、徐々に温度を下げると元通りの二本鎖に復元する性質がある。つまり、温度を制御することにより結合力を調整することができる。なお、本実施の形態１における遺伝子診断装置では、ヒータ１３、温度センサ２０等で温度制御が行われる。
【００５９】
本発明における遺伝子診断装置は、上述した原理を応用したものである。
【００６０】
次に、本遺伝子診断装置で測定する試料ＤＮＡについて説明する。本実施の形態１においては人の細胞や血液等から抽出し、目的の部位を増幅させ一本鎖にしたＤＮＡを試料とし、１２〜１００塩基長を想定している。
【００６１】
試料ＤＮＡの塩基数は、その他の範囲でも温度や各種試料濃度などの変更により分離解析は可能であるが、それら各種条件を最適化する作業が必要となる。また約３０億塩基対あるといわれるヒトのＤＮＡから目的の部位を取り出すには、特定部位のみを増幅させるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法や特定配列を持つ部位を切断する制限酵素法、アガロースゲル電気泳動などを利用して行なう。ただ、このＰＣＲ法、制限酵素法に関しては本遺伝子診断装置の説明に必要がないため具体的な説明は省略する。
【００６２】
本発明者らの実験によると、本遺伝子診断装置で正常型ＤＮＡと１塩基違いの変異型ＤＮＡを分離する場合、塩基の数は１２塩基程度が最も効率よく分離できるという結果を得ている。ただ、約３０億塩基から特定の１２塩基部を取り出す場合、上述した抽出増幅等の前処理工程において工数が増えるので６０塩基程度が最も適当であろう。
【００６３】
また、キャピラリー管８について更に詳しく説明すると、通常のキャピラリー管にポリアクリルアミド等を入れて両端に電圧を印加すると、電気浸透流と呼ばれる液の流れが発生してしまう。本遺伝子診断装置ではこの現象が起きないように、キャピラリー管８の内壁をアクリルアミドなどでコーティングしたものを使用する。コーティング剤は、電気浸透流の発生が阻止でき、試料ＤＮＡに影響を及ぼさないものであるなら他でもよい。なお、キャピラリー管８としては内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管が、紫外線を９０％以上透過でき、且つ紫外線を利用してＤＮＡを検出するとき、紫外線の通過量を容易に検出できるから最も適当である。
【００６４】
次に、容器１７，３０中に収容される緩衝液１８ａ，１８ｂについて説明する。通常はＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．２〜ｐＨ８程度）等を利用するのが適当である。Ｔｒｉｓを滅菌水で薄め、ホウ酸を徐々に加えながら目的のｐＨ値にしたものである。緩衝液１８ａと１８ｂに混入させる電解質としては、塩化マグネシウム等がある。また塩化マグネシウムはＤＮＡの２本鎖を強く結合させる効果をもっており、濃度により試料ＤＮＡの結合力制御を可能とするものである。また塩化マグネシウムとは逆に尿素など結合力を弱める物質等も知られており、それらＤＮＡ結合制御材の種類や混合比を選択することで試料ＤＮＡの多様な結合力制御が可能となる。本実施の形態１における緩衝液はＴｒｉｓ：５ｍＭ、ＭｇＣｌ２：０．２５ｍＭ、ｐＨ：７．４に調製されている。
【００６５】
次に、容器３３内に収容されているＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａについて説明する。
【００６６】
ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、後述する電気泳動中に正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡを分離しながら泳動させるための溶液であり、ゲル状態である。
【００６７】
ところで、本発明のＤＮＡコンジュゲートは、１本鎖ＤＮＡの５’末端にビニル基を導入したビニル化ＤＮＡを合成し、これとリニアポリマー溶液とのラジカル共重合によって作製したものである。従って、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、ＤＮＡコンジュゲートとリニアポリマー溶液の混合した溶液がＤＮＡ結合制御剤を添加した緩衝液に混合されたものである。
【００６８】
一例を挙げてＤＮＡコンジュゲートの作成方法を具体的に説明すると、ＤＮＡコンジュゲートの濃度を一定にするため、合成されたアミノ化ＤＮＡの吸光度を測定し、２．６ｍＭになるように希釈する。次にこの濃度でアミノ化ＤＮＡの量を例えば４００ｎモル（２．６ｍＭの溶液で１５３．８μＬ）と決定し、まずメタクリロイルオキシスクシンイミド（ＭＯＳＵ）０．０１５３ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１１７０μＬに溶解し、７１．３８８ｍＭの溶液として、この内２０μモルに相当する２８０μＬを、アミノ化ＤＮＡ１５３．８μＬとアミノ化ＤＮＡと同量の炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムからなるｐＨ調整液（ｐＨ９）１５３．８μＬとに混合する。
【００６９】
その後、一晩振とうし、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で未反応のＤＮＡを分離し、減圧遠心分離器でＨＰＬＣの溶離液を減圧乾燥し、濃度が０．５ｍＭになるように純水で希釈して溶液とする。生成されたビニル化ＤＮＡ溶液２５．８μＬ（アクリルアミドとのモル比０．０２５モル％）を超純水３０．２μＬで希釈して（ポリ）アクリルアミド１０％溶液３４μＬを加え、重合開始剤１．３４％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＤ）５μＬと１．３４％アンモニウムパーサルファイト（ＡＰＳ）５μＬを添加して目的のＤＮＡコンジュゲートとポリアクリルアミドの混合溶液が得られる。これをＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液とＤＮＡ結合制御剤とを添加した溶液に混合してＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａとする。なお、粘度に関しては、キャピラリー管８内に充填した時、自重により容易に落下しない程度にＴＥＭＤとＡＰＳの量や重合時の温度を変化させることでポリアクリルアミドの重合度を調整する。
【００７０】
次に、本実施の形態１における遺伝子診断装置の動作について図３等を用い説明する。
【００７１】
図３に示すように、緩衝液１８ｂを収容した容器３０、蒸留水３１ａを収容した容器３１、廃液用容器３２、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを収容した容器３３、試料ＤＮＡ３４ａを収容した容器３４をそれぞれ予めサンプルトレー４上にセットしておく。
【００７２】
そして、はじめに行なう容器１７内へ緩衝液１８ａを注入する方法を説明すると、先ず、電磁弁２１ｃと２１ｄを開き容器１７内に残る廃液を一旦廃液タンク２２へ注ぐ。必要に応じて、注入口１４より蒸留水等を注入し容器１７内を洗浄する。
【００７３】
洗浄が終わり容器１７内の液が廃液タンク２２へ全て排出されると、電磁弁２１ｄを閉じ、緩衝液を注入口１４より容器１７内へ注ぐ。ここで、水位センサ１６により容器１７内の緩衝液１８ａの量を検知し、所定の液面まで達すると電磁弁２１ｃを閉じ容器１７内への緩衝液の流入を停止する。これで容器１７内へ緩衝液１８ａが所定量満たされた状態となる。
【００７４】
次に、測定中におけるキャピラリー管８の温度制御について説明する。
【００７５】
ファン１２の排気側にヒータ１３が設けられているため、キャピラリー管８には加温された空気が送られる。更に、排気側には温度センサ２０が設置されておりその温度を測定しながらヒータ１３の電源を制御する。このようにキャピラリー管８の周囲の雰囲気温度を制御することでキャピラリー管８内を所定の温度に制御することが可能となる。
【００７６】
次に、キャピラリー管８内へＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを注入するが、その詳細について説明する。図６は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の動作説明図である。
【００７７】
まず、トレー４をアクチュエータにより移動させ、図６（ａ）に示すようにキャピラリー管８先端が容器３３のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａに浸された状態にする。
【００７８】
更に、図３で示す、電磁弁２１ａ〜２１ｄ全てを閉じ、吸引ポンプ５を動作させる。これにより密閉された容器１７内およびキャピラリー管８内が負圧となるためＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａがキャピラリー管８内へ吸引される。一定時間経過後、電磁弁２１ｂを開き、吸引ポンプ５を停止することでキャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持されることになる。この時、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、ある程度の粘度があるため、キャピラリー管８内を降下し外部へ出ることはなく保持される。
【００７９】
次に、キャピラリー管８内に保持されたＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの精製を行なう。ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａ中にはアクリルアミドと結合していないＤＮＡ等の不純物が存在する場合があり、測定精度に影響を与えることも考えられるので取り除くのが望ましい。本実施の形態１における精製方法は、電気泳動により取り除く方法であり、その詳細を説明する。
【００８０】
まずキャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持された状態で、図６（ｂ）で示すようにキャピラリー管８の先端が容器３０中の緩衝液１８ｂに浸された状態にする。
【００８１】
次に、図３で示す、電極１１に対して電極１０に正電圧を印加する。ＤＮＡは負に帯電しているため正極側の電極１０へ移動する。よってキャピラリー管８内に存在するポリアクリルアミドと未結合のＤＮＡはすべて容器１７内の緩衝液１８ａへ溶出することになる。また、キャピラリー管８で精製が完了したＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａにおいて、ポリアクリルアミドと結合しているＤＮＡ（ＤＮＡコンジュゲート）は、ポリアクリルアミドポリマーが碇の役目をして極端に泳動速度が遅いのでキャピラリー管８で擬似的に固定された状態となる。以上がＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの精製である。なお、緩衝液１８ａへ溶出した未結合のＤＮＡは、緩衝液の量に対して非常に微量であるため、緩衝液１８ａのｐｈを変化させることもなく、仮に逆流が生じた場合等にも、測定へ影響を及ぼすことはない。
【００８２】
次に、図６（ｃ）に示すように、試料ＤＮＡ３４ａをキャピラリー管８内へ定量注入する。注入方法の基本方式は、上述したＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを注入する方法と同様であり、吸引ポンプ５によりキャピラリー管８内へ試料ＤＮＡ３４ａを注入する。そして、吸引ポンプ５の動作時間により注入量が制御される。即ち、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持されたキャピラリー管８の下方末端、所定の電気泳動開始位置に試料ＤＮＡ３４ａを配置する必要がある。本実施の形態１では、例えば、吸引ポンプ５の動作時間を２秒とする。動作時間と量に関しては、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの粘度やキャピラリー管８の長さ、内径などにより変化するものであり、これらの条件を変更した場合は、吸引ポンプ５の動作時間を変更する。
【００８３】
次に、試料ＤＮＡ３４ａを電気泳動分離し、検出判別する。キャピラリー管８末端に試料ＤＮＡ３４ａが注入された状態で、図６（ｂ）に示すように緩衝液１８ｂにキャピラリー管８末端が浸された状態にする。
【００８４】
そして、精製時と同様に電極１０，１１間に電圧を印加し、検出部２０側へ試料ＤＮＡ３４ａを泳動させる。
【００８５】
本実施の形態１における検出部２０は、上述のように、ＤＮＡのＵＶ吸光特性を利用したもので、発光部９ａと受光部９ｂで構成されており、波長２５４ｎｍの吸光度の変化によりＤＮＡの通過を検出することができる。発光部９ａに用いる紫外線照射器２４は殺菌灯などの波長２５４ｎｍを中心に照射するものや、幅広い波長範囲を照射するＤ２ランプ等にフィルターを設けたものでもよい。このように発光部９ａで波長を制限することで、受光部９ｂ側に分光装置を用いることなくＤＮＡの吸収波長である２５４ｎｍ近辺の吸光度を他の泳動液の吸光特性に影響されることなく測定することができる。
【００８６】
泳動したＤＮＡは、検出部２０で通過を検出され、図７のような波形を得ることができる。なお、図７は本発明の実施の形態１における経過時間と吸光度の関係を示すグラフである。図７の波形は、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡが混合したサンプルであり、縦軸が吸光度（ａｂｓ（２５４ｎｍ））、横軸が時間（分）である。これは、ＤＮＡコンジュゲートには、正常型ＤＮＡと相補的関係にあるＤＮＡが結合しており、このＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡに対し、変異型ＤＮＡは正常型ＤＮＡに比べて１塩基分結合力が弱い。正常型ＤＮＡは、擬似的に固定されているＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため通常の泳動速度に対して減速する。以上の理由からサンプル中に両型のＤＮＡが存在する場合、図７のように２山の波形が得られる。時間的に最初の山が変異型ＤＮＡであり、遅れて出現した山が正常型ＤＮＡである。また、正常型のＤＮＡのみ存在する場合、もしくは、変異型のＤＮＡのみ存在する場合は１山の波形となる。このようにして試料ＤＮＡ３４ａの判別を行なうことが可能となる。なお、場合によっては、ＤＮＡコンジュゲートに、変異型ＤＮＡと相補的関係にあるＤＮＡを結合させてもよく、この場合は、上述した説明は正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとで逆になる。
【００８７】
次に、測定後の洗浄動作について説明する。連続して測定を行なう場合、キャピラリー管８内に保持されているＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを入れ換える必要がある。同種のＤＮＡサンプルを測定する場合でも、新たに入れ換えることで精度よく測定することができる。そこで、まずキャピラリー管８内のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを外部へ吐き出す。
【００８８】
図６（ｄ）に示すようにキャピラリー管８の先端が廃液用容器３２で覆われた状態にする。そして、図３で示す、電磁弁２１ａ〜２１ｄすべてを閉じ加圧ポンプ６を動作させる。すると容器１７内が加圧され緩衝液１８ａがキャピラリー管８を通り外部へ噴出しようとするので、キャピラリー管８内のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを緩衝液１８ａが押し出し廃液用容器３２へ噴出する。キャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが無くなると加圧ポンプ６を停止し、電磁弁２１ａを開く。
【００８９】
容器１７内が大気圧に戻ったところで電磁弁２１ａを再度閉じ、図６（ｅ）に示すようにキャピラリー管８の先端が容器３１内の蒸留水３１ａに浸るように配置する。そこで、吸引ポンプ５を動作させると蒸留水３１ａはキャピラリー管８内を通り容器１７内へと移動する。これが蒸留水洗浄である。ちなみに本実施の形態１では、蒸留水洗浄を５分間行なう。同様に、緩衝液１８ｂを用いて洗浄を５分間行なうことでキャピラリー管８の洗浄動作終了となる。なお、本実施の形態１では、蒸留水３１ａを用いたが洗浄が可能であれば、測定に影響を与えない範囲で他の液体を用いることもできる。
【００９０】
以上、実施の形態１における遺伝子診断装置について説明したが、その趣旨を逸脱しない範囲で種々な変更が可能である。
【００９１】
本実施の形態１において、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａや試料ＤＮＡ３４ａ等をキャピラリー管８に導入する際にトレー４を移動させたが、トレー４を固定して、キャピラリー管８を備えるキャピラリーカセット７やその周辺機器を移動させてもよい。
【００９２】
更に、試料ＤＮＡ３４ａをキャピラリー管８に導入する際に、吸引ポンプ５によって試料ＤＮＡ３４ａを吸い上げたが、ＤＮＡは負に帯電しているので、電源１０，１１に電圧を印加して泳動させてキャピラリー管８に導入してもよい。
【００９３】
【発明の効果】
本発明によれば、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することができる。
【００９４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観斜視図
【図２】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の内部斜視図
【図３】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図
【図４】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部の装置構成図
【図５】本実施の形態１における遺伝子診断装置の制御ブロック図
【図６】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の動作説明図
【図７】本発明の実施の形態１における経過時間と吸光度の関係を示すグラフ
【符号の説明】
１ 遺伝子診断装置本体
２ 表示部
３ 操作部
４ トレー
５ 吸引ポンプ
６ 加圧ポンプ
７ キャピラリーカセット
８ キャピラリー管
９ａ 発光部
９ｂ 受光部
１０，１１ 電極
１２ ファン
１３ ヒータ
１４ 注入口
１５ 緩衝液トラップ用容器
１６ 水位センサ
１７ 容器
１８ａ，１８ｂ 緩衝液
１９ シール材
２０ 検出部
２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ 電磁弁
２２ 廃液タンク
２３ 温度センサ
２４ 紫外線照射器
２５ 光センサ
２６，２７ スリット
２８ 集光レンズ
３０，３１，３３，３４ 容器
３１ａ 蒸留水
３２ 廃液用容器
３３ａ ＤＮＡコンジュゲート溶液
３４ａ 試料ＤＮＡ
４０ 制御部
４１ 駆動部
４２ アクチュエータ４２
４３ Ｄ／Ａコンバータ
４４ 電源部
４５ Ａ／Ｄコンバータ
４６ 増幅部
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子変異の有無を簡単、正確に検出できる遺伝子診断装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての疾患には、遺伝性要因と環境要因が種々の確率で関与しているが、先天性代謝異常症・癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマー・自己免疫疾患・アトピー・肥満・アルコール依存などの疾患は、遺伝性要因が非常に大きな割合を占めている。一方、環境要素の寄与が大きい疾患は感染症や外傷の後遺症から誘因される疾患等である。
【０００３】
ところで、近年分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素、すなわち遺伝子の関与がかなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。現在、最も注目されているのはＳＮＰｓ（スニップス）と呼ばれるものである。これは、ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、個人間の遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。
【０００４】
人を含め地球上の全ての生命体遺伝子（または遺伝子の全集合体を意味するゲノム）は、共通の４つの塩基から成り立っており、この塩基の配列によって様々なタンパク質が作られ、各生物特有の生命活動が行われている。全ての生物に共通する４つの塩基とは、アデニン（Ａと表記される）、グアニン（Ｇと表記される）、チミン（Ｔと表記される）、シトシン（Ｃと表記される）である。人の遺伝子は、約３０〜３２億塩基配列で構成されているといわれているが、各個人で数百から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で他の人と１つの塩基が異なっている場所が存在する。通常、この１塩基の変化が、あるヒト集団の全人口中１％以上の頻度で存在しているものを、ＳＮＰｓと呼んでいる。
【０００５】
従って、全遺伝子（ゲノム）中には、３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しているといわれ、現在世界中でＳＮＰｓの探索が続けられている。ＳＮＰｓが注目されている理由は、ＳＮＰｓの分類により、統計的に各個人の遺伝子が関与しているといわれている多くの疾患に対する罹患率が推測できると考えられているからである。例えば、乳がんを例にとると、乳がんにかかった患者群と正常な群とのＳＮＰｓの比較により、乳がんにかかりやすい人に共通のＳＮＰｓを特定することができる。そして、健康診断時に、遺伝子を調査しそのＳＮＰｓを持った人、すなわち現在は正常でも将来乳がんにかかりやすい体質の人を見つけることが可能になる。
【０００６】
この診断によって、乳がんにかかりやすい体質の人は、頻繁に検査をすることで万一癌に罹患しても、超早期に治療が行え生存の可能性が向上する。それと同様のことが、糖尿病や高血圧などの生活習慣病についても言え、世界中で多くの人が苦しんでいる病気に対して発病の前から食事や生活指導を正確にすることが可能になる。
【０００７】
また、病気の治療に用いている薬剤に関してもＳＮＰｓは重要な役割を期待されている。治療の際に用いられる薬剤は全ての人に均等に効果を示すものではない。一般に薬剤は、ある割合の人には効果があっても他の人には全く効果が無く、かえって副作用等で逆の結果を招くことがあることも広く知られている。因みに、アメリカにおける死亡原因の中で薬剤による副作用が上位に位置しているのは周知のことである。薬剤の効果はその人がもつ体質に深く関与しており、その体質もＳＮＰｓの分類によって区別可能であると言われている。すなわち、ＳＮＰｓの解析による分類で、ある薬剤に対してあらかじめ効果や感受性が予測でき適正な処方をすることが可能になり、患者個々人の体質に合わせた最適な薬剤の投与や副作用の危険性の回避が期待されている。このような医療のことをテーラーメイド医療またはオーダーメイド医療と呼び、将来の実用化が確実視されている。
【０００８】
また癌は、正常な細胞においては重要な役割をする遺伝子上の特定の部位に例えば紫外線や変異原性物質の作用によって突然変異が生じることによって引き起こされることがわかっている。ある特定の遺伝子上の変異を読み取ることで細胞が癌化しているか否かを早い段階から診断できるようになる。そして、犯罪捜査における犯人の特定や曖昧な親子関係の確定さらには本人であるか否かの識別にもＳＮＰｓは、威力を発揮する。前述したように、各個人には３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しており、両親からそれぞれ別々のＳＮＰｓを引き継ぐため、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓをもつ人間は絶対に存在しないと言われている。これが個人の完全な特定を可能にする理由である。
【０００９】
このように、特定の遺伝子中の１塩基に起きた変異を観察することで医療をはじめ様々の事柄に多大な貢献をもたらす可能性がある。しかしながら現在、特定の遺伝子の変異を観察する方法は以下に述べるような非常に複雑な操作あるいは高価な装置を必要とし、ランニングコストも非常に嵩むため、広く利用されるまでには至っていない状況にある。
【００１０】
現在最も一般的に用いられているＳＮＰｓを調べる方法は、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）と呼ばれている方法である。遺伝子は１種類のタンパク質を形成するための塩基配列情報をもったＤＮＡの単位であるから、塩基配列を端から読んでいけばＳＮＰｓが解明することができる。シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、最も一般的に行われているのは以下に述べるジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。この方法を含めいずれの方法も、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動かキャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別できる技術が基になって成り立っている。
【００１１】
ジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）は、酵素的シーケンシングとも呼ばれ、１本鎖鋳型ＤＮＡの相補的鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを用い、さらに人工的につくった特殊な４種類のジデオキシヌクレオチドを利用するのが特徴である。シーケンシング操作としては、塩基配列を行いたい１本鎖ＤＮＡの３’末端を相補する合成塩基配列をプライマーとして用い、そのプライマーからＤＮＡポリメラーゼと均等に加えられたデオキシヌクレオチドを酵素反応によって伸長させる操作を行うが、この時同時に４つの反応容器を準備しておき、それぞれにＡＴＧＣ４つの塩基の３’末端に水酸基を持たない、従ってこれ以上ＤＮＡ伸長反応を続けることができない塩基アナログであるジデオキシヌクレオチドを別々に少量混入させておく。これにより、伸長中のＤＮＡの末端にジデオキシヌクレオチドが付加された時点でＤＮＡ合成がストップし、それぞれの反応容器中に様々な長さを持った、しかし端は必ず加えた塩基アナログである２本鎖ＤＮＡが形成される。この反応容器にＳ１エンドヌクレアーゼを反応させ、１本鎖ＤＮＡを全て消化し２本鎖ＤＮＡのみとする。こうして得られた４つの反応容器のＤＮＡ鎖をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動し、分離されたＤＮＡを短い方（速く移動したもの）から順に読めば、鋳型鎖と相補的なＤＮＡの塩基配列がわかる。この際、泳動結果の識別は、例えば加えるジデオキシヌクレオチドのリンまたはイオウを放射性標識したり蛍光を発する化学物質を結合させたりして行う。放射性標識の場合はフィルムへの露光での検出、蛍光化学物質の場合はレーザービームを照射し蛍光を検出する。最近では、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種類の塩基アナログを、それぞれ４種類の蛍光波長の異なる試薬により標識し、その４色の蛍光を同時に検出する方法も開発されている。
【００１２】
このように、従来は被験者から分離・精製した遺伝子の正確な塩基配列をこのジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）あるいはその他の塩基配列決定法により決定し、正常あるいは標準的な塩基配列と比較することによってＳＮＰｓの有無や突然変異の有無の確認、個人の識別等を行っている。
【００１３】
以上説明したように、従来からの遺伝子配列決定法を利用した、遺伝子診断や遺伝子による個人の識別は、ターゲットとする遺伝子を単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行っていたため、実験に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要していた。また塩基配列決定のための自動化した装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、しかも高価な試薬を大量に必要とするものであった。
【００１４】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法では比較的小さい。これは、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるためである（例えば、特許文献１参照）。すなわち、キャピラリー管の中の泳動溶液に相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じるので、これに着目して分析を行うものである。
【００１５】
【特許文献１】
特開平７−３１１１９８号公報
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖を使うが、ポリヌクレオチドを成分とするアフィニティリガンドは負電荷を有しているため電圧を印加するとキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため１本鎖をキャピラリー内に固定化する必要があった。この固定化の方法として、ビニル化ＤＮＡをポリアクリルアミドと共重合し、キャピラリー内壁に共有結合的に固定化する方法が提案された。被検体ＤＮＡは固定的オリゴヌクレオチドと強く相互作用し、キャピラリー内に吸着され、ノイズ分は吸着されずに検出されることになる。しかし、この方法はアフィニティリガンドがキャピラリー内壁にしかコーティングできないので、リガンドと試料の相互作用が壁面近傍に限られるという問題があった。そして、測定が難しく、精度が悪くなると言う問題がある。
【００１７】
そこで、従来のこのような問題を解決するため本発明は、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子診断装置は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たされ、電圧を印加することにより、密閉流路内に導入された試料ＤＮＡが電気泳動され、検出部で正常型ＤＮＡ及び／または変異型ＤＮＡの通過を検知する構成としたものである。
【００１９】
これによって、密閉流路の長さも自由に変更することが可能であり、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の発明は、緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、第１の容器から下方に延設され、第１の容器と第２の容器間を連絡する密閉流路と、密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たされ、電圧を印加することにより、密閉流路内に導入された試料ＤＮＡが電気泳動され、検出部で正常型ＤＮＡ及び／または変異型ＤＮＡの通過を検知することを特徴とする遺伝子診断装置であって、ＤＮＡコンジュゲートは、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合したものであり、このＤＮＡは、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとのいずれか一方と相補結合可能であり、他方とは１塩基分結合力が弱い。そして、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡは、それぞれＤＮＡコンジュゲートとの結合力の差が生じ、これは電気泳動の泳動速度の差として現れる。よって、試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離することができる。更に、第１の容器から密閉流路が下方に延設されている、即ち、直線であるので、密閉流路が曲線を描く場合に比べて短くすることができ、泳動時間を短縮できる。また、密閉流路の長さも自由に変更することが可能である。よって、一塩基以上の遺伝子変異を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２１】
請求項２に記載の発明は、請求項１において、密閉流路の温度を制御する温度制御部を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡと、ＤＮＡコンジュゲートとの結合力をコントロールすることができる。
【００２２】
請求項３に記載の発明は、請求項１，２において、ＤＮＡコンジュゲート溶液を収容する第３の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第３の容器に収容されたＤＮＡコンジュゲート溶液に任意に浸されるように、第２の容器と前記第３の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２３】
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３において、試料ＤＮＡを収容する第４の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第４の容器に収容された試料ＤＮＡに任意に浸されるように、第２の容器と第４の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２４】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４において、密閉流路を洗浄する蒸留水等の洗浄液を収容する第５の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第５の容器に収容された洗浄液に任意に浸されるように、第２の容器と第５の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能であり、密閉流路を洗浄できる。
【００２５】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５において、密閉流路内のＤＮＡコンジュゲート溶液等が排出される第６の容器を設け、密閉流路先端が、第２の容器に収容された緩衝液、または、第６の容器に任意に浸されるように、第２の容器と前記第６の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、不要な溶液等を排出することができ、連続して複数の測定を行うことができる。
【００２６】
請求項７に記載の発明は、請求項３〜６において、第２の容器と、第３の容器、或いは、第４の容器、或いは、第５の容器、或いは、第６の容器とは、共に同一トレー上に配置されたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、目的別の容器を複数配置でき、簡単な構成で精度の良い測定ができる。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、請求項３〜６において、第１の容器及び第１の容器から下方に延設された密閉流路を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を注入することが可能である。
【００２８】
請求項９に記載の発明は、請求項１〜８において、第１容器内を負圧にして密閉流路内に試料を注入する吸引手段を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、密閉流路内へ目的の物質を所定量注入することが可能である。
【００２９】
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９において、検出部が、少なくとも波長２５４ｎｍの光を発する発光部と、波長２５４ｎｍを含む感度域を持つ受光部で構成されたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、ＤＮＡの吸光領域である２５４ｎｍの吸光度を測定することにより、ＤＮＡの存在を確認することができる。
【００３０】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０において、検出部が、密閉流路内の高分子化合物の吸光領域を含まない波長光を発する発光部を備えたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、波長２００ｎｍ近辺に吸光特性を持つ高分子化合物による影響を受けることもなく、分光器を設けることなく、ＤＮＡの波長２５４ｎｍの吸光度を安価に単純な構成で検出することができる。
【００３１】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１において、ＤＮＡコンジュゲート溶液が、密閉流路内を下方にある第２容器側へ移動することのない程度の高粘度であることを特徴とする遺伝子診断装置であって、測定中に泳動方向とは逆に重力により泳動場が移動することがなく、また電気浸透流も防げ、精度良い測定が可能となる。
【００３２】
請求項１３に記載の発明は、請求項１〜１２において、第１容器に緩衝液および蒸留水等の注入口ならびに排液口を設け、更に第１容器内に水位検出部を設けたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、容器内の緩衝液等を交換する場合に、装置から容器を取り出すことなく中の液を交換できるので、簡便な測定が可能となり、連続的かつ多量の測定に大変有利である。
【００３３】
請求項１４に記載の発明は、請求項１〜１３において、密閉流路をキャピラリー管としたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、効率の良い電気泳動が可能となる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、請求項１４において、キャピラリー管の内壁をアクリルアミドでコーティングしたことを特徴とする遺伝子診断装置であって、電気浸透流を防止できる。
【００３５】
請求項１６に記載の発明は、請求項１４，１５において、キャピラリー管の外壁はポリイミド等のコーティングがなされていないことを特徴とする遺伝子診断装置であって、安価である。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態における遺伝子診断装置について、図面を参照しながら説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観斜視図である。
【００３８】
図１において、１は遺伝子診断装置本体、２は結果および各種情報を表示する表示部、３は測定開始等を行なう操作部である。
【００３９】
図２は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の内部斜視図である。
【００４０】
図２において、４はＤＮＡサンプル等を収容した容器をセットするためのトレー、５は吸引ポンプ、６は加圧ポンプであり、７はキャピラリーカセット、８はキャピラリー管である。キャピラリーカセット７は、キャピラリー管８や、検出部（２０）等を内部に備えている。更に、９ａは発光部であり、発光部９ａと受光部（９ｂ）とで検出部（２０）を構成する。
【００４１】
図３は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図であり、図２に示すキャピラリーカセット７の内部構成及びその周辺構成を示したものである。
【００４２】
図３において、１０と１１は電極である。本実施の形態１においては、電極１０は正電極（陽極）であり、電極１１は負電極（陰極）となる。更に、１２はファン、１３はヒータ、１４は緩衝液等の注入口、１５は緩衝液トラップ用容器、１６は水位センサ、１７は容器、１８ａ，１８ｂは緩衝液である。なお、電極１０は本発明の第１の電極、電極１１は本発明の第２の電極となる。更に、容器１７は本発明の第１の容器である。
【００４３】
電極１０、水位センサ１６はともに容器１７内の所定の位置に設置されており、更に緩衝液１８ａは測定時には所定の水位まで満たされている。なお、電極１０，１１や水位センサ１６等は、通信や電源供給が行われる接続コードを介して制御装置等に接続されている。この接続コードは、図３において点線で示している。
【００４４】
また、１９はシール材であり、キャピラリー管８は容器１７内へシール材１９を介し数ｃｍ突出した状態になっている。ここで、キャピラリー管８が従来のような曲線を描いた形状ではなく垂直方向（容器１７（第１の容器）から下方）に延設することで、キャピラリー管８の長さを自在に調節することが容易となり、泳動時間を最小限にすることができる。また、キャピラリー管８を湾曲させることがないので、折れ防止のポリイミドコーティング等を行うことがなく安価である。
【００４５】
そして、２０はキャピラリー管８内のＤＮＡの通過を検出する検出部であり、詳細は後述するが、検出部２０は発光部９ａと受光部（９ｂ）とで構成される。
【００４６】
２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄは電磁弁、２２は測定後の廃液を収めるための廃液タンクである。電磁弁２１ａは加圧ポンプ６と容器１７間、電磁弁２１ｂは吸引ポンプ５と容器１７間、電磁弁２１ｃは注入口１４と容器１７間、電磁弁２１ｄは容器１７と廃液タンク２２間の流路にそれぞれ設けられている。
【００４７】
更に、２３は温度センサであり、ヒータ１３を介してファン１２から送風される加温された空気の温度を検出している。
【００４８】
次に、トレー４について説明する。３０は緩衝液１８ｂを収めた容器、３１は蒸留水３１ａを収めた容器、３２は廃液用容器、３３はＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを収めた容器、３４は試料ＤＮＡ３４ａを収めた容器である。そして、容器３０には電極１１が配置される。なお、容器３０は本発明の第２の容器、容器３３は本発明の第３の容器、容器３４は本発明の第４の容器にそれぞれ相当し、容器３１が本発明の第５の容器、廃液用容器３２が本発明の第６の容器である。
【００４９】
また、これらの種々の試料や溶液を収容した容器は、図３においては、１つずつ設けた例で示しているが、それぞれ複数設けてもよいのは言うまでもなく、ここで例示していない試料や溶液、例えば、試薬などを収容する他の容器を設けてもよいのは言うまでもない。特に、試料ＤＮＡ３４ａを収めた容器３４を複数設けることで、同種サンプルの複数回の測定や多種サンプルの測定を行うことが可能となり利便性が向上する。
【００５０】
また、図示はしていないが、トレー４はアクチュエータ等により、図中矢印で示す上下左右の動作が可能となっている。
【００５１】
更に、実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部２０について説明する。図４は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部の装置構成図である。図４において、９ｂは受光部を示し、２４はＵＶランプ等の紫外線照射器、２５はフォトダイオード等の光センサ、２６，２７はスリットであり、２８は集光レンズである。
【００５２】
図４に示すように、発光部９ａは紫外線照射器２４を、受光部９ｂは光センサ２５をそれぞれ備えており、発光部９ａと受光部９ｂとで検出部２０が構成されている。そして、発光部９ａと受光部９ｂとの間に、それぞれスリット２６，２７を介して、キャピラリー管８が配置される。発光部９ａの紫外線照射器２４から発せられた紫外光は集光レンズ２８で集光され、更に、スリット２６を通過して、キャピラリー管８に照射される。この照射光はキャピラリー管８及びスリット２７を通過し、受光部９ｂの光センサ２５に到達する。なお、照射光の光路は、図４において点線で示している。
【００５３】
このように構成された検出部２０のＤＮＡの検出原理は、ＤＮＡのＵＶ吸光特性を利用したものであり、波長２５４ｎｍの吸光度の変化によりＤＮＡの通過を検出することができる。即ち、紫外光が照射される所定位置のキャピラリー管８内におけるＤＮＡの有無が、紫外線照射器２４から照射され、該キャピラリー管８を通過し、光センサ２５で受光される紫外光の強度変化として検出される。
【００５４】
図５は本実施の形態１における遺伝子診断装置の制御ブロック図である。図５において、４０は制御部、４１は駆動部である。制御部４０は操作部３から入力された信号を駆動部４１に出力し、駆動部４１は制御部４０からの指令によりアクチュエータ４２等の各種機器を動作させる。例えば、操作部３の測定開始ボタンを押すことにより、各種機器が動作する等である。
【００５５】
また、４３はＤ／Ａコンバータ、４４はＤ／Ａコンバータ４３からの信号に比例した電圧を発生させ各電極１０，１１に印加する電源部であり、制御部４０によって制御される。
【００５６】
更に、４５はＡ／Ｄコンバータであり温度センサ２０、光センサ２５等の信号を増幅部４６により増幅した値を入力しデジタル変換して制御部４０へ出力する。制御部４０はこれらの信号から駆動部４１に制御信号を出力する。例えば、温度センサ２０から出力された信号に基づき、ファン１２やヒータ１３に制御信号を送り、温度調整を行う等の制御が行われる。更に、表示部２の表示制御を行い種々の情報が表示部２で表示される。
【００５７】
ここで、電気泳動の基本原理を簡単に説明すると、ＤＮＡは負に帯電しており周囲に電界を発生させると陽極側へ移動しようとする。この時ポリアクリルアミドやアガロース等のゲル中にＤＮＡが存在した場合、ゲルとＤＮＡの抵抗関係により塩基長の短い（分子量の小さい）ものから移動をはじめる。同じ塩基長であれば同じ速度で移動し、異なる長さであれば移動速度が異なるため徐々に分離していく。最終的に各塩基長毎にバンドを形成するものである。
【００５８】
次に、ＤＮＡの結合について説明すると、ＤＮＡはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ４種の塩基配列からなり、通常二本鎖を形成する。またＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合し易い性質があるため二本鎖においてはＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。従って、一方の鎖が５’−ＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ−３’（配列番号１に記載）という配列の場合、もう一方の鎖は、３’−ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ−５’（配列番号２に記載）という塩基配列になる。この関係は相補的関係と呼ばれるもので、この相補関係が１塩基でも崩れた場合、極端に結合力が低下し、二本鎖が形成しづらくなる。またＤＮＡの結合力は温度にも依存する。ＤＮＡは高温（摂氏９４度）にすると二本の鎖がほどけて一本ずつばらばらになり、徐々に温度を下げると元通りの二本鎖に復元する性質がある。つまり、温度を制御することにより結合力を調整することができる。なお、本実施の形態１における遺伝子診断装置では、ヒータ１３、温度センサ２０等で温度制御が行われる。
【００５９】
本発明における遺伝子診断装置は、上述した原理を応用したものである。
【００６０】
次に、本遺伝子診断装置で測定する試料ＤＮＡについて説明する。本実施の形態１においては人の細胞や血液等から抽出し、目的の部位を増幅させ一本鎖にしたＤＮＡを試料とし、１２〜１００塩基長を想定している。
【００６１】
試料ＤＮＡの塩基数は、その他の範囲でも温度や各種試料濃度などの変更により分離解析は可能であるが、それら各種条件を最適化する作業が必要となる。また約３０億塩基対あるといわれるヒトのＤＮＡから目的の部位を取り出すには、特定部位のみを増幅させるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法や特定配列を持つ部位を切断する制限酵素法、アガロースゲル電気泳動などを利用して行なう。ただ、このＰＣＲ法、制限酵素法に関しては本遺伝子診断装置の説明に必要がないため具体的な説明は省略する。
【００６２】
本発明者らの実験によると、本遺伝子診断装置で正常型ＤＮＡと１塩基違いの変異型ＤＮＡを分離する場合、塩基の数は１２塩基程度が最も効率よく分離できるという結果を得ている。ただ、約３０億塩基から特定の１２塩基部を取り出す場合、上述した抽出増幅等の前処理工程において工数が増えるので６０塩基程度が最も適当であろう。
【００６３】
また、キャピラリー管８について更に詳しく説明すると、通常のキャピラリー管にポリアクリルアミド等を入れて両端に電圧を印加すると、電気浸透流と呼ばれる液の流れが発生してしまう。本遺伝子診断装置ではこの現象が起きないように、キャピラリー管８の内壁をアクリルアミドなどでコーティングしたものを使用する。コーティング剤は、電気浸透流の発生が阻止でき、試料ＤＮＡに影響を及ぼさないものであるなら他でもよい。なお、キャピラリー管８としては内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管が、紫外線を９０％以上透過でき、且つ紫外線を利用してＤＮＡを検出するとき、紫外線の通過量を容易に検出できるから最も適当である。
【００６４】
次に、容器１７，３０中に収容される緩衝液１８ａ，１８ｂについて説明する。通常はＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．２〜ｐＨ８程度）等を利用するのが適当である。Ｔｒｉｓを滅菌水で薄め、ホウ酸を徐々に加えながら目的のｐＨ値にしたものである。緩衝液１８ａと１８ｂに混入させる電解質としては、塩化マグネシウム等がある。また塩化マグネシウムはＤＮＡの２本鎖を強く結合させる効果をもっており、濃度により試料ＤＮＡの結合力制御を可能とするものである。また塩化マグネシウムとは逆に尿素など結合力を弱める物質等も知られており、それらＤＮＡ結合制御材の種類や混合比を選択することで試料ＤＮＡの多様な結合力制御が可能となる。本実施の形態１における緩衝液はＴｒｉｓ：５ｍＭ、ＭｇＣｌ２：０．２５ｍＭ、ｐＨ：７．４に調製されている。
【００６５】
次に、容器３３内に収容されているＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａについて説明する。
【００６６】
ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、後述する電気泳動中に正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡを分離しながら泳動させるための溶液であり、ゲル状態である。
【００６７】
ところで、本発明のＤＮＡコンジュゲートは、１本鎖ＤＮＡの５’末端にビニル基を導入したビニル化ＤＮＡを合成し、これとリニアポリマー溶液とのラジカル共重合によって作製したものである。従って、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、ＤＮＡコンジュゲートとリニアポリマー溶液の混合した溶液がＤＮＡ結合制御剤を添加した緩衝液に混合されたものである。
【００６８】
一例を挙げてＤＮＡコンジュゲートの作成方法を具体的に説明すると、ＤＮＡコンジュゲートの濃度を一定にするため、合成されたアミノ化ＤＮＡの吸光度を測定し、２．６ｍＭになるように希釈する。次にこの濃度でアミノ化ＤＮＡの量を例えば４００ｎモル（２．６ｍＭの溶液で１５３．８μＬ）と決定し、まずメタクリロイルオキシスクシンイミド（ＭＯＳＵ）０．０１５３ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１１７０μＬに溶解し、７１．３８８ｍＭの溶液として、この内２０μモルに相当する２８０μＬを、アミノ化ＤＮＡ１５３．８μＬとアミノ化ＤＮＡと同量の炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムからなるｐＨ調整液（ｐＨ９）１５３．８μＬとに混合する。
【００６９】
その後、一晩振とうし、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で未反応のＤＮＡを分離し、減圧遠心分離器でＨＰＬＣの溶離液を減圧乾燥し、濃度が０．５ｍＭになるように純水で希釈して溶液とする。生成されたビニル化ＤＮＡ溶液２５．８μＬ（アクリルアミドとのモル比０．０２５モル％）を超純水３０．２μＬで希釈して（ポリ）アクリルアミド１０％溶液３４μＬを加え、重合開始剤１．３４％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＤ）５μＬと１．３４％アンモニウムパーサルファイト（ＡＰＳ）５μＬを添加して目的のＤＮＡコンジュゲートとポリアクリルアミドの混合溶液が得られる。これをＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液とＤＮＡ結合制御剤とを添加した溶液に混合してＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａとする。なお、粘度に関しては、キャピラリー管８内に充填した時、自重により容易に落下しない程度にＴＥＭＤとＡＰＳの量や重合時の温度を変化させることでポリアクリルアミドの重合度を調整する。
【００７０】
次に、本実施の形態１における遺伝子診断装置の動作について図３等を用い説明する。
【００７１】
図３に示すように、緩衝液１８ｂを収容した容器３０、蒸留水３１ａを収容した容器３１、廃液用容器３２、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを収容した容器３３、試料ＤＮＡ３４ａを収容した容器３４をそれぞれ予めサンプルトレー４上にセットしておく。
【００７２】
そして、はじめに行なう容器１７内へ緩衝液１８ａを注入する方法を説明すると、先ず、電磁弁２１ｃと２１ｄを開き容器１７内に残る廃液を一旦廃液タンク２２へ注ぐ。必要に応じて、注入口１４より蒸留水等を注入し容器１７内を洗浄する。
【００７３】
洗浄が終わり容器１７内の液が廃液タンク２２へ全て排出されると、電磁弁２１ｄを閉じ、緩衝液を注入口１４より容器１７内へ注ぐ。ここで、水位センサ１６により容器１７内の緩衝液１８ａの量を検知し、所定の液面まで達すると電磁弁２１ｃを閉じ容器１７内への緩衝液の流入を停止する。これで容器１７内へ緩衝液１８ａが所定量満たされた状態となる。
【００７４】
次に、測定中におけるキャピラリー管８の温度制御について説明する。
【００７５】
ファン１２の排気側にヒータ１３が設けられているため、キャピラリー管８には加温された空気が送られる。更に、排気側には温度センサ２０が設置されておりその温度を測定しながらヒータ１３の電源を制御する。このようにキャピラリー管８の周囲の雰囲気温度を制御することでキャピラリー管８内を所定の温度に制御することが可能となる。
【００７６】
次に、キャピラリー管８内へＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを注入するが、その詳細について説明する。図６は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の動作説明図である。
【００７７】
まず、トレー４をアクチュエータにより移動させ、図６（ａ）に示すようにキャピラリー管８先端が容器３３のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａに浸された状態にする。
【００７８】
更に、図３で示す、電磁弁２１ａ〜２１ｄ全てを閉じ、吸引ポンプ５を動作させる。これにより密閉された容器１７内およびキャピラリー管８内が負圧となるためＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａがキャピラリー管８内へ吸引される。一定時間経過後、電磁弁２１ｂを開き、吸引ポンプ５を停止することでキャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持されることになる。この時、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａは、ある程度の粘度があるため、キャピラリー管８内を降下し外部へ出ることはなく保持される。
【００７９】
次に、キャピラリー管８内に保持されたＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの精製を行なう。ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａ中にはアクリルアミドと結合していないＤＮＡ等の不純物が存在する場合があり、測定精度に影響を与えることも考えられるので取り除くのが望ましい。本実施の形態１における精製方法は、電気泳動により取り除く方法であり、その詳細を説明する。
【００８０】
まずキャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持された状態で、図６（ｂ）で示すようにキャピラリー管８の先端が容器３０中の緩衝液１８ｂに浸された状態にする。
【００８１】
次に、図３で示す、電極１１に対して電極１０に正電圧を印加する。ＤＮＡは負に帯電しているため正極側の電極１０へ移動する。よってキャピラリー管８内に存在するポリアクリルアミドと未結合のＤＮＡはすべて容器１７内の緩衝液１８ａへ溶出することになる。また、キャピラリー管８で精製が完了したＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａにおいて、ポリアクリルアミドと結合しているＤＮＡ（ＤＮＡコンジュゲート）は、ポリアクリルアミドポリマーが碇の役目をして極端に泳動速度が遅いのでキャピラリー管８で擬似的に固定された状態となる。以上がＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの精製である。なお、緩衝液１８ａへ溶出した未結合のＤＮＡは、緩衝液の量に対して非常に微量であるため、緩衝液１８ａのｐｈを変化させることもなく、仮に逆流が生じた場合等にも、測定へ影響を及ぼすことはない。
【００８２】
次に、図６（ｃ）に示すように、試料ＤＮＡ３４ａをキャピラリー管８内へ定量注入する。注入方法の基本方式は、上述したＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを注入する方法と同様であり、吸引ポンプ５によりキャピラリー管８内へ試料ＤＮＡ３４ａを注入する。そして、吸引ポンプ５の動作時間により注入量が制御される。即ち、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが保持されたキャピラリー管８の下方末端、所定の電気泳動開始位置に試料ＤＮＡ３４ａを配置する必要がある。本実施の形態１では、例えば、吸引ポンプ５の動作時間を２秒とする。動作時間と量に関しては、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａの粘度やキャピラリー管８の長さ、内径などにより変化するものであり、これらの条件を変更した場合は、吸引ポンプ５の動作時間を変更する。
【００８３】
次に、試料ＤＮＡ３４ａを電気泳動分離し、検出判別する。キャピラリー管８末端に試料ＤＮＡ３４ａが注入された状態で、図６（ｂ）に示すように緩衝液１８ｂにキャピラリー管８末端が浸された状態にする。
【００８４】
そして、精製時と同様に電極１０，１１間に電圧を印加し、検出部２０側へ試料ＤＮＡ３４ａを泳動させる。
【００８５】
本実施の形態１における検出部２０は、上述のように、ＤＮＡのＵＶ吸光特性を利用したもので、発光部９ａと受光部９ｂで構成されており、波長２５４ｎｍの吸光度の変化によりＤＮＡの通過を検出することができる。発光部９ａに用いる紫外線照射器２４は殺菌灯などの波長２５４ｎｍを中心に照射するものや、幅広い波長範囲を照射するＤ２ランプ等にフィルターを設けたものでもよい。このように発光部９ａで波長を制限することで、受光部９ｂ側に分光装置を用いることなくＤＮＡの吸収波長である２５４ｎｍ近辺の吸光度を他の泳動液の吸光特性に影響されることなく測定することができる。
【００８６】
泳動したＤＮＡは、検出部２０で通過を検出され、図７のような波形を得ることができる。なお、図７は本発明の実施の形態１における経過時間と吸光度の関係を示すグラフである。図７の波形は、正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡが混合したサンプルであり、縦軸が吸光度（ａｂｓ（２５４ｎｍ））、横軸が時間（分）である。これは、ＤＮＡコンジュゲートには、正常型ＤＮＡと相補的関係にあるＤＮＡが結合しており、このＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡに対し、変異型ＤＮＡは正常型ＤＮＡに比べて１塩基分結合力が弱い。正常型ＤＮＡは、擬似的に固定されているＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため通常の泳動速度に対して減速する。以上の理由からサンプル中に両型のＤＮＡが存在する場合、図７のように２山の波形が得られる。時間的に最初の山が変異型ＤＮＡであり、遅れて出現した山が正常型ＤＮＡである。また、正常型のＤＮＡのみ存在する場合、もしくは、変異型のＤＮＡのみ存在する場合は１山の波形となる。このようにして試料ＤＮＡ３４ａの判別を行なうことが可能となる。なお、場合によっては、ＤＮＡコンジュゲートに、変異型ＤＮＡと相補的関係にあるＤＮＡを結合させてもよく、この場合は、上述した説明は正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとで逆になる。
【００８７】
次に、測定後の洗浄動作について説明する。連続して測定を行なう場合、キャピラリー管８内に保持されているＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを入れ換える必要がある。同種のＤＮＡサンプルを測定する場合でも、新たに入れ換えることで精度よく測定することができる。そこで、まずキャピラリー管８内のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを外部へ吐き出す。
【００８８】
図６（ｄ）に示すようにキャピラリー管８の先端が廃液用容器３２で覆われた状態にする。そして、図３で示す、電磁弁２１ａ〜２１ｄすべてを閉じ加圧ポンプ６を動作させる。すると容器１７内が加圧され緩衝液１８ａがキャピラリー管８を通り外部へ噴出しようとするので、キャピラリー管８内のＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａを緩衝液１８ａが押し出し廃液用容器３２へ噴出する。キャピラリー管８内にＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａが無くなると加圧ポンプ６を停止し、電磁弁２１ａを開く。
【００８９】
容器１７内が大気圧に戻ったところで電磁弁２１ａを再度閉じ、図６（ｅ）に示すようにキャピラリー管８の先端が容器３１内の蒸留水３１ａに浸るように配置する。そこで、吸引ポンプ５を動作させると蒸留水３１ａはキャピラリー管８内を通り容器１７内へと移動する。これが蒸留水洗浄である。ちなみに本実施の形態１では、蒸留水洗浄を５分間行なう。同様に、緩衝液１８ｂを用いて洗浄を５分間行なうことでキャピラリー管８の洗浄動作終了となる。なお、本実施の形態１では、蒸留水３１ａを用いたが洗浄が可能であれば、測定に影響を与えない範囲で他の液体を用いることもできる。
【００９０】
以上、実施の形態１における遺伝子診断装置について説明したが、その趣旨を逸脱しない範囲で種々な変更が可能である。
【００９１】
本実施の形態１において、ＤＮＡコンジュゲート溶液３３ａや試料ＤＮＡ３４ａ等をキャピラリー管８に導入する際にトレー４を移動させたが、トレー４を固定して、キャピラリー管８を備えるキャピラリーカセット７やその周辺機器を移動させてもよい。
【００９２】
更に、試料ＤＮＡ３４ａをキャピラリー管８に導入する際に、吸引ポンプ５によって試料ＤＮＡ３４ａを吸い上げたが、ＤＮＡは負に帯電しているので、電源１０，１１に電圧を印加して泳動させてキャピラリー管８に導入してもよい。
【００９３】
【発明の効果】
本発明によれば、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することができる。
【００９４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観斜視図
【図２】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の内部斜視図
【図３】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図
【図４】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の検出部の装置構成図
【図５】本実施の形態１における遺伝子診断装置の制御ブロック図
【図６】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の動作説明図
【図７】本発明の実施の形態１における経過時間と吸光度の関係を示すグラフ
【符号の説明】
１ 遺伝子診断装置本体
２ 表示部
３ 操作部
４ トレー
５ 吸引ポンプ
６ 加圧ポンプ
７ キャピラリーカセット
８ キャピラリー管
９ａ 発光部
９ｂ 受光部
１０，１１ 電極
１２ ファン
１３ ヒータ
１４ 注入口
１５ 緩衝液トラップ用容器
１６ 水位センサ
１７ 容器
１８ａ，１８ｂ 緩衝液
１９ シール材
２０ 検出部
２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ 電磁弁
２２ 廃液タンク
２３ 温度センサ
２４ 紫外線照射器
２５ 光センサ
２６，２７ スリット
２８ 集光レンズ
３０，３１，３３，３４ 容器
３１ａ 蒸留水
３２ 廃液用容器
３３ａ ＤＮＡコンジュゲート溶液
３４ａ 試料ＤＮＡ
４０ 制御部
４１ 駆動部
４２ アクチュエータ４２
４３ Ｄ／Ａコンバータ
４４ 電源部
４５ Ａ／Ｄコンバータ
４６ 増幅部
Claims (16)
- 緩衝液を収容し第１の電極が浸漬された第１の容器と、
緩衝液を収容し第２の電極が浸漬された第２の容器と、
前記第１の容器から下方に延設され、前記第１の容器と前記第２の容器間を連絡する密閉流路と、
前記密閉流路内を通過するＤＮＡを検知する検出部と、
前記第１の電極と第２の電極間に電圧を印加する電源部とを備え、
前記密閉流路内は、試料ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を持つＤＮＡと高分子化合物とが結合し、結合力の差から試料ＤＮＡを正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡに分離するＤＮＡコンジュゲートと、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液とを含むＤＮＡコンジュゲート溶液で充たされ、
電圧を印加することにより、前記密閉流路内に導入された試料ＤＮＡが電気泳動され、前記検出部で正常型ＤＮＡ及び／または変異型ＤＮＡの通過を検知することを特徴とする遺伝子診断装置。 - 前記密閉流路の温度を制御する温度制御部を備えたことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子診断装置。
- 前記ＤＮＡコンジュゲート溶液を収容する第３の容器を設け、前記密閉流路先端が、前記第２の容器に収容された緩衝液、または、前記第３の容器に収容されたＤＮＡコンジュゲート溶液に任意に浸されるように、前記第２の容器と前記第３の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする請求項１，２いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記試料ＤＮＡを収容する第４の容器を設け、前記密閉流路先端が、前記第２の容器に収容された緩衝液、または、前記第４の容器に収容された試料ＤＮＡに任意に浸されるように、前記第２の容器と前記第４の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記密閉流路を洗浄する蒸留水等の洗浄液を収容する第５の容器を設け、前記密閉流路先端が、前記第２の容器に収容された緩衝液、または、前記第５の容器に収容された洗浄液に任意に浸されるように、前記第２の容器と前記第５の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記密閉流路内のＤＮＡコンジュゲート溶液等が排出される第６の容器を設け、前記密閉流路先端が、前記第２の容器に収容された緩衝液、または、前記第６の容器に任意に浸されるように、前記第２の容器と前記第６の容器を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする請求項１〜５いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記第２の容器と、前記第３の容器、或いは、前記第４の容器、或いは、前記第５の容器、或いは、前記第６の容器とは、共に同一トレー上に配置されたことを特徴とする請求項３〜６いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記第１の容器及び前記第１の容器から下方に延設された密閉流路を移動させる移動手段を備えたことを特徴とする請求項３〜６いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記第１容器内を負圧にして前記密閉流路内に試料を注入する吸引手段を備えたことを特徴とする請求項１〜８いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記検出部が、少なくとも波長２５４ｎｍの光を発する発光部と、波長２５４ｎｍを含む感度域を持つ受光部で構成されたことを特徴とする請求項１〜９いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記検出部が、前記密閉流路内の高分子化合物の吸光領域を含まない波長光を発する発光部を備えたことを特徴とする請求項１〜１０いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記ＤＮＡコンジュゲート溶液が、前記密閉流路内を下方にある前記第２容器側へ移動することのない程度の高粘度であることを特徴とする請求項１〜１１いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記第１容器に緩衝液および蒸留水等の注入口ならびに排液口を設け、更に前記第１容器内に水位検出部を設けたことを特徴とする請求項１〜１２いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記密閉流路をキャピラリー管としたことを特徴とする請求項１〜１３いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
- 前記キャピラリー管の内壁をアクリルアミドでコーティングしたことを特徴とする請求項１４記載の遺伝子診断装置。
- 前記キャピラリー管の外壁はポリイミド等のコーティングがなされていないことを特徴とする請求項１４，１５いずれか１項に記載の遺伝子診断装置。
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