CN102243151B - 零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置，具体地说是在毛细管电泳分离柱后连接零死体积中空纤维膜反应器，荧光衍生化试剂透过膜进入系统，直接对蛋白质、多肽等样品进行在线衍生，产物通过反应器后的激光诱导荧光检测器进行检测。本发明的特点在于：利用中空纤维膜反应器实现了对微量(甚至痕量)蛋白质、多肽等样品的在线荧光衍生，克服了离线衍生过程样品损耗大、操作繁琐、耗时长等缺点，相比其他在线反应器也显示出了死体积小、试剂用量少、衍生温度和时间可调控等优势，而且装置成本低廉、功能多样、操作便捷、运行稳定，具有广阔的应用前景。

Description

零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置

【技术领域】

本发明涉及毛细管电泳分离技术及荧光检测技术领域，具体地说，是一种零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)在线衍生装置的制作及其使用方法。

【背景技术】

作为一类重要的生命活性物质，对蛋白质、多肽等样品进行特异性辨识及检测对研究生命的起源和进化，生物的新陈代谢和遗传等具有十分重要的意义。毛细管电泳(CE)以其多样的分离模式、高效、快速等特征，已俨然成为蛋白质、多肽类样品的最重要、最有效分析方法之一。激光诱导荧光检测器(LIF)的引入，在毛细管电泳检测发展史中具有里程碑式的意义，它克服了由于毛细管光程短而导致检测灵敏度不高的缺陷，使分析灵敏度提升近3～4个数量级，而今CE-LIF已被广泛应用于低浓度复杂生物样品的分离分析检测。

然而，许多天然蛋白质、多肽等样品本身并不具有荧光特性或自身荧光强度很微弱，需要使用荧光试剂对其进行衍生，因此如何构建理想的装置、选择合适的方法提升衍生和检测效率就成了实现对此类样品高效分析的关键之一。

目前常用的衍生方法主要分为柱前(离线)、柱上(在线)和柱后(在线)反应三类：柱前衍生因其操作简单，可降低衍生反应对检测的干扰故而使用较广。但柱前衍生对样品量有一定要求，且低浓度样品在离线操作过程中也极易损失或引入不必要的杂质；近来有课题组报道采用柱内反应，即利用衍生化试剂和目标分析物迁移速率不同，使两者在毛细管内迁移过程中形成交错界面完成衍生，但该法的局限性在于反应接触时间极为短暂，衍生效率较低，不适用于复杂样品。常规的柱后衍生装置(如鞘流池、切换阀等)不仅对仪器微加工要求高，而且样品被高倍数稀释，同时短暂的接触时间也要求衍生反应要在瞬时完成，发展存在瓶颈。纤维膜在线衍生反应器的构建可有效解决上述问题。

2003年，张玉奎课题组利用中空微透析纤维膜构建二维毛细管电泳串联接口，利用膜高效的传质作用实现了等电聚焦与凝胶电泳、区带电泳等不同分离模式间的介质过渡【Chun Yang，Hechun Liu，Qing Yang，Lingyi Zhang，Weibing Zhang，Yukui Zhang.On-Line Hyphenation of CapillaryIsoelectric Focusing and Capillary Gel Electrophoresis by a DialysisInterface.Anal.Chem.2003，75，215-218】；2010年他们又将膜接口技术成功应用于在线样品基质溶液交换、蛋白富集及酶解，并取得较为理想的结果。【LiangLiang Sun，Junfeng Ma，Xiaoqiang Qiao，Yu Liang，Guijie Zhu，Yichu Shah，Zhen Liang，Lihua Zhang，Yukui Zhang.Integrated Devicefor Online Sample Buffer Exchange，Protein Enrichment，and Digestion.Anal.Chem.2010，82，2574-2579】；同年，有文献报道在毛细管进样口和检测窗口之间设置一段长3-5mm的纤维膜，构建了毛细管电泳与化学发光联用接口装置【刘海燕，韩宁，杜一平，张维冰.含有中空纤维膜的毛细管电泳及化学发光联用的接口装置.CN 101782504A】。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一、零死体积CE-LIF在线衍生装置具体制作步骤为：

1.膜的选取：根据被分析物及衍生试剂亲水性/疏水性选取聚砜膜、醋酸纤维素膜或其他微透析膜；根据目标分析物分子量选取透析膜的截留分子量(一般介于1000～100000Da不等，小于被分析物分子量，使目标分析物得以无损失地保留在膜内)；膜长决定了被分析物与衍生试剂反应接触时间，可根据样品迁移速率及试剂衍生反应速率调节，从3mm～30cm均可实现，但需同时考虑高压源加压情况。

2.毛细管的选取：从进样端至其与纤维膜接口处的弹性石英毛细管为分离毛细管，对复杂样品进行第一阶段的分离，使样品中各成分尽可能以单一成分形式分别被衍生，从而排除杂质或基底对目标分析物，以及几个目标分析物彼此之间的干扰。分离毛细管内径及长度的选择及分离条件的优化主要取决于样品性质，为求更好的分离度，也可对分离毛细管内部进行涂覆改性。

从纤维膜另一端接口处至检测器窗口处的毛细管为检测毛细管。因反应位点不同，对同一物质衍生可能生成不止一种产物，故此段毛细管可将同一物质衍生反应生成的主、副产物进行分离。检测毛细管内径取决于激光诱导荧光检测器聚焦范围(50～540μm)，长度主要取决于反应后各产物之间的分离情况。

3.纤维膜与毛细管连接端口的制作：将毛细管、纤维膜两端切割平齐；用内径小于毛细管及中空纤维膜内径的金属丝/动植物纤维/玻璃纤维穿入，起支撑作用；将毛细管与中空纤维膜接口平整对齐后涂胶，待粘结剂基本固化后，将金属丝/动植物纤维/玻璃纤维完整抽出，让接口处粘结剂彻底晾干。

4.在线衍生反应套管的制作：从内径为0.5～50mm，外径为0.6～60mm各种规格的聚四氟乙烯套管中选取与衍生体系匹配的三段，其中一段为储液管(横向放置)，长度以能浸没接口两端及纤维膜为下限。在其前方及后方合适位置各开一口，切口直径恰与另两段聚四氟乙烯管直径相吻合。将切割好的另两段聚四氟乙烯管插入切口，其中位于储液管前方的为出料管/泄压管；位于储液管后方的为加料管/加压管，三管保持液体/气体连通密封。本在线衍生反应套管可清洗并可重复使用。

5.在线衍生反应器的组建：将之前制得的分离毛细管-中空纤维膜-检测毛细管接口置于在线反应套管内，同时为防止漏液和漏压，可用硅胶垫制成管套盖将各管端口加盖密封。

二、CE-LIF在线衍生装置在使用过程中控温、控压、换液等功能的实现方法为：

将上述纤维膜及接口置于在线衍生反应套管中，向储液管内注入含一定浓度衍生化试剂的电解质溶液(浸没接口两端及纤维膜)，利用膜的微透析特性让荧光衍生化试剂渗透进入膜内部与目标分析物反应。小于纤维膜截留分子量的试样、基底介质、荧光试剂及反应副产物可通过扩散自由进出膜内外，在一定程度上被稀释，从而降低对检测的干扰；而目标分析物及其衍生反应产物因大于膜的截留分子量而得以保留在膜内，无损耗。

可同时连通套管后方的加料口及前方的出料口，向套管内补充或更换衍生化试剂，确保衍生反应顺利进行。如向套管内通加热升温后的衍生化试剂(对于昂贵的衍生化试剂可循环利用，以降低实验成本)或将整套装置密封后置于恒温水浴槽中，就可以满足反应对温度的要求。同时可通过注液或通气等方式增加在线反应套管内的压力(以不使毛细管内液体返流为限)，从而使荧光试剂更易进入膜内与目标反应物反应。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)本发明首次将纤维膜用于对蛋白质、多肽等样品的在线衍生反应，并提出“在线反应器”概念；相比其他在线反应装置，纤维膜的截留分子量可起到“筛分”过滤作用，在去除小分子基质、杂质及副产物等的同时将目标分析物及其反应产物无损耗保留并纯化；此外，利用膜的过渡作用可对溶液pH值、离子强度、溶剂极性等进行调控，从而克服了分离检测体系与衍生反应体系不完全匹配的技术难点；

(2)本发明在连接毛细管与纤维膜时，毛细管无需拉伸、去皮或刻蚀，保持外观和性能完好，不会影响分离效果；同时接口处无需借助聚四氟乙烯套管等第三方媒介架接，不仅简化了接口制作工艺，更重要的是有效减少了死体积对分离检测的影响；

(3)本发明在纤维膜前后各有两段毛细管(长度和内径均可根据实验需求选取，甚至可对毛细管内壁进行涂覆改性)，有效提高了分离效率，可进一步实现对复杂试样的分离检测；

(4)本发明的在线衍生反应套管可实现控温、控压、换液等诸多功能，可清洗并重复使用；添加荧光试剂的方向与样品电泳迁移方向相向，从而更有利于两者充分接触，反应时间可通过延长或缩短膜长进行调控；储液管长度可根据实验需要截取，其容量较同长度的离心管/试剂瓶等容器小很多，可极大节省试剂用量；

(5)本发明除应用于蛋白质、多肽等样品的在线衍生外，也可用于其它类型样品的生物/化学衍生，应用前景广阔。

【附图说明】

图1为本发明设计的零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)在线衍生装置结构示意图；

图2为本发明一个实施例中荧光衍生化试剂4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑(NBD-F)衍生牛血清白蛋白(BSA)样品CE-LIF谱图；

附图中标号分别为：1、分离毛细管，2、储液管，3、加料管/加压管，4、出料管/泄压管，5、中空纤维膜，6、粘结剂，7、硅胶垫制管盖，8、检测毛细管，9检测窗口。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置的具体实施方式。

实施例1

如附图1所示，截取两段内径为150μm毛细管，其中分离毛细管(1)长35cm，检测毛细管(8)长15cm，和一段长6cm的聚砜膜(5)，借助内径为100μm的金属丝构建毛细管与纤维膜接口。待接口处粘结剂(6)基本固化后，将金属丝完整抽出。

在本实施例中，用内径为1.5mm，外径为3.1mm的聚四氟乙烯套管搭建在线反应套管，储液管(2)长9cm，加料管/加压管(3)位于其后方8cm处，出料管/泄压管(4)位于其前方1cm处，两管均长3cm，三管保持连通密封。

使用时，将分离毛细管-纤维膜-检测毛细管接口置于在线反应套管内，向储液管内注入离子强度为20mmol/L的NaCl电解质溶液(含衍生化试剂NBD-F 20mmol/L)，将接口两端及纤维膜浸没并加盖密封。

以20mmol/L硼砂为毛细管电泳运行缓冲盐溶液，-10kV为运行电压，待系统平稳后，从进样端引入牛血清白蛋白(BSA)试样，在反应器中与渗入膜内的荧光衍生化试剂NBD-F发生反应，主产物和副产物在检测窗口(9)前被分离。用470nm波长激光激发，在510～540nm波长范围内检测，由附图2可知，衍生反应可在较短时间内完成，且主副产物得到了较好分离。

本发明利用中空纤维膜反应器实现了对微量(甚至痕量)蛋白质、多肽等样品的在线荧光衍生，克服了离线衍生过程样品损耗大、操作繁琐、耗时长等缺点，相比其他在线反应器也显示出了死体积小、试剂用量少、衍生温度和时间可调控等优势，而且装置成本低廉、功能多样、操作便捷、运行稳定，具有广阔的应用前景。

本装置也可用于复杂蛋白质、多肽等样品或其它类型样品的生物/化学衍生，衍生试剂根据反应需要选取。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置，包含中空纤维膜反应器，其特征在于：在毛细管电泳分离柱后连接零死体积中空纤维膜反应器，荧光衍生化试剂进入中空纤维膜内部，直接对蛋白质、多肽样品进行在线衍生，产物通过反应器后的激光诱导荧光检测器进行检测；

所述的中空纤维膜反应器由一段中空纤维膜和外围密闭的储液管构成，中空纤维膜的前端和后端分别与分离毛细管及在线检测毛细管相连，中空纤维膜全部被置于储液管中，储液管上有进液口和出液口；

中空纤维膜与毛细管连接端口的制作方法如下：将毛细管、中空纤维膜两端切割平齐；用内径小于毛细管及中空纤维膜内径的金属丝或者动植物纤维或者玻璃纤维穿入，起支撑作用；将毛细管与中空纤维膜接口平整对齐后涂胶，待胶基本固化后，将金属丝或者动植物纤维或者玻璃纤维完整抽出，让接口处胶彻底晾干；

在连接毛细管与中空纤维膜时，毛细管无需拉伸、去皮或刻蚀，保持外观及性能完好，不影响分离效果；同时毛细管与中空纤维膜接口处无需借助聚四氟乙烯套管第三方媒介架接，真正实现了零死体积对接。

2.如权利要求1所述的零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置，其特征在于：储液管由三段内径为0.5～50mm，外径为0.6～60mm的聚四氟乙烯套管制作而成，其中一段位于储液管的前方；另一段位于储液管的后方，三管保持连通密封；用硅胶垫制成管套盖将管端口加盖密封。

3.如权利要求1所述的零死体积毛细管电泳-激光诱导荧光检测在线衍生装置，其特征在于，所述的中空纤维膜材质为聚砜膜、纤维素膜或其他微透析膜，根据被分析物及衍生化试剂亲水性/疏水性选取；截留分子量介于1000～100000Da，小于被分析物分子量，使目标分析物得以无损失地保留在膜内；膜长3mm～30cm，决定了被分析物与衍生化试剂反应接触时间；膜内径与毛细管内径匹配，毛细管内径为50～540μm。

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