CN110193387A - 一种全封闭微流控芯片和乳液微滴制备系统 - Google Patents
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Abstract
一种全封闭微流控芯片和乳液微滴制备系统,属于生化设备技术领域,其特征是:微流控芯片包括乳液微滴生成结构和PCR结构,乳液微滴生成结构和PCR结构一体化地整合在一个芯片单元中,乳液微滴生成结构用于由油相和样品水相产生油包水乳液微滴,PCR结构为封闭式结构。有益效果是:1、乳液微滴生成结构和PCR结构两部分结构整合在一个单元中,一体化设计降低了对操作者的专业要求,有利于技术的快速推广。2.减少了PCR引入污染的可能性。提高了数字PCR检测的准确性。3.可以避免气溶胶的污染。4、保证了PCR过程中乳液微滴避免受到破坏。5、控制仪器可以具有多个(例如两个)用于设置微流控芯片的工作位。6.简化操作,节约时间,提高了效率。
Description
本申请是分案申请,其原申请的中国国家申请号为201811200046.2,申请日为2018年10月16日,发明名称为“一种全封闭微流控芯片和乳液微滴制备系统”。
技术领域
本发明属于生化试验检测设备技术领域。
背景技术
数字PCR技术利用油包水结构的乳液微滴作为PCR反应的微反应器,进行PCR扩增。数字PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行PCR扩增。油-水两相生成的微乳液微滴已经应用于高通量的分析系统,其应用范围有不断扩大的趋势。比如将乳液微滴形成用于聚合酶链式反应(PCR)结合,在微滴里进行核酸靶分子的单拷贝的放大,从而实现对靶的单分子的存在和具体基因序列的检测。美国公司10X Genomics应用乳液微滴PCR的方法并结合Gemcode技术来生成长链DNA,从而实现了长链DNA序列测序或单细胞测序,已经被业界公认是进行长链DNA测序和单细胞测序的最好技术之一。而能够把油-水两相按设计的比例混合生成大小可控、均一稳定的微乳液微滴的形成系统也成为了实现上述应用的关键设备。
现有的乳液微滴形成系统主要采用Bio-Rad的微流控芯片,例如参见中国专利申请公开CN103429331A,其通过加载在液滴收集的孔上的负压提供动力生成液滴,具体而言,油和样品在负压下分别从装油和装样品的样品孔进入微流控管道,最后流向液滴收集的孔。乳液微滴全部堆积在收集孔中,就完成了微滴的制备。当需要进行数字PCR扩增时,需要用移液枪将乳液微滴取出,注入到96孔板中,再进行PCR扩增。当在进行结果读取时,需要将乳液微滴从96孔板中取出,在上述过程中会造成乳液微滴的破损以及乳液微滴的移动损失,甚至气溶胶的污染,造成假阳性,影响测量效果的准确性。
发明内容
本发明的目的是:提供一种全封闭微流控芯片和乳液微滴制备系统,它使乳液微滴生成结构和PCR结构一体化地整合在一个芯片单元中,乳液微滴生成结构用于由油相和样品水相产生油包水乳液微滴,PCR结构用于接收和平铺所产生的乳液微滴以及随后全封闭进行乳液微滴数字PCR,乳液微滴生成结构中的乳液微滴生成口与所述PCR结构的乳液微滴引进口直接相连,以使所产生的乳液微滴直接流入PCR结构中平铺备用,从而使乳液微滴的制备、接收、平铺和乳液微滴数字PCR以全封闭的方式进行。
本发明的技术方案是:微流控芯片包括乳液微滴生成结构和数个至数十个PCR结构,乳液微滴生成结构用于由油相和样品水相产生油包水乳液微滴,PCR结构为封闭式结构,用于接收和平铺所产生的乳液微滴以及随后全封闭进行乳液微滴数字PCR,乳液微滴生成结构中的乳液微滴生成口经由歧管而直接与数个至数十个PCR结构的乳液微滴引进口相连,以使所产生的乳液微滴经由歧管导流后流入各PCR结构中平铺备用,从而使乳液微滴的制备、接收、平铺和乳液微滴数字PCR以全封闭的方式进行。
油相引进口和样品引进口均通过相应管道与用于产生乳液微滴的生成器连接,从而产生乳液微滴,所产生乳液微滴的出口孔与PCR结构的乳液微滴引进口直接相连。在所述油相引进口设置有压力调节装置,给予芯片一定的压力使油滴与样品均沿相应管道运动,并且油相包裹住核酸形成油包水型乳液微滴,最终在压力作用下,运动至PCR结构的微滴收集腔体,多余液体被多余液体处理装置处理。在乳液微滴流入PCR结构后取下乳液微滴生成结构部分,并及时用预留的封口膜将PCR结构部分的乳液微滴引进口密封。
用于微滴数字PCR的乳液微滴制备系统,包括用于乳液微滴生成的控制仪器和本发明的集乳液微滴制备及数字PCR功能一体化的微流控芯片。所述的乳液微滴生成的控制仪器包括两个乳液微滴生成位、控制屏幕。所述的乳液微滴生成位可放置微流控芯片,乳液微滴生成的控制仪器单次生成单一芯片的乳液微滴,两个乳液微滴生成位独立工作。所述的控制屏幕为触控显示屏。
所述乳液微滴生成结构和所述PCR结构一体化地且可分离地耦合。
所述乳液微滴生成结构和所述PCR结构采用粘合剂连接。
所述乳液微滴生成结构包括油相引进口和样品引进口,它们各自通过管道与用于产生乳液微滴的乳液微滴生成器连接,从而产生乳液微滴。
所述乳液微滴生成结构的长度5-10mm,宽度是20-30mm。
所述PCR结构内部包括用于平铺乳液微滴的微滴收集腔体。
所述微滴收集腔体的高度大于或等于0.5倍微滴直径并且小于或等于1.5倍微滴直径,优选大于或等于0.8倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径,从而使乳液微滴平铺在所述微滴收集腔体中。
所述微滴收集腔体的容积为10μL-60μL,优选40μL。
在控制仪器内部底板上分别安装有压缩泵、储气瓶、电源模块、阀门列阵和控制电路,控制仪器高面平台安装有电容式触控屏,低面平台安装有一至数个用来固定微流控芯片并形成密封的芯片压板,在低面平台上为半透明保护罩,在半透明保护罩的压盖板上分别开有与微流控芯片油相引进口紧密相连的接口A、开有与微流控芯片样品引进口紧密相连的接口B、与微流控芯片通气孔紧密相连的接口C,在所述的接口A、接口B能施加压力或者与空气联通;接口C能施加负压或者与空气联通;压盖板侧边安装有压盖转轴和管路连接处,通过压缩泵能够构造成控制一至数个微流控芯片生成乳液微滴。
本发明的有益效果是:
1、本发明的微流控芯片为一体化设计,乳液微滴生成结构和PCR结构两部分结构整合在一个单元中,通过该自主设计的仪器控制一体化设计的芯片生成平铺乳液微滴,在后续的检测中无需将乳液微滴从该芯片中移出,只需拆下乳液微滴生成结构,用封口膜将PCR结构的样品引进口进行密封,然后就可以直接对PCR结构(例如PCR芯片)进行PCR扩增操作,并可以对PCR扩增后的芯片直接进行检测。一体化设计降低了对操作者的专业要求,有利于技术的快速推广。
2.乳液微滴的制备、平铺过程为全封闭运行过程,不与外界环境接触,从而减少了为后续数字PCR引入污染的可能性,特别是避免了可能给PCR过程中带来的气溶胶污染。具体而言,在利用本发明的一体化微流控芯片进行乳液微滴制备后,乳液微滴直接流入PCR结构部分中,无需使用移液枪将乳液微滴取出。因此不存在乳液微滴取出、注入的过程,避免了乳液微滴的破损、乳液微滴移动损失及气溶胶污染等,从而减少假阳性,提高了数字PCR检测的准确性。
3.本发明的微流控芯片中的PCR结构也是封闭式的,从而保证乳液微滴的制备、接收、平铺和乳液微滴数字PCR以全封闭的方式进行。在现有技术的乳液微滴PCR设备中,例如来自Bio-Rad公司的市售乳液微滴PCR设备,用于制备乳液微滴的微流控芯片和用于进行PCR反应的PCR芯片是分离的。当需要进行PCR扩增时,需要用移液枪将乳液微滴从微流控芯片取出,然后注入PCR芯片的孔。而乳液微滴为油包水系统,在PCR的变性、退火、延伸循环中经历多次升温降温过程,因此可能有少量的乳液微滴破裂,释放出含扩增产物的气溶胶,对后续实验造成污染,甚至有可能导致整个实验室的污染。而本发明的PCR结构是全封闭式的,因此可以避免气溶胶的污染。
4、通过封口膜密封住连接管道,保证了PCR过程中乳液微滴避免受到破坏。
5、控制仪器可以具有多个(例如两个)用于设置微流控芯片的工作位,每个工作位可以单独或同时工作,从而提升了乳液微滴的制备效率。
6.由于消除了使用移液枪将乳液微滴取出再注入到PCR芯片板上的过程,可以简化操作,节约时间,提高了效率。此外,可用的微滴获得率提升5%以上。
7.微滴收集腔体的高度大于或等于0.5倍微滴直径并且小于或等于1.5倍微滴直径,从而保证所生成的乳液微滴不叠置,能够更好地平铺在腔体中。此外,进一步优选的是微滴收集腔体的高度大于或等于0.8倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径,这样能够获得更好的微滴彼此隔离效果。据推测这是因为如果微滴收集腔体的高度处于上述范围,能够减少微滴油相的流动性,使得平铺后微滴之间的界面更加清晰。
8.使用本发明的微流控芯片和乳液微滴制备系统,可以极大地降低乳液微滴数字PCR的成本。在实际运行中,在本发明的微流控芯片包括一个乳液微滴生成结构和一个PCR结构的情况下,本发明的乳液微滴数字PCR的成本即仅为使用市售Bio-Rad公司和RainDance公司的微流控芯片数字PCR使用成本的1/5。而在本发明的微流控芯片包括一个乳液微滴生成结构和经由歧管与所述乳液微滴生成结构连接的多个PCR结构的情况下,乳液微滴数字PCR的成本更是可以降低至市售微流控芯片数字PCR使用成本的1/10以下,甚至更低。
附图说明
图1是本发明的乳液微滴制备系统的控制仪器的外观示意图。
图2是本发明的乳液微滴制备系统的控制仪器的内部结构示意图。
图3是本发明的乳液微滴制备系统的控制仪器的上盖示意图
图4是本发明的微流控芯片的整体外观示意图。
图5是本发明的微流控芯片的截面图。
图6是本发明的微流控芯片的原理图。
图7A是乳液微滴生成后的平铺效果;当微滴收集腔体的高度大于或等于0.8倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径时。
图7B是乳液微滴生成后的平铺效果;当微滴收集腔体的高度大于微滴直径且小于或等于1.5倍微滴直径时。
具体实施方式
实施例1
下面结合附图对本发明做进一步描述:
如图4、5、6所示,1是电容式触控屏、2是LED指示灯、3是半透明保护罩、4是芯片压板、5是整体外壳、6是压缩泵、7是储气瓶、8是电源模块、9是阀门列阵、10是控制电路、11是与油相引进口紧密相连的接口A、12是与样品引进口紧密相连的接口B、13是与通气孔紧密相连的接口C、14是压盖转轴、15是管路连接处。
如图1、2、3所示,16是乳液微滴生成结构区、17是PCR结构区、18是油相引进口管道、19是油相引进口、20是样品引进口、21是腔体、22是封口膜、23是微滴收集腔体、24是通气孔、25是多余液体处理装置、26是样品引进口管道。
本发明揭示了一种用于数字PCR的乳液微滴制备系统,其包括至少一个本发明的微流控芯片和用于乳液微滴生成的控制仪器。在一个实施方式中,所述控制仪器如图1、2所示,设备采用电容式触控屏1,用来进行操作过程的人机互动,包括控制、设置、数据操作以及状态观察;LED指示灯2,用来指示机器的基本运行状态,如:通电、待机、运行、故障等;半透明保护罩3,上样时会自动滑开;芯片压板4,用来固定微流控芯片并形成密封;整体外壳5,采用钣金+塑料的方式,以保证仪器的功能性和密封性。仪器工作时半透明保护罩关闭,在保护用户安全和避免样品污染的同时,便于仪器工作情况的观察。
控制仪器内部模块布局如图2所示,样机内部由压缩泵6、储气瓶7、电源模块8、阀门列阵9和控制电路10构成。
数字PCR的乳液制备系统工作过程:电源模块8为整个系统提供电能,打开半透明保护罩3,将芯片装载于卡盘上并通过芯片压板4进行固定,关闭半透明保护罩3,控制电路10通过电容式触控屏1来接收操作人员的指令,控制压缩泵6的开启与关闭,控制阀门列阵9来决定相应通道的工作状态,储气瓶7用来提供气体,输出压力作用于芯片;最后通过观察LED指示灯2判断乳液制备是否完成。
控制仪器盖上后示意图如图3所示,其包括与微流控芯片油相引进口紧密相连的接口A11;与微流控芯片样品引进口紧密相连的接口B12,接口A、接口B12可以施加压力或者与空气联通;与微流控芯片通气孔紧密相连的接口C13,可以在接口C13处可以施加负压或者与空气联通;压盖转轴14;和管路连接处15。压缩泵6可以构造成控制一个微流控芯片生成乳液微滴,也可以构造成同时控制多个微流控芯片生成乳液微滴。
微流控芯片的整体外观如图4所示,包括乳液微滴生成结构区16和PCR结构区17,PCR结构即为PCR芯片。
微流控芯片的横截面图如图5所示,包括下述组件:油相引进口19;样品引进口20;乳液微滴生成口与PCR芯片的乳液微滴引进口直接相连形成腔体21,以便于制备的乳液微滴可以顺利的直接流入PCR芯片中;微滴收集腔体23,用来平铺乳液微滴;通气孔24,其与芯片压板4相连;多余液体处理装置25,以处理多余液体。此外,收集完成后拆下乳液微滴生成部分,可以用封口膜22对PCR结构的样品引进口进行密封。
所述微流控芯片原理如图6所示,各部分与图6横截面图中各部分相对应。所述油相引进口和样品引进口均通过相应管道与与用于产生乳液微滴的生成器连接,从而产生乳液微滴,所产生乳液微滴的出口孔与PCR结构的乳液微滴引进口直接相连。在所述油相引进口设置有压力调节装置,给予芯片一定的压力(可以为正压或负压)使油滴与样品均沿相应管道运动,并且油相包裹住核酸形成油包水型乳液微滴,最终在压力作用下,运动至PCR结构的微滴收集腔体,多余液体被多余液体处理装置处理。在乳液微滴流入PCR结构后取下乳液微滴生成结构部分,并及时用预留的封口膜将PCR结构部分的乳液微滴引进口密封。
本发明的乳液微滴制备系统具体操作如下:首先开启乳液微滴生成的控制仪器,仪器的半透明保护罩自动滑开,然后将所述微流控芯片装备在卡盘上,压好芯片压板,将保护罩合拢,开始制备乳液微滴,乳液微滴制备完成后,保护罩自动滑开,打开芯片压板,取下微流控芯片,拆下微流控芯片上的乳液微滴生成结构部分,并用预留的封口膜及时将PCR结构样品入口密封,这样就完成了乳液微滴生成,可以直接用该PCR结构进行后续数字PCR及检测了。
应用所述的用于数字PCR的乳液微滴制备系统,乳液微滴生成后的平铺效果如图7的A、B所示,当微滴收集腔体的高度为大于或等于0.5倍微滴直径并且小于或等于1.5倍微滴直径时,生成的乳液微滴平铺在PCR结构中的微滴收集腔体内,且都不发生融合、破裂、损失或者叠层的现象。此外,发明人进一步惊奇的发现,当微滴收集腔体的高度大于或等于0.5倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径,优选大于或等于0.8倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径时,与微滴收集腔体的高度大于微滴直径的情况相比,能够减少微滴油相的流动性,使得平铺后微滴之间的界面更加清晰。这从图7中的A、B小图的对比可以明显地看出。在A中,乳液微滴生成器生成的乳液微滴的直径为大约104μm,所采用的微滴收集腔体的高度为约100μm;而在B中,微滴收集腔体的高度为约120μm。
在本发明的另一个实施方式中,微流控芯片也可以包括一个乳液微滴生成结构16和经由歧管与乳液微滴生成结构区16连接的多个PCR结构区17。歧管与乳液微滴生成结构以及多个PCR结构区17可以是流体连通的。例如歧管可以提供与PCR结构区17的数量相同的端口,各端口分别与各PCR结构区17的乳液微滴引进口相连,从而将乳液微滴生成结构区16生成的乳液微滴导入各个PCR结构区17。
Claims (10)
1.一种全封闭微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片包括乳液微滴生成结构和PCR结构,所述乳液微滴生成结构和PCR结构一体化地整合在一个芯片单元中,所述乳液微滴生成结构用于由油相和样品水相产生乳液油包水微滴,所述PCR结构用于接收和平铺所产生的乳液微滴以及随后全封闭进行乳液微滴数字PCR,所述乳液微滴生成结构中的乳液微滴生成口与所述PCR结构的乳液微滴引进口直接相连,以使所产生的乳液微滴直接流入PCR结构中平铺备用,从而使乳液微滴的制备、接收、平铺和乳液微滴数字PCR以全封闭的方式进行。
2.一种全封闭微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片包括乳液微滴生成结构和数个至数十个PCR结构,乳液微滴生成结构用于由油相和样品水相产生油包水乳液微滴,PCR结构为封闭式结构,用于接收和平铺所产生的乳液微滴以及随后全封闭进行乳液微滴数字PCR,乳液微滴生成结构中的乳液微滴生成口经由歧管而直接与数个至数十个PCR结构的乳液微滴引进口相连,以使所产生的乳液微滴经由歧管导流后流入各PCR结构中平铺备用,从而使乳液微滴的制备、接收、平铺和乳液微滴数字PCR以全封闭的方式进行。
3.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述乳液微滴生成结构和所述PCR结构一体化地且可分离地耦合。
4.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述乳液微滴生成结构和所述PCR结构采用粘合剂连接。
5.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述乳液微滴生成结构包括油相引进口和样品引进口,它们各自通过管道与用于产生乳液微滴的乳液微滴生成器连接,从而产生乳液微滴。
6.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述乳液微滴生成结构的长度5-10mm,宽度是20-30mm。
7.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述PCR结构内部包括用于平铺乳液微滴的微滴收集腔体。
8.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述微滴收集腔体的高度大于或等于0.5倍微滴直径并且小于或等于1.5倍微滴直径,优选大于或等于0.8倍微滴直径并且小于或等于1倍微滴直径,从而使乳液微滴平铺在所述微滴收集腔体中。
9.如权利要求1或2所述的一种全封闭微流控芯片,其特征是:所述微滴收集腔体的容积为10μL-60μL。
10.一种全封闭微流控芯片的乳液微滴制备系统,其特征是:用于微滴数字PCR的乳液微滴制备系统,包括用于乳液微滴生成的控制仪器和集乳液微滴制备及数字PCR功能一体化的微流控芯片;所述的乳液微滴生成的控制仪器包括两个乳液微滴生成位、控制屏幕;所述的乳液微滴生成位可放置微流控芯片,乳液微滴生成的控制仪器单次生成单一芯片的乳液微滴,两个乳液微滴生成位独立工作;所述的控制屏幕为触控显示屏,所述微流控芯片是权利要求1或2所述的全封闭微流控芯片。
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