CN110358676A - 数字pcr成像法检测中应用的微液滴取样装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种数字PCR成像法检测中应用的微液滴取样装置，微液滴取样装置包括微液滴上浮模块和微液滴存储模块，两者之间密封连接；所述微液滴上浮模块表面设置有微液滴平铺室，所述微液滴存储模块中的微液滴分批进入到所述微液滴平铺室中实现微液滴单层平铺和成像检测。本发明实现了对一个微液滴样本的分批次取样，提高了数字PCR检测的灵敏度与可靠度和提高了微液滴检测的通量。

Description

数字PCR成像法检测中应用的微液滴取样装置
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，具体涉及一种数字PCR成像法检测中应用的微液滴取样装置。
背景技术
微液滴式数值PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来新兴的一种PCR技术。在原用PCR的技术基础上，该技术进行了大幅度革新。与经典的荧光定量PCR相比，ddPCR可以对DNA或者RNA分子采用绝对定量的方式进行分析，不需要标准曲线辅助分析。该技术将传统PCR中的每一份样品反应体系均分为若干份，样品仅被包裹与微液滴内，然后再进行PCR反应。PCR反应结束后，利用检测设备读取每一个微液滴的荧光信号值，再根据荧光信号值的阈值来区分每一个液滴，荧光信号高于阈值的微液滴称为阳性液滴，荧光信号低于阈值的微液滴成为阴性液滴，根据泊松分布原理以及阴性液滴的个数以及比例，计算样品靶分子的起始拷贝数。该技术以及被广泛应用于癌症分子标志物的发现、传染病研究、基因结构变异分析、基因表达分析等领域。
随这微流控技术的日益进步与微加工技术的提高，微流控芯片的出现极大地提升了数字PCR的性能，为液滴的生成与检测带来了许多可能。在对PCR后的液滴进行荧光检测时，常常会用到成像法，现有的成像法先将待检测的所有液滴单层平铺在一个平面上，随后利用CCD或者CMOS对其进行荧光成像并分析其阴阳性。
传统的微液滴成像法检测中，往往将样品中的微液滴一次全部平铺在待检测区域内，由于芯片面积的限制，所能够单层平铺的液滴数是有限的，限制了每份样品中的微液滴总数。
发明内容
为了解决上述问题，在一种实施方式中，本发明提供一种数字PCR成像法检测中应用的微液滴取样装置，所述微液滴取样装置包括微液滴上浮模块和微液滴存储模块，两者之间密封连接；所述微液滴上浮模块表面设置有微液滴平铺室，所述微液滴存储模块中的微液滴分批进入到所述微液滴平铺室中实现微液滴单层平铺和成像检测。
在一种实施方式中，所述微液滴上浮模块还包括上浮剂管道、微液滴进样管道、清洗剂管道和废液池，上浮剂通过所述上浮剂管道进入所述微液滴存储模块，使得所述微液滴上浮并通过所述微液滴进样管道进入所述微液滴平铺室；在微液滴在所述平铺室内实现成像检测后，清洗剂通过所述清洗剂管道进入所述微液滴平铺室，清洗微液滴平铺室，使得已经检测的微液滴进入到所述废液槽中。
在一种实施方式中，所述清洗剂管道一端位于微液滴上浮模块外表面并与清洗剂进样设备相连，另一端位于微液滴平铺室上，所述清洗剂管道用于将清洗剂通过进样设备注入到微液滴平铺室内。
在一种实施方式中，所述清洗剂管道一端位于微液滴上浮模块侧面并与清洗剂进样设备相连，另一端与所述微液滴进样管道连接，二者在连接处之后共用管道，通向所述微液滴平铺室。
在一种实施方式中，所述微液滴存储模块是八连排管、离心管、或者芯片腔室。
在一种实施方式中，所述微液滴上浮模块和微液滴存储模块通过旋盖结构、螺纹或外部施加压力实现密封连接，或者两者之间通过气密材料形成密封连接，气密材料优选为橡胶或硅胶。
在一种实施方式中，所述微液滴平铺室上方是透明的顶盖，能透过所述液滴样品荧光检测所需的激发光与其发射光；所述微液滴平铺室下方是底面，所述底面是透明的或者不透明的；优选地所述底面具有反射层。反射层可以增加微液滴检测的灵敏度。
在一种实施方式中，所述顶盖为阶梯状结构，所述顶盖通过夹具固定连接于微液滴平铺平台上方，与微液滴平铺平台部分接触，二者非接触部分形成所述微液滴平铺室；或者，所述顶盖为平面平板结构，所述顶盖与液滴平铺平台连为一体，二者之间形成所述微液滴平铺室。所述顶盖可以与所述微液滴取样装置的其他部分形成一个空间连续的整体，也可以是一个独立的零件，其通过辅助夹具、胶接、焊接、螺纹连接等方式固定在微液滴取样装置顶端。
在一种实施方式中，所述微液滴取样装置的微液滴上浮模块和微液滴存储模块中微液滴平铺室、微液滴进样管道和/或存储模块内表面均经过疏水或亲水处理。
在一种实施方式中，本发明提供一种数字PCR成像法检测系统，所述检测系统包括上述任一个的微液滴取样装置。
传统的微液滴成像法检测中，往往将样品中的微液滴一次全部平铺在待检测区域内，由于芯片面积的限制，所能够单层平铺的液滴数是有限的，限制了每份样品中的微液滴总数。本发明实现了对一个微液滴样本的分批次取样，使得在一个很小的区域内能够分批次地平铺大量液滴，打破了成像法中样本液滴数的上限，提高了数字PCR检测的灵敏度与可靠度。该方法也降低了平铺一个样本内所有微液滴所需的面积，在检测器成像面积有限的情况下，使得一次成像可以检测更多的样本，提高了液滴检测的通量。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的微液滴取样装置的结构示意图；
图2为本发明中一种上浮模块的半剖视图；
图3为本发明中另一种上浮模块的半剖视图；
图4为本发明的并联的两个微液滴取样装置的结构示意图；
图5为本发明的通过一次性注塑成型的平铺室俯视图；
图6为本发明由底面和顶盖通过双面胶连接形成的平铺室俯视图；和
图7为图6的平铺室剖视图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例：本发明数字PCR成像法检测中使用的微液滴取样装置
在本发明中，数字PCR成像法检测中使用的微液滴取样装置的整体结构示意图如图1所示，包括微液滴上浮模块01和微液滴存储模块02两部分。
在一种实施方式中，微液滴上浮模块01的半剖视图如图2所示，包括上浮剂管道011、清洗剂管道012、微液滴进样管道013、平铺室014、废液池015和螺纹连接槽016结构。所述微液滴存储模块02是一个中空的圆柱腔体，样品存储在微液滴存储模块02内部，腔室外表面设有螺纹，微液滴存储模块02可以通过螺纹固定在微液滴上浮模块01的螺纹连接槽016上，二者之间紧密连接。
微液滴存储模块02中样品一般为直径在80微米至110微米的油包水液滴。在一些实施方式中，样品可以是水包油液滴微液滴。
上浮剂通常是密度比样品大的油相液体，上浮剂通过上浮剂管道011进入到微液滴存储模块02中，使得微液滴存储模块02中微液滴上浮。
在一种实施方式中，上浮剂管道011一端位于微液滴上浮模块01侧面并与进样设备相连接，另一端位于螺纹连接槽016上，所述上浮剂管道011用于将上浮剂通过微液滴进样设备从微液滴上浮模块01侧面注入到微液滴存储模块02中。
在一种实施方式中，清洗剂管道012一端位于微液滴上浮模块01侧面并与清洗剂进样设备相连，另一端位于平铺室014上，所述清洗剂管道012用于将清洗剂通过进样设备注入到平铺室014内。清洗剂通常是密度比样品大的油相液体。
微液滴进样管道013一端位于螺纹连接槽016上，另一端位于平铺室014上，微液滴存储模块02中的液滴可以通过微液滴进样管道013上浮至平铺室014中。
在一种实施方式中，平铺室014位于微液滴上浮模块01顶端，是一个高度100微米、长度10毫米、宽度8毫米的长方体空间，平铺室014两侧具有开口使得平铺室014与大气相连通。平铺室014顶端为透明材质，平铺室014内外的光线均可透过平铺室014顶端。由于平铺室014的高度限制，所述液滴只能单层平铺在平铺室014中。
在一种实施方式中，废液池015位于微液滴上浮模块01上表面，是一个围绕平铺室014的环形凹槽，从平铺室014两侧开口中流出的物质会借助重力作用流入到废液池015中。废液池015用于搜集从平铺室014中流出的微液滴样品、清洗剂等。
在一种实施方式中，螺纹连接槽016位于微液滴上浮模块01的底端，是一个圆形凹槽，凹槽内表面有与微液滴存储模块02外表面相配合的螺纹，二者通过螺纹形成紧密连接。
在一种实施方式中，如图3所示，清洗剂管道012一端位于微液滴上浮模块01侧面并与进样设备相连，另一端与微液滴进样管道013连接，二者在上端有一部分公用区域，共同通向平铺室014。清洗剂管道012用于将清洗剂通过进样设备注入到平铺室014内。
在一些实施方式中，平铺室014、微液滴进样管道013和微液滴存储模块02内表面均经过疏水处理，具体步骤为：
(1)利用100％的乙醇对平铺结构超声清洗1小时；
(2)利用氮气吹干表面残留的乙醇；
(3)利用100％的丙酮对平铺结构超声清洗1小时；
(4)利用氮气吹干表面残留的丙酮；
(5)利用超纯水超声清洗平铺结构1小时；
(6)利用氮气吹干表面残留的超纯水；
(7)将清洗好的平铺结构在过饱和硅烷蒸汽中放置6小时。
在一些实施方式中，如果样品是水包油液滴，相应地平铺室014、微液滴进样管道013和微液滴存储模块02内表面均经过疏水处理。
所述微液滴上浮模块01和微液滴存储模块02均由透明的聚碳酸酯材料制成。
在利用本装置对样品进行分步取样进行数字PCR成像检测时，本装置的使用方法为：
(1)将含有清洗剂的进样设备连接至微液滴上浮模块01侧面的清洗剂管道012端口；
(2)将含有上浮剂的进样设备连接至微液滴上浮模块01侧面的上浮剂管道011端口；
(3)利用进样设备将清洗剂通过清洗剂管道012注入到平铺室014中，使清洗剂充满平铺室014；
(4)利用进样设备将上浮剂通过上浮剂管道011注入到存储容器中，存储容器中的液滴受到浮力的影响开始上浮，上浮的液滴进入微液滴进样管道013，转移至平铺室014中，液滴在平铺室014内形成单层平铺；
(5)当液滴将要充满平铺室014时，停止上浮剂的注入，液滴停止上浮，平铺室014中的液滴相对装置静止，此时通过外部检测设备对平铺室014内的液滴进行成像检测；
(6)检测完毕后，通过进样设备将清洗剂通过清洗剂管道012注入到平铺室014中，由于在清洗剂的注入，清洗剂管道012和平铺室014内原有的液滴和其他物质被冲入到废液池015中；
(7)重复进行(4)到(6)步骤，直到微液滴存储模块02中的液滴全部被检测。
在一种实施方式中，如图4所示，所述装置含有两个相同的微液滴上浮模块01，和两个相同的微液滴存储模块02，每个微液滴上浮模块01独立工作，分别通过上述方法实现对两个微液滴存储模块02中样本的独立分步取样。可以理解的是，所述装置含有八个相同的微液滴上浮模块01，和八个相同的微液滴存储模块02，每个微液滴上浮模块01独立工作，分别通过上述方法实现对八个微液滴存储模块02中样本的独立分步取样；其中上浮模块01为八连排管。
实施例二 本发明的微液滴平铺室
在一种实施方式中，如图5所示，平铺室周围的结构通过一次性注塑成型，中间的空间形成了平铺室014。所述平铺室为一圆柱体空间，平铺室高度100微米；平铺室横截面为半径4毫米的圆，圆外侧具有两个能使废液流入废液槽的通道0141，圆内有两个通道口0142和0143，通道口0142与液滴进样通道连接，另一个通道口0143与清洗剂通道连接。
在一种实施方式中，如图6、7所示，平铺室是由底面0145和顶盖0146通过两条双面胶0147连接形成的空腔。所述底面0145位于微液滴取样装置顶端，底面0145表面均匀覆盖100纳米厚的金属铝，所述顶盖0146为长8毫米，宽4毫米，高1毫米的长方体聚碳酸酯，所述双面胶0147长8毫米，宽0.5毫米，高100微米。平铺室高100微米，俯视图如图6所示。平铺室横截面为一个长7毫米，宽4毫米的长方形，长方形中间有两个通道口0412和0413，通道口0412与液滴进样通道连接，通道口0413与清洗剂通道连接。所述平铺室的剖视图如图7所示，两条双面胶0147位于平铺室的左右两侧，将底面0145与顶盖0146紧密连接，平铺室的前后两侧没有双面胶0147并于大气连通，废液能通过前后两侧流入到废液池中。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.数字PCR成像法检测中应用的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴取样装置包括微液滴上浮模块和微液滴存储模块，两者之间密封连接；所述微液滴上浮模块表面设置有微液滴平铺室，所述微液滴存储模块中的微液滴分批进入到所述微液滴平铺室中实现微液滴单层平铺和成像检测。
2.根据权利要求1所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴上浮模块还包括上浮剂管道、微液滴进样管道、清洗剂管道和废液池，上浮剂通过所述上浮剂管道进入所述微液滴存储模块，使得所述微液滴上浮并通过所述微液滴进样管道进入所述微液滴平铺室；在微液滴在所述平铺室内实现成像检测后，清洗剂通过所述清洗剂管道进入所述微液滴平铺室，清洗微液滴平铺室，使得已经检测的微液滴进入到所述废液槽中。
3.根据权利要求2所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述清洗剂管道一端位于微液滴上浮模块外表面并与清洗剂进样设备相连，另一端位于微液滴平铺室上，所述清洗剂管道用于将清洗剂通过进样设备注入到微液滴平铺室内。
4.根据权利要求2所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述清洗剂管道一端位于微液滴上浮模块侧面并与清洗剂进样设备相连，另一端与所述微液滴进样管道连接，二者在连接处之后共用管道，通向所述微液滴平铺室。
5.根据权利要求1所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴存储模块是八连排管、离心管、或者芯片腔室。
6.根据权利要求1所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴上浮模块和微液滴存储模块通过旋盖结构、螺纹或外部施加压力实现密封连接，或者两者之间通过气密材料形成密封连接，气密材料优选为橡胶或硅胶。
7.根据权利要求1所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴平铺室上方是透明的顶盖，能透过所述液滴样品荧光检测所需的激发光与其发射光；所述微液滴平铺室下方是底面，所述底面是透明的或者不透明的；优选地所述底面具有反射层。
8.根据权利要求7所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述顶盖为阶梯状结构，所述顶盖通过夹具固定连接于微液滴平铺平台上方，与微液滴平铺平台部分接触，二者非接触部分形成所述微液滴平铺室；或者，所述顶盖为平面平板结构，所述顶盖与液滴平铺平台连为一体，二者之间形成所述微液滴平铺室。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的微液滴取样装置，其特征在于，所述微液滴取样装置的微液滴上浮模块和微液滴存储模块中微液滴平铺室、微液滴进样管道和/或存储模块内表面均经过疏水或亲水处理。
10.一种数字PCR成像法检测系统，其特征在于，所述检测系统包括权利要求1-9中任一项所述的微液滴取样装置。
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