CN106824313A - 一种数字pcr芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种数字PCR芯片，包括盖片与玻璃基片贴合而成的液滴产生模块和与液滴产生模块一面紧贴的液滴收集模块，其中盖片上具有液相进样口和油相进样口这两个通孔，与玻璃基片贴合的盖片的一面上刻蚀有与液相进样口或油相进样口连通的微流沟道，两微流沟道分别分岔为两条分沟道，所述分沟道两两相交于液滴产生接口；液滴收集模块包括一两边开口的腔体，液滴产生接口均紧贴其中一个开口的内侧。本发明提供的数字PCR芯片具有独立的液滴收集模块，PCR反应和结果的观察都在芯片内进行，大大降低了被污染和破乳的可能性，同时PCR的结果置于荧光显微镜下统一观察，在芯片内不需要逐个进行的信号读取，大大缩短了信号读取时间。

Description

一种数字PCR芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)提出以来，核酸体外扩增和定量技术已发展成为分子生物学领域的一项核心技术。目前，以PCR为基础的核酸定量检测技术，因其分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点，成为疾病早期诊断的主要应用技术，并广泛应用于分子测序、基因表达分析、基因突变研究和药物筛选等其他研究领域。
美国ABI公司推出实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术及相关产品，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环产物量的变化，通过循环阈值(cycle threshold,Ct)和标准曲线对起始模板进行定量分析，将PCR由定性与半定量的体外合成技术发展成为高灵敏度、高特异性的，可对核酸进行相对定量的基因分析技术。发展至今，qPCR已经成为应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术，其准确度可达95％，但是，由于qPCR是一种核酸相对定量技术，对低倍差异的分辨能力不足，另外对于含量低于1％的微量突变的检测无能为力。
Vogeldtein和Kinzler提出了一种新的核酸定量技术——数字PCR(D-PCR)技术，该技术的原理是将一个样本稀释成几十到几万份，分配到不同的反应单元，使每个单元至多包含一个拷贝的目标分子(初始DNA模板)，在每个反应单元中进行单个拷贝DNA的PCR扩增，扩增结束后，对有荧光信号的单元进行计数，计数结果即为初始DNA模板的拷贝数。
根据数字PCR的原理，从实现途径上，数字PCR技术包括三个步骤：样品分散、PCR热循环、结果检测分析这三个环节。其中样品分散成大量均一的微单元是关键步骤，是dPCR技术检测敏感性以及绝对定量准确性的关键。根据样品分散方式的不同，现有的数字PCR技术可分为微流控芯片数字PCR技术和液滴数字PCR技术。
已经得到实际应用的微流控芯片数字PCR技术包括Fluidigm公司推出的BioMarkTMcdPCR系统、Life公司推出的QuantStudio 3D cdPCR系统和Bio-Rad公司推出QX200TMddPCR，这些系统分散能力有限，仅仅将10μL的PCR预混液分解成20000个液滴以内的液滴。
现有的液滴数字PCR技术包括Raindance公司推出RainDrop ddPCR系统。该系统通过单拷贝DNA和PCR反应需要的一些试剂包裹在一个液滴中，然后进行完整的PCR循环。该系统可将液滴分散成百万级的液滴，但是，该系统采用流式分析技术在流式细胞仪中对百万个液滴逐个进行分析，信号读取耗费时间长，导致检测周期长，整个检测过程时长可达3.5小时。此外，由于液滴需要转移至流式细胞仪中进行分析，转移过程很难避免污染和破乳的发生。另外，该系统产生液滴后收集进行PCR反应时，不是单层液滴排布，而是收集进一个样品槽内，会导致部分液滴融合，从而导致该系统液滴的均一性不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种数字PCR芯片及其制备方法，使得所提供的芯片在进行D-PCR检测时液滴信号读取速度快，检测周期短，避免污染和破乳，反应稳定，均一性高，密封良好。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种数字PCR芯片，其特征在于，包括液滴产生模块和与该液滴产生模块一面紧贴的液滴收集模块，其中液滴产生模块由盖片与玻璃基片贴合而成，盖片上具有两个通孔，分别为液相进样口和油相进样口，与玻璃基片相贴合的盖片的一面上刻蚀有与液相进样口或油相进样口连通的微流沟道，两微流沟道分别分岔为两条分沟道，所述分沟道两两相交于液滴产生接口；液滴收集模块包括一个两边开口的腔体，其中开口的宽度不小于两接口的连线长度或距离，且液滴产生接口均紧贴其中一个开口的边缘。
所述盖片和玻璃基片通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。
所述液滴产生接口为T字形。
所述液滴收集模块为由模具直接模塑成的腔体，或者为由至少一个由透明、疏水和耐高温材料薄片与玻璃基片粘合而成的腔体。
所述薄片下表面两侧有粘合剂，该粘合剂并与玻璃基片粘合。
所述粘合剂的厚度y与液滴产生模块中产生的液滴直径x的关系为x≤y≤2.5x。
所述薄片的尺寸为1cm×1cm到3cm×3cm。
所述薄片的材料为玻璃、PC或PMMA；所述粘合剂(3)为双面胶。
所述盖片的厚度为0.5mm到5mm；与液相进样口连通的微流沟道宽40～100μm，与油相进样口连通的微流沟道宽60～250μm，液滴产生接口宽度10～30μm，所有沟道高度20～30μm。
盖片的材料为PDMS或PMMA。
本发明还提供了一种制备权利要求1所述的数字PCR芯片的方法，具体步骤如下：
S1：制备具有微结构的硅片模具：根据设计的液滴产生模块的结构，绘制出所需的图形，制作胶片掩膜版；以硅片为衬底，通过光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀出微流沟道的阳模，得到具有微结构的硅片模具；
S2：在硅片模具上制备盖片1：1)在氟硅烷蒸汽中静置硅片模具，之后取出；2)在硅片模具上浇注盖片的材料的预聚物和固化剂混合物，加热固化，剥离盖片并在液相进样口和油相进样口处打孔；
S3：盖片和玻璃基片贴合在一起：将盖片和玻璃基片放入等离子清洗机中清洗改性，取出后迅速贴合在一起；
S4：紧贴液滴产生模块的出口制作一个具有两边开口的腔体的液滴收集模块。
步骤S4所述液滴收集模块制作方法为用粘合剂紧贴液滴产生接口固定玻璃薄片。
步骤S2所述PDMS的预聚物和固化剂的重量比为10：1，所述加热固化的温度在55℃到90℃，所述加热固化的时间为2小时。
本发明提供的数字PCR芯片具有独立的液滴收集模块，可将产生的液滴自动化导入到独立的收集腔体中，液滴在芯片中产生及收集和封装后，PCR反应和结果的观察都在芯片内进行，不需要将液滴转移至流式细胞仪中再逐个液滴进行信号读取，而是置于荧光显微镜下统一观察结果，检测过程在半小时以内，大大缩短了信号读取时间，从而缩短了检测周期；同时在芯片内直接进行的PCR反应和结果的观察，避免了将液滴转移至流式细胞仪的过程，大大降低了被污染和破乳的可能性。由于液滴收集模块采用玻璃材质，封闭效果好，由于上下双层玻璃有足够硬度实现液滴的单层排布，单层排布避免了液滴的融合，导致液滴更加均一稳定，在PCR反应过程中保持稳定。液滴产生模块和液滴收集模块的疏水材质加快了液滴生成速度。液滴产生模块的双液滴产生接口加快了液滴生成速度和液滴分解能力，提高了数字PCR检测的速度。
附图说明
图1a是本发明所述的dPCR芯片的整体结构示意图。
图1b是本发明所述的dPCR芯片的结构部件示意图。
图2是本发明所述dPCR芯片的液滴产生模块结构示意图。
图3是图1b所示本发明dPCR芯片的俯视结构示意图。
图4a是按照本发明的实施例，进样后收集模块的液滴(10×视野)。
图4b是按照本发明的实施例进行PCR反应后的液滴的荧光图(10×视野)。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。
如图1a和图1b所示，是根据本发明的一个优选实施例的数字PCR芯片，该数字PCR芯片包括液滴产生模块10和与该液滴产生模块10侧面紧贴的液滴收集模块20。
如图1a和图1b所示，液滴产生模块10由盖片1与玻璃基片2贴合而成。其中，该贴合是通过等离子体键合，是不可逆的，实现方式是将盖片1和玻璃基片2同时置于空气等离子体中进行改性处理后迅速贴紧，以完成不可逆的封接。该盖片1所用的材料可以为可以用来做微流控的所有材料如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等。这里，PDMS层厚度在0.5mm到5mm。
盖片1贴合在玻璃基片2上的面为微流控芯片的结构面，俯视如图1b所示的本发明dPCR芯片，可得到如图2所示的盖片1的微流控芯片结构面的结构图。盖片1的微流控芯片结构面由刻蚀在盖片1的液相进样口11、油相进样口12、与液相进样口11连通的微流沟道111、与油相进样口12连通的微流沟道121和位于盖片1同一侧面的两个角的两个T字接口14组成。其中，液相进样口11和油相进样口12均为盖片1的垂直通孔；由于玻璃基片2与盖片1贴合，刻蚀在盖片1上的微流沟道111和121分别与玻璃基片2贴合盖片1的表面构造出位于盖片1和玻璃基片2之间的中空空间，该空间即为进样管道；微流沟道111和121均分岔为两条分沟道，每个与液相进样口11连通的微流沟道111的分沟道均与一个与油相进样口12连通的微流沟道121的分沟道相交于T字接口14，该T字接口14为液滴出口。液滴产生模块的双T字接口加快了液滴生成速度和液滴分解能力，提高了数字PCR检测的速度。微流沟道111的宽B1为40～100μm，微流沟道121的宽B2为60～250μm，T字接口宽度B310～30μm，所有沟道高度H(垂直纸面方向)为20～30μm。从而，盖片1与玻璃基片2贴合后，样品分别从液相进样口11和油相进样口12进入，经分岔的进样管道在两个T字接口14处混合并产生液滴，两个T字接口14同时产生液滴，提高了样品的进样速度。
如图1a和1b所示，液滴收集模块20是由一块薄片4通过粘合在该薄片4两边的具有一定厚度的粘合剂3与玻璃基片2粘合而形成的腔体。由此，液滴收集模块20形成了一个玻璃基片2和薄片4之间的对称的两边封闭和两边未封闭的腔体，封闭的两边是薄片4固定双面胶的两边，剩下的两边均为未封闭。腔体高度(即粘合剂3的厚度)由PDMS液滴产生模块中产生的液滴大小所决定，若液滴直径为xμm，腔体高度为yμm，则x≤y≤2.5x。薄片4的材料为透明、疏水和耐高温材料，如玻璃、PC、PMMA等，优选为玻璃。由于液滴收集模块采用玻璃材质，封闭效果好，由于上下双层玻璃有足够硬度实现液滴的单层排布，单层排布避免了液滴的融合，导致液滴更加均一稳定，在反应过程中保持稳定。该液滴收集模块20还可以利用模具直接塑成腔体，或者利用多块此类型材料使用粘附性胶体或者粘附性固体物质粘制而成。
如图3所示，在收集模块20未封闭的两边中选择一边与液滴产生模块10的后端紧密贴合，其中两双面胶3的内侧的边31与液滴产生模块10紧贴液滴收集模块20的边垂直，且边31的顶点紧贴T字接口14，即液滴收集模块20的腔体内壁紧贴液滴产生模块10的液滴出口，以保证液滴产生模块产生的液滴可以由液滴产生模块10沿液滴收集模块20的腔体内壁流入液滴收集模块20而不漏出。
本发明提供的数字PCR芯片的工作原理如下。如图1a、图1b和图2所示，液滴产生模块10的液相进样口11和油相进样口12分别放入样品和油相，核酸样本和矿物油在疏水材料的表面张力下通过液滴产生模块10产生油包水液滴。液滴在疏水材料的表面张力以及液相进样口11和油相进样口12处施加的压强的作用下由入口向出口铺展，液滴产生模块和液滴收集模块的疏水材质加快了液滴生成速度，该液相进样口11和油相进样口12处的压强影响着液滴产生的大小和速度，由此，分别加以可以调控的压强，对液滴大小和产生速度进行精确控制。产生的液滴进入液滴收集模块20并自动充满整个收集腔体后，对芯片，即液滴收集模块20封装。封装完成后，直接将芯片置于原位仪或PCR仪器上进行反应，待反应完成后，在荧光显微镜下对芯片结果进行读取和分析。本发明提供的数字PCR芯片具有独立的液滴收集模块20，可将产生的液滴自动化导入到独立的收集腔体中，液滴在芯片中产生及收集和封装后，PCR反应和结果的观察都在芯片内进行，芯片置于荧光显微镜下统一观察结果，无需将液滴转移至流式细胞仪中再逐个液滴进行信号读取，大大缩短了信号读取时间，从而缩短了检测周期；同时在芯片内直接进行的PCR反应和结果的观察，避免了将液滴转移至流式细胞仪的过程，大大降低了被污染和破乳的可能性。
实施例一
上述数字PCR芯片的制备，具体步骤如下：
S1：制备具有微结构的硅片模具：
根据设计的液滴产生模块的结构，利用AutoCAD软件绘制出所需的图形，制作胶片掩膜版；以四寸单晶硅片为衬底，通过光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀出高度30μm的微流沟道111、121的阳模，得到具有微结构的硅片模具。
S2：在硅片模具上制备PDMS盖片1：
(1)在硅片表面沉积一层有机物：将硅片模具和装有5μL到20μL氟硅烷的敞口离心管置于真空干燥箱中，抽真空至0.8psi到1psi范围的负压，使氟硅烷汽化，模具在氟硅烷蒸汽中静置5-6小时。在通风处，将干燥箱打开，通风1小时后，将硅片取出。这一步的目的是在硅片表面沉积一层有机物，便于后续数字PCR芯片的制作。
(2)在硅片模具上浇注PDMS，加热固化，剥离PDMS并打孔：
按照重量比10：1分别称量PDMS预聚物和固化剂，然后混合并搅拌均匀，置于真空干燥箱中抽真空，静置30min。待PDMS基本没有气泡后，将其浇注在硅片模具上，静置30min，然后，将其放入烘箱加热2小时。该烘箱温度设定在55℃到90℃之间，优选为65℃。最后将固化好的PDMS层从模具上剥离下来。使用打孔机在液相进样口11和油相进样口12处对该PDMS层打孔。
S3：PDMS盖片1和玻璃基片2贴合在一起：
将PDMS盖片1和玻璃基片2放入等离子清洗机中清洗45s，盖片1和玻璃基片2同时置于空气等离子体中发生改性，取出后迅速贴合在一起，实现不可逆的封接，完成了液滴产生模块制作。
S4：紧贴PDMS盖片的出口制作液滴收集模块20：
用厚度30μm的粘合剂3紧贴液滴产生模块10的两个出口(即T字接口14处)固定一块玻璃薄片4，完成液滴收集模块20的腔体。玻璃薄片4的尺寸为1cm×1cm到3cm×3cm。
使用上述数字PCR芯片进行样品检测，具体步骤如下：
首先配制PCR反应液，里面含有上游引物(0.5μL)、下游引物(0.5μL)、探针(0.5μL)、DEPC水(2.5μL)和DNA模板(1μL)，混合入2×480(5μL)反应体系共计10μL，所用的上游引物、下游引物和探针如表1所示，引物和探针由上海占标生物科技有限公司根据设计合成，所用的DNA模板为包含人类表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)基因第19号外显子基因序列的pGEM质粒。质粒采用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen)抽提纯化自2mL大肠杆菌培养液，用Quant-iTTM dsDNA Kits(美国Invitrogen公司)定量并稀释成浓度为1×101到1×106拷贝/μL溶液，-20℃储存备用。本实验所用模板浓度为104拷贝/μL。
表1引物及探针序列
配制好的PCR混合液放入进样口，矿物油放入进油口，两边分别加压(0.010MPa-0.020MPa)，精确控制液滴产生速度和大小，待液滴充满液滴收集模块的腔体，直接用刀片切除盖片1以去除液滴产生模块10，收集模块前后用含油的液相PDMS手动封装后，放入原位仪进行反应。PCR反应完成后，取出芯片直接置于显微镜下观察结果(如图4a、图4b所示)，从这两个图片中可以得出封装的液体的均一性较高，且在显微镜视野下一次可以分析多个液滴。其中，封装液滴收集模块的材料为可以快速固化或者高温后迅速固化的液体，或者为未固化的含一定量矿物油的PDMS(一定比例的PDMS单体(A)、PDMS固化剂(B)和矿物油)，以避免PDMS吸油会导致腔体内矿物油减少，液滴不稳定。其中，PDMS单体(A)：PDMS固化剂(B)：矿物油的质量比可以在10:1:1到10:1:4之间，优选为10:1:2。D-PCR芯片液滴的封装所使用的材料既可以快速固化或者高温后迅速固化，由不吸油或者需要进行掺油处理。
本发明提供的液滴式数字PCR芯片进样时间为15～30min，进样完成后直接将芯片置于原位仪上进行PCR反应，反应完成后直接置于荧光显微镜下观察结果，无需将液滴转移至流式细胞仪中再逐个液滴进行信号读取，大大缩短了信号读取时间，从而缩短了检测周期，同时避免了将液滴转移至流式细胞仪的过程，大大降低了被污染和破乳的可能性。

Claims (13)

1.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括液滴产生模块(10)和与该液滴产生模块(10)一面紧贴的液滴收集模块(20)，其中
液滴产生模块(10)由盖片(1)与玻璃基片(2)贴合而成，盖片(1)上具有两个通孔，分别为液相进样口(11)和油相进样口(12)，与玻璃基片(2)相贴合的盖片(1)的一面上刻蚀有与液相进样口(11)或油相进样口(12)连通的微流沟道(111)、(121)，两微流沟道分别分岔为两条分沟道，所述分沟道两两相交于液滴产生接口(14)；
液滴收集模块(20)包括一个两边开口的腔体，其中开口的宽度不小于两接口(14)的连线长度或距离，且液滴产生接口(14)均紧贴其中一个开口的内侧。
2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述盖片(1)和玻璃基片(2)通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。
3.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述液滴产生接口(14)为T字形。
4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述液滴收集模块(20)为由模具直接模塑成的腔体，或者为由至少一个由透明、疏水和耐高温材料薄片(4)与玻璃基片(2)粘合而成的腔体。
5.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述薄片(4)下表面两侧有粘合剂(3)，该粘合剂(3)并与玻璃基片(2)粘合。
6.根据权利要求5所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述粘合剂(3)的厚度y与液滴产生模块中产生的液滴直径x的关系为x≤y≤2.5x。
7.根据权利要求5所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述薄片(4)的尺寸为1cm×1cm到3cm×3cm。
8.根据权利要求5所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述薄片(4)的材料为玻璃、PC或PMMA；所述粘合剂(3)为双面胶。
9.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，所述盖片(1)的厚度为0.5mm到5mm；与液相进样口(11)连通的微流沟道(111)宽40～100μm，与油相进样口(12)连通的微流沟道(121)宽60～250μm，液滴产生接口宽度10～30μm，所有沟道高度20～30μm。
10.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，其特征在于，盖片(1)的材料为PDMS或PMMA。
11.一种制备权利要求1所述的数字PCR芯片的方法，具体步骤如下：
S1：制备具有微结构的硅片模具：根据设计的液滴产生模块的结构，绘制出所需的图形，制作胶片掩膜版；以硅片为衬底，通过光刻和深反应离子刻蚀，刻蚀出微流沟道(111)、(121)的阳模，得到具有微结构的硅片模具；
S2：在硅片模具上制备盖片1：1)在氟硅烷蒸汽中静置硅片模具，之后取出；2)在硅片模具上浇注盖片(1)的材料的预聚物和固化剂混合物，加热固化，剥离盖片(1)并在液相进样口(11)和油相进样口(12)处打孔；
S3：盖片(1)和玻璃基片(2)贴合在一起：将盖片(1)和玻璃基片(2)放入等离子清洗机中清洗改性，取出后迅速贴合在一起；
S4：紧贴液滴产生模块(10)的出口制作一个具有两边开口的腔体的液滴收集模块(20)。
12.根据权利要求11所述的数字PCR芯片的制备方法，其特征在于，步骤S4所述液滴收集模块(20)制作方法为用粘合剂(3)紧贴液滴产生接口(14)固定玻璃薄片(4)。
13.根据权利要求12所述的数字PCR芯片的制备方法，其特征在于，步骤S2所述PDMS的预聚物和固化剂的重量比为10：1，所述加热固化的温度在55℃到90℃，所述加热固化的时间为2小时。
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