CN111148828A - 利用阳离子分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用阳离子分离细胞外囊泡的方法，具体地涉及一种利用细胞外囊泡与阳离子之间的亲和力从各种样品中分离细胞外囊泡的方法。本发明所述分离细胞外囊泡的方法不需要昂贵的设备，在应用时可以不考虑样品的量，并且具有能够在有效分离细胞外囊泡的同时维持其形状或特性的优点。此外，本发明所述的方法可以同现有的分离方法结合以最大化细胞外囊泡的分离效率，并且可以应用于疾病诊断、疾病治疗和利用分离的细胞外囊泡的多组学研究以及对细胞外囊泡特性的研究之中。

Description

利用阳离子分离细胞外囊泡的方法
技术领域
本发明涉及一种利用阳离子分离细胞外囊泡的方法，具体涉及一种利用细胞外囊泡对各种类型阳离子的亲和力从各种样品中分离细胞外囊泡的方法。
背景技术
细胞外囊泡是纳米尺寸的囊泡，其通过普遍的细胞机制，由从人到细菌的所有活生物或细胞自然释放。源于真核细胞的细胞外囊泡参与红细胞的分化、免疫应答的调节等，特别是被揭示出在癌细胞微环境中，对癌症的发展、转移或血管生成起重要作用。因此，在包括癌症的各种疾病中，细胞外囊泡作为诊断标签的应用受到了广泛关注。
与真核细胞的细胞外囊泡类似，原核细胞分泌的细胞外囊泡含有原核细胞的成分，不仅会引起全身性炎症，还会因其进入人体的途径而引起急性肺部炎症，据报道可在局部皮肤组织中诱导慢性炎症反应从而在皮肤中引起特应性皮炎，该皮炎是现代人的代表性疾病之一。由于源于细菌的细胞外囊泡与人体内的癌发生之间的相关性已被发现，因此源于原核细胞的细胞外囊泡也受到了广泛关注。
细胞外囊泡的最主要功能之一是其在细胞间信息交换机制中起重要作用。因此，细胞外囊泡的成分在基础研究和医学领域也备受关注。
细胞外囊泡是体内或体外各种类型的细胞分泌的生物纳米颗粒，其存在于体液中，例如血液、尿液、唾液和泪液，其包括来源于细胞的脂质双分子层，并且是具有20-10,000nm范围内的各种尺寸的膜结构囊泡。
细胞外囊泡与其他细胞和组织结合以充当转运载体，其携带细胞内物质(例如膜成分、蛋白质和RNA)，因此含有分泌该细胞外囊泡的原始细胞(母细胞)的蛋白质、脂质、氨基酸、RNA等物质。因此，细胞外囊泡是了解母细胞生理和病理特征的重要基础。除此之外，已知细胞外囊泡中所含的核酸、生长激素、蛋白质等受到细胞膜型磷脂的保护，故与可溶形式的生长因子和细胞因子相比，可以更稳定地发挥功能。相应地，细胞外囊泡的重要性越来越高，并且细胞外囊泡中包含的物质经分析后，被期望具有多种用途，包括疾病的诊断和治疗。
细胞外囊泡很小，具有纳米水平的尺寸，并且除了细胞外囊泡之外，在体液、细胞培养物等中还存在许多其他物质。因此，从样品(例如体液和细胞培养物)中分离细胞外囊泡对于分析细胞外囊泡非常重要，相当于所有用到细胞外囊泡的领域里最核心的技术之一。
近年来，已经在疾病诊断中从各种角度发展了无创液体活检的应用。另外，业界已经努力通过利用活组织或体液中的细胞外囊泡来探索用于疾病诊断的新标签，并且通过使用相应标签来进行诊断。这些努力的潜在问题在于细胞外囊泡从活组织或体液中的分离，常规的从体液中纯化细胞外囊泡方法由于产量的相对有限和高复杂性导致其几乎是不可行的。因此，迫切需要一种新的有效分离方法，该方法应不同于分离细胞外囊泡的常规方法。
用于分离细胞外囊泡的现有技术是超速离心、尺寸排阻、免疫亲和分离、微流体芯片或使用聚合物的沉淀，其中最广泛地使用是超速离心。然而，超速离心分离细胞外囊泡的方法具有局限性，例如由于步骤复杂而耗费大量劳力和时间、需要昂贵的设备并且产率低，因此这种分离方式在医药产品的纯化中的应用非常受限，因其需要大量细胞外囊泡，而该限制同样体现在需要通过仅仅使用少量样品即可快速获得结果的临床诊断中。
分离物质中最有效的方法之一是，通过对目标物质的选择性结合，在复杂的环境中逐步去除污染物，同时在分离目标物质的过程中不会损失目标物质。然而，对于细胞外囊泡，具有这种选择性结合特性的材料的例子限于某些抗体或蛋白质配体。使用这些抗体或蛋白质进行细胞外囊泡分离的方法效率低下，难以高效地开发抗体和蛋白质配体，并且成本高，故非常受限。
因此，迫切需要一种能够有效且选择性地高产率分离和纯化细胞外囊泡的同时，保持细胞外囊泡结构和功能完整的技术。
发明内容
技术问题
本发明的一个方面提供了一种利用阳离子和细胞外囊泡之间的亲和力来方便且高效地分离样品中的细胞外囊泡的方法，所述方法迄今为止尚未被报道过。
技术方案
为了解决上述问题而做出本发明，本发明的一方面提供了一种利用阳离子和细胞外囊泡之间的亲和力来方便且高效地分离样品中的细胞外囊泡的方法。
在本发明中，当添加各种类型的阳离子以与包含细胞外囊泡的各种样品反应时，细胞外囊泡与阳离子在样品中彼此结合而形成不溶性复合物。可以通过多种方法，例如离心、超滤和重力沉淀来分离细胞外囊泡-阳离子复合物，随后，可以通过从复合物中解吸阳离子来分离细胞外囊泡。通过这种方法，可以迅速且容易地从各种样品中分离出细胞外囊泡，而无需进行理化性质上的转化。这样分离出的细胞外囊泡很容易应用于诊断、治疗、多组学研究、细胞外囊泡特性研究等方面。
本文所用之术语“细胞外囊泡”，是指源自古细菌、原核生物或真核生物细胞的生物纳米颗粒，并且可以包括但不限于外泌体、阿尔戈体(argosome)、树突状细胞源体、核外颗粒体、囊泡、癌小体、prominosome、前列腺体、耐受体、微粒、微泡、纳米囊泡、起泡囊泡、出芽囊泡、外泌体状囊泡、基质囊泡、膜状泡、脱落囊泡、膜颗粒、脱落微泡、膜泡、附睾体、凸素体、肿瘤细胞源体和古细菌脂质体。
本发明的一个方面提供了一种分离细胞外囊泡的方法，该方法包括：(a)将阳离子添加到生物样品中；(b)使所述阳离子与所述生物样品中含有的细胞外囊泡反应以形成细胞外囊泡-阳离子复合物；(c)从样品中分离出所述细胞外囊泡-阳离子复合物；和(d)从复合物中分离所述阳离子以纯化细胞外囊泡。
图1中示意性展示了根据本发明一个实施方案的分离细胞外囊泡的方法。
在本发明的一个实施方案中，一种分离细胞外囊泡的方法包括：将阳离子添加到生物样品中的步骤(步骤(a))；和使所述阳离子与所述生物样品中含有的细胞外囊泡反应以形成细胞外囊泡-阳离子复合物的步骤(步骤(b))。
本文所用之术语“生物样品”或“样品”，包括生物的样品、细胞培养物、组织样品等，上述每一个均含有细胞外囊泡。具体而言，样品可以是但不限于选自由哺乳动物细胞培养基、细菌细胞培养基、酵母培养基、组织提取物、癌组织、血清、血浆、唾液、泪液、汗液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、羊水、精液、乳汁、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品组成的群组中的至少一种。
本文所用之术语“阳离子”，是指带正电的离子，其对细胞外囊泡具有特定亲和力并且可以与样品中的细胞外囊泡结合，该阳离子可优选金属阳离子。本文所用之术语“金属阳离子”，可以包括碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子和后过渡金属离子。本发明所述阳离子或金属阳离子可以优选但不限于过渡金属离子或碱土金属离子，只要该阳离子对要分离的细胞外囊泡具有特定亲和力即可。
碱金属是元素周期表第1族中除氢元素外所有化学元素的统称，包括锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr)。碱土金属是元素周期表中第2族的元素，包括铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)和镭(Ra)。过渡金属包括元素周期表中属于第4-7周期、第3-12族的元素，并且通过与非金属元素共同形成离子键化合物而以复合离子的形式存在。具体而言，本发明所述过渡金属包括钪(Sc)、钇(Y)、钛(Ti)、锆(Zr)、铪(Hf)、钅卢(Rf)、钒(V)、铌(Nb)、钽(Ta)、钅杜(Db)、铬(Cr)、钼(Mo)、钨(W)、钅喜(Sg)、锰(Mn)、锝(Tc)、铼(Re)、钅波(Bh)、铁(Fe)、钌(Ru)、锇(Os)、钅黑(Hs)、钴(Co)、铑(Rh)、铱(Ir)、钅麦(Mt)、镍(Ni)、钯(Pd)、铂(Pt)、钅达(Ds)、铜(Cu)、银(Ag)、金(Au)、钅仑(Rg)、锌(Zn)、镉(Cd)、汞(Hg)和鎶(Cn)。后过渡金属是指元素周期表中p区的金属元素，包括铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、锡(Sn)、铅(Pb)、铋(Bi)和钋(Po)。
本发明所述添加阳离子包括：将含有阳离子的溶液添加至样品中，以及将固体形式的阳离子添加至样品中并溶解阳离子。但是添加阳离子的形式不限于此，只要阳离子的形式可以与样品中的细胞外囊泡反应即可。
本发明所述分离细胞外囊泡的方法涉及利用待分离的细胞外囊泡与阳离子特异性结合的性质从样品中分离与阳离子结合的细胞外囊泡的方法。本发明所述方法中，首先添加阳离子与样品反应以诱导样品中的细胞外囊泡与阳离子之间的特异性结合，从而形成不溶性细胞外囊泡-阳离子复合物。
本发明的一个实施例证实了，将钙离子、锰离子、钴离子、铜离子或锌离子添加到含有细胞外囊泡的培养基样品或尿液样品中，形成了不溶性复合物。还证实了不溶性复合物通过重力沉淀即可被容易地分离。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述分离细胞外囊泡的方法包括从样品中分离出细胞外囊泡-阳离子复合物的步骤(步骤(c))。
所述分离出细胞外囊泡-阳离子复合物的步骤为：将先前步骤中形成的不溶性复合物与含有多种可溶性物质的样品分离。该步骤可以使用但不限于选自由离心、超离心、过滤、超滤、重力沉淀、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、基于聚合物的沉淀或有机溶剂沉淀组成的群组中的至少一种。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述分离细胞外囊泡的方法包括从细胞外囊泡-阳离子复合物中分离阳离子以纯化细胞外囊泡的步骤(步骤(d))。
本发明所述纯化细胞外囊泡的步骤是，仅所述细胞外囊泡可通过去除细胞外囊泡与阳离子之间的特异性结合状态而与复合物分离，并且所述步骤可以采用本领域技术人员可以理解的各种方法或条件。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤可以包括将螯合剂添加至分离的细胞外囊泡-阳离子复合物。
本文所用之术语“螯合剂”或“螯合配体”，是指包含两个或多个配位原子的离子、分子或原子团，其与金属离子配位形成稳定的螯合物。按照配位原子数，该术语也被称为三齿配体、四齿配体、五齿配体、六齿配体等。本发明所述螯合配体可以是选自但不限于由亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、三-(羧甲基)乙二胺(TED)、乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、烷基二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、磷酸丝氨酸和1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)组成的群组中的至少一种，只要螯合配体可以与本发明中使用的金属阳离子特异性结合以将阳离子从细胞外囊泡-阳离子复合物中分离出来即可。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤可以采用改变含有分离的细胞外囊泡-阳离子复合物的溶液的pH值。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤可以采用改变包含分离的细胞外囊泡-阳离子复合物的溶液中的咪唑、组氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或盐的浓度，从而从复合物中纯化出细胞外囊泡。
本发明中所述纯化细胞外囊泡的步骤可以选择上述方法中的任一种或其组合来进行。优选地，本发明的纯化条件可以使用但不限于pH 10以下的缓冲液、0-5M NaCl、0-2M咪唑、0-2M金属螯合剂或其组合。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括在将阳离子添加到生物样品中之前对样品进行预处理的步骤。
本发明所述预处理步骤是部分纯化未纯化样品的步骤，并且可以采用但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、基于聚合物的沉淀和有机溶剂沉淀中的至少一种来进行。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述分离细胞外囊泡的方法可以进一步包括后对细胞外囊泡进行后处理的步骤。
本发明所述后处理步骤是纯化分离的细胞外囊泡的步骤，并且可以采用但不限于选自离心、超离心、过滤、超滤、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、基于聚合物的沉淀和有机溶剂沉淀中的至少一种来进行。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述分离细胞外囊泡的方法可以在将阳离子添加到样品中的步骤中进一步包括添加聚合物或盐析离子的步骤。在本发明所述利用阳离子分离细胞外囊泡的方法中，将所述聚合物或盐析离子与所述阳离子一起添加可以显著提高不溶性复合物的形成速率，显著提高细胞外囊泡的分离效率和缩短其分离时间。
具体地，可以将所述聚合物或盐析离子与所述阳离子同时添加到样品中。
另外，可以在将阳离子添加到样品之前预先将所述聚合物或盐析离子添加到样品中。
另外，可以在添加阳离子之后将所述聚合物或盐析离子添加到样品中。
在本发明的一个实施方案中，所述聚合物可以是聚乙二醇(PEG)或聚恶唑啉，按照取代基的不同，其中聚恶唑啉可以是聚(2-甲基-2-恶唑啉)(PMOZ)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)或聚(2-丙基-2-恶唑啉)(PPOZ)。所述聚合物可以优选为但不限于聚乙二醇(PEG)或聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)。
本文所用之术语“盐析离子”，是指用于稳定水结构的离液序列低(kosmotropic)的盐，其中所述盐析离子通过降低溶液中水的溶解度来增加疏水相互作用的强度。根据影响溶液中可溶性物质溶解度的能力，由Hofmeister系列表示离液序列低的盐，阴离子的顺序如下：SO4 2-<HPO4 2-<OH-<F-<HCOO-<CH3COO-<Cl-<Br-<NO3 -<I-<SCN-<ClO4 -。阳离子的顺序如下：NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg2+和Ba2+。根据Hofmeister系列，离液序列低的盐可作为疏水性颗粒的盐析离子。本发明所述盐析离子可以是由稳定水结构的Hofmeister系列阴离子和其抗衡阳离子组成的离液序列低的盐。
有利效果
本发明所述分离细胞外囊泡的方法不需要昂贵的设备(例如离心机)，并且在分离细胞外囊泡期间防止样品暴露于极端环境，因此可以在保持细胞外囊泡形态或性质的同时有效地分离细胞外囊泡。此外，本发明所述的方法可以与分离细胞外囊泡的常规方法结合应用，其中可以在进行常规方法之前或之后使用本发明的方法，从而使分离效率最大化。
此外，本发明所述分离细胞外囊泡的方法能够简单有效地分离细胞外囊泡，因此可以成为细胞外囊泡大规模纯化的重要因素，并且能够用于少量液体样本的预处理和后处理步骤中，从而可用于临床诊断。
此外，本发明所述分离细胞外囊泡的方法可以利用不同类型细胞外囊泡对特定类型阳离子的亲和力不同这一特征，通过各种类型的阳离子来分离细胞外囊泡的子集。细胞外囊泡的级分子集可用于多维疾病诊断，同时将各种先前开发的疾病诊断标签应用于本发明可以解决常规诊断标签存在的问题并可对诊断标签进行各种应用。
附图说明
图1是展示根据本发明一个实施方案所述分离细胞外囊泡的方法的示意图。
图2展示了根据本发明实施例所述分离样品细胞外囊泡的方法及其特征的分析结果。
图3展示了HPLC结果，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加几种浓度的各种类型的阳离子(Ca2+，Cu2+和Zn2+)，从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图4展示了纳米颗粒追踪分析结果(图4A)和蛋白质印迹结果(图4B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加几种浓度的铜阳离子(氯化铜(II))从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图5展示了纳米颗粒追踪分析结果(图5A)和蛋白质印迹结果(图5B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的铜阳离子(硫酸铜(II))从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图6展示了纳米颗粒追踪分析结果(图6A)和蛋白质印迹结果(图6B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的钴阳离子(氯化钴)从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图7展示了纳米颗粒追踪分析结果(图7A)和蛋白质印迹结果(图7B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的锰阳离子(氯化锰(II))从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图8展示了纳米颗粒追踪分析结果(图8A)和蛋白质印迹结果(图8B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的锰阳离子(硫酸锰(II))从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图9展示了纳米颗粒追踪分析结果(图9A)和蛋白质印迹结果(图9B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的钙阳离子(氯化钙)从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图10展示了纳米颗粒追踪分析结果(图10A)和蛋白质印迹结果(图10B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的锌阳离子(氯化锌)从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图11展示了纳米颗粒追踪分析结果(图11A)和蛋白质印迹结果(图11B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的钙阳离子(氯化钙)从人尿中分离出了细胞外囊泡。
图12展示了纳米颗粒追踪分析结果(图12A)和蛋白质印迹结果(图12B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的锰阳离子(硫酸锰(II))从人尿中分离出了细胞外囊泡。
图13展示了纳米颗粒追踪分析结果(图13A)和蛋白质印迹结果(图13B)，确认了在本发明的一个实施例中，通过添加不同浓度的锌阳离子(氯化锌)从人尿中分离出了细胞外囊泡。
图14展示了纳米颗粒追踪分析结果，确认了在本发明的一个实施例中，通过同时添加不同类型的阳离子(氯化铜(II)和硫酸锰(II))和聚合物(PEG和PEOZ)从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图15展示了蛋白质印迹结果，确认了在本发明的一个实施例中，通过同时添加铜阳离子(硫酸铜(II))和聚合物(PEOZ)从细胞培养物中分离出了细胞外囊泡。
图16展示了确认细胞外囊泡被分离出来的结果，该结果是通过将常规的盐析离子(硫酸铵)沉淀方法和本发明一个实施例中的按照本发明所述使用铜阳离子(硫酸铜(II))的方法相结合得到的。
图17展示了常规的使用聚乙二醇(PEG)分离细胞外囊泡的结果(图17A)与使用本发明所述方法分离细胞外囊泡的结果(图17B)之间的对比。
具体实施方式
实施发明的方式
在下文中，将结合实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：样品细胞外囊泡的纯化和分析
将结直肠癌细胞SW480培养物以500×g离心10分钟(总共重复两次)以去除残留的细胞和沉淀物。将上清液再次以2,000×g离心20分钟(总共重复两次)以去除沉淀物。
为了初步纯化和沉淀存在于上清液中的细胞外囊泡，将细胞外囊泡沉淀诱导溶液(8.4％聚乙二醇6000，250mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.4)添加到上清液中，在冰箱中存放16小时后，以12,000×g离心30分钟收集沉淀的细胞外囊泡，然后将其溶于HEPES缓冲盐水(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)中。
为用密度和浮力第二次纯化细胞外囊泡，将上步得到的样品与Optiprep混合(终浓度为30％)，并置于超速离心容器的最低层，然后在其上依次分层加入20％OptiPrep和5％OptiPrep。进行2小时200,000×g的OptiPrep浮力密度梯度超离心(30％、20％和5％OptiPrep三层)，超离心后获得与细胞外囊泡相等密度(1.08-1.12g/ml)的区域。
为了三次纯化上述纯化后的细胞外囊泡，使用HPLC设备将纯化后的细胞外囊泡上样至装有Sephacryl S500的柱子(10×100mm)上，随后进行尺寸排阻层析，进而获得最终纯化的细胞外囊泡级分。本实施例所述分离样品细胞外囊泡的方法在图2A中展示。
通过HPLC色谱图分析经上述纯化后的源于结直肠癌细胞的细胞外囊泡的结果显示，分子尺寸排阻层析中在3.6分钟处观察到280nm的吸收带(图2B)。通过层析对各个级分进行纳米颗粒追踪分析(NTA)，结果显示可以在3.01-4.5分钟之间洗脱的样品中检测到高纳米颗粒信号，并且经验证这些信号与280nm吸收带相匹配，这表明细胞外囊泡对应于在HPLC分析中3.6分钟处检测到的条带(图2B)。
检查经上述方法最后从大肠癌细胞系(SW480)纯化的细胞外囊泡的形态。如图2D所示，其结果确认了源于大肠癌细胞SW480的细胞外囊泡的大小约为50-200nm。细胞外囊泡标签TSG101和CD9经Western印迹确认，如图2E所示。
实施例2：使用几种浓度的不同类型的阳离子分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的不同类型的阳离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+)，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。图3A展示了对使用HPLC系统进行尺寸排阻层析分离的细胞外囊泡的分析结果，样品中的细胞外囊泡于3.6分钟处被检测到。
关于添加到大肠癌细胞培养物中的钙、铜和锌阳离子的处理浓度，已证实在3.6分钟处检测到的280nm吸收带随阳离子的浓度成比例增加，这些结果如图3B到3D所示。各种类型阳离子的吸收带和样品细胞外囊泡的吸收带显示检测的时间相同，并且可以看出，从细胞培养物中分离出的细胞外囊泡的产量随所添加阳离子的浓度而增加。
实施例3：使用铜阳离子(氯化铜(II))分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的铜阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。纳米颗粒跟踪分析利用NanosightLM10仪器，并在摄像机级别为10和检测限为3的条件下进行了60秒的跟踪和记录。对于蛋白质印迹分析，SDS电泳后分析了CD9的信号，CD9是一种通用的细胞外囊泡标签。
结果如图4A所示，随着铜阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的产量增加。由此在图4B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随铜阳离子的浓度成比例增强。
实施例4：使用铜阳离子(硫酸铜(II))分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的铜阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图5A所示，随着铜阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图5B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随铜阳离子的浓度成比例增强。
实施例5：使用钴阳离子(氯化钴)分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的钴阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图6A所示，随着钴阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图6B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随钴阳离子的浓度成比例增强。
实施例6：使用锰阳离子(氯化锰(II))分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的锰阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图7A所示，随着锰阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图7B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随锰阳离子的浓度成比例增强。
实施例7：使用锰阳离子(硫酸锰(II))分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的锰阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图8A所示，随着锰阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图8B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随锰阳离子的浓度成比例增强。
实施例8：使用钙阳离子(氯化钙)分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的钙阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图9A所示，随着钙阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图9B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随钙阳离子的浓度成比例增强。
实施例9：使用锌阳离子(氯化锌)分离细胞外囊泡
向大肠癌细胞培养物中添加几种浓度的锌阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图10A所示，随着锌阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图10B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随锌阳离子的浓度成比例增强。
实施例10：通过使用钙阳离子(氯化钙)从人尿中分离细胞外囊泡
将人尿以2,000×g离心15分钟(总共重复两次)以去除残留的沉淀物。向上清液中添加几种浓度的钙阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图11A所示，随着钙阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图11B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随钙阳离子的浓度成比例增强。
实施例11：通过使用锰阳离子(硫酸锰(II))从人尿中分离细胞外囊泡
将人尿以2,000×g离心15分钟(总共重复两次)以去除残留的沉淀物。向上清液中添加几种浓度的锰阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图12A所示，随着锰阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图12B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随锰阳离子的浓度成比例增强。
实施例12：通过使用锌阳离子(氯化锌)从人尿中分离细胞外囊泡
将人尿以2,000×g离心15分钟(总共重复两次)以去除残留的沉淀物。向上清液中添加几种浓度的锌阳离子，混匀后以3,000×g离心10分钟，收集沉淀物，然后将沉淀物溶于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水。通过纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹分析研究经上述方法分离的细胞外囊泡。
结果如图13A所示，随着锌阳离子浓度的增加，细胞外囊泡的浓度增加。由此在图13B中得以证实，通用细胞外囊泡标签CD9的信号随锌阳离子的浓度成比例增强。
实施例13：通过不同类型的阳离子(氯化铜(II)和硫酸锰(II))和聚合物的组合提高细胞外囊泡的分离效率
为了比较不同的阳离子和聚合物组合的细胞外囊泡分离效率，通过单独添加阳离子、单独添加一种聚合物或同时添加阳离子和一种聚合物来分离细胞外囊泡。
具体而言，使用聚乙二醇(PEG)或聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)作为分离细胞外囊泡的聚合物，其中仅将聚乙二醇(PEG)添加到结直肠癌细胞培养物中至8.3％的最终浓度，或仅将(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)添加到直肠癌细胞培养物中至10％的最终浓度。对于单独添加聚合物的实验组，在室温下培养10分钟并在4℃下培养16小时，然后离心收集细胞外囊泡。
对于单独添加阳离子的实验组，仅将铜阳离子(CuCl2)或锰阳离子(MnSO4)添加到同样的细胞培养物中至20mM的最终浓度，后在室温下培养10分钟，离心收集细胞外囊泡。同时添加阳离子和聚合物的情况下，通过在室温下培养10分钟后离心来收集细胞外囊泡。之后，将上述沉淀的细胞外囊泡溶解在相同体积的HEPES缓冲盐水中。
进行纳米颗粒追踪分析以比较在单独添加聚合物、单独添加阳离子或混合添加阳离子-聚合物的情况下细胞外囊泡的产量。如图14A至14C所示，结果证实了在仅用阳离子培养10分钟的条件下细胞外囊泡的产量是在仅用聚合物培养16小时的条件下细胞外囊泡的产量的2-3倍，并且在用阳离子和聚合物混合物培养10分钟的条件下，细胞外囊泡的产量进一步增加。因此可以得出，单独使用聚合物的效率非常低，但是在阳离子的存在下添加聚合物能够进一步提高阳离子沉淀细胞外囊泡的效率。
实施例14：根据铜阳离子(硫酸铜(II))和聚合物的浓度对细胞外囊泡进行CD9分析
对下列样本进行3,000×g离心10分钟以收集细胞外囊泡：通过将不同浓度的铜阳离子和最终浓度为10％的聚乙基恶唑啉添加到大肠癌细胞培养物中并在室温下培养30分钟所得之样品；通过将聚乙基恶唑啉单独添加到上述同样的细胞培养物中并在4℃培养18小时所得之样品。为了研究在各种条件下获得的细胞外囊泡的产量，利用蛋白质印迹法分析细胞外囊泡标志物CD9的量。
如图15所示，结果表明在仅用聚乙基恶唑啉培养30分钟的条件下获得的细胞外囊泡的产率很低，但是在各种浓度的铜阳离子和聚合物混合的条件下培养30min时，细胞外囊泡的收获量显著提高并与铜阳离子的浓度成正比。因此可以看出，单用聚乙基恶唑啉的细胞外囊泡沉淀效率非常低，但是在铜阳离子存在下添加聚合物可使细胞外囊泡的沉淀效率最大化。
实施例15：利用硫酸铵和铜阳离子(硫酸铜(II))的组合分离细胞外囊泡
对下列样本进行3,000×g离心10分钟以收集细胞外囊泡：通过将最终浓度为1.5M的硫酸铵添加到大肠癌细胞培养物中并在室温下培养30分钟所得之样品；通过将铜阳离子(10mM)单独添加到上述同样的细胞培养物中所得之样品；通过将铜阳离子和硫酸铵共同添加到上述同样的细胞培养物中所得之样品。利用纳米颗粒追踪分析研究在各个条件下获得的细胞外囊泡的产量。
如图16所示，结果表明在仅用硫酸铵培养30分钟的条件下所得细胞外囊泡的收率非常低，但是在仅用10mM铜阳离子培养30分钟的条件下所得细胞外囊泡的收率高。在铜离子和硫酸铵混合培养30分钟时，样品中细胞外囊泡的产量进一步增加，与铜阳离子的浓度成比例。在30分钟的短时间培养情况下，仅使用硫酸铵的细胞外囊泡沉淀效率非常低，而仅用铜阳离子的沉淀效率非常好。当同时添加铜阳离子和硫酸铵沉淀细胞外囊泡时，铜阳离子沉淀细胞外囊泡的效率得到最大化。
实施例16：使用聚合物的细胞外囊泡分离与通过铜阳离子的细胞外囊泡分离之间的对比
进行以下实验以分析使用聚合物的细胞外囊泡分离和通过聚合物-阳离子组合的细胞外囊泡分离之间产率和纯度上的差异。对于用常规方法从10ml的大肠癌细胞培养物中分离细胞外囊泡，添加聚乙二醇(PEG)至终浓度为8.3％，在4℃下培养18小时，随后在3,000×g下离心10分钟，然后将沉淀物溶于HEPES缓冲盐水(20mM HEPES，pH7.2，150mM NaCl)中。同时，对于进行本发明所述的分离方法，将铜阳离子添加到相同体积的细胞培养物中，培养10分钟，随后在3,000×g下离心10分钟获得沉淀物，然后将沉淀物溶解于含50mM EDTA的HEPES缓冲盐水中。利用基于旋转(spin-based)的尺寸排阻层析法对经上述方法分离所得含有细胞外囊泡的样品进行进一步分离，然后使用HPLC系统进行尺寸排阻层析法分析。
如图17所示，结果证实与使用聚合物的分离细胞外囊泡的常规方法相比，阳离子的使用显著提高了细胞外囊泡的产率和纯度。
尽管已经引用特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，相关描述仅用于优选的实施方法，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

Claims (12)

1.一种分离细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
(a)将阳离子添加到生物样品中；
(b)使所述阳离子与所述生物样品中含有的细胞外囊泡反应以形成细胞外囊泡-阳离子复合物；
(c)从样品中分离出所述细胞外囊泡-阳离子复合物；和
(d)从复合物中分离所述阳离子以纯化细胞外囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是选自由哺乳动物细胞培养基、细菌细胞培养基、酵母培养基、组织提取物、癌组织、血清、血浆、唾液、泪液、汗液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、羊水、精液、乳汁、灰尘、淡水、海水、土壤和发酵食品组成的群组中的至少一种。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子是金属阳离子。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)是通过使用选自由离心、超离心、过滤、超滤、重力沉淀、超声处理、密度梯度离心、尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、基于聚合物的沉淀和有机溶剂沉淀组成的群组中的至少一种来进行的。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括选自以下群组中的至少一种：向所述分离出的细胞外囊泡-阳离子复合物中添加螯合剂、改变pH值和改变选自由咪唑、组氨酸、乙二胺四乙酸盐(EDTA)和盐组成的群组中的至少一种的浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述螯合剂是选自由亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、三-(羧甲基)乙二胺(TED)、乙二胺、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、亚烷基二胺三乙酸、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、磷酸丝氨酸和1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)组成的群组中的至少一种。
7.如权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(a)之前对所述样品进行预处理。
8.如权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(d)之后对纯化的细胞外囊泡进行后处理。
9.如权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(a)中添加聚合物或盐析离子。
10.如权利要求9所述的方法，其中在添加所述阳离子之前、同时或之后添加所述聚合物或盐析离子。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚恶唑啉。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述聚恶唑啉是聚(2-甲基-2-恶唑啉)(PMOZ)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)(PEOZ)或聚(2-丙基-2-恶唑啉)(PPOZ)。
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