CN102047102A - 等电聚焦生物芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及等电聚焦生物芯片，特别是用于分级、检测和/或收集分析物，例如蛋白质、代谢物、糖蛋白和/或肽，使用这种生物芯片分级、检测和/或收集分析物的方法，以及这种生物芯片的制造方法。

Description

等电聚焦生物芯片
发明领域
本发明涉及基于等电聚焦、用于分离分析物的装置领域，所述分析物例如是蛋白质、代谢物、糖蛋白和/或肽。
发明背景
在蛋白组学中没有类似DNA分析中用于扩增核酸的PCR方法的蛋白扩增步骤。而且，表达蛋白具有高动态范围和多样性，特别是在真核组织中。因此，样品优选地进行预分级，以降低样品混合物的复杂性，对于某些蛋白例如低丰度蛋白或碱性蛋白富集样品，以及获得关于蛋白拓扑学(topology)的某些信息。一种很有用的预分级样品的方法是根据液相中等电点(pI)的电泳预分级。
Righetti及合作者已经为此开发了多隔室电解槽，并以IsoelectrIQ为名称被Proteome Systems商业化。这些芯片由被等电膜分开的多个腔室组成。每个膜包含Immobiline凝胶，其局部缓冲膜中的pH。从阳极到阴极，所述膜的pI递增增加，造成多个pI间隔。在一个腔室中引入蛋白样品，当在阳极和阴极之间施加电压时，各蛋白移向与其pI匹配的pI腔室。分级之后，每个腔室中的液体被收集用于进一步的分析。
现有电解槽如以上所述设备的主要缺陷在于它们是复杂的，例如包含许多在使用前需要由熟练人员组装的部件，且仍然需要许多操作步骤。而且，样品通常在分离过程之中或之后被稀释，而这有效地降低了低丰度蛋白的检测极限。多隔室电解槽IsoelectrIQ的单独腔室的体积相对较大，约为5ml。
本发明的目的是克服上述问题，提供能够分级很小样品体积的可自动化的装置。
发明概述
本发明涉及等电聚焦生物芯片，特别是用于分级(fractionating)、检测和/或收集分析物，例如蛋白质、代谢物、糖蛋白和/或肽，包含：
-微流控(microfluidic)样品通道，
-具有第一pH值(pH1)的第一凝胶垫，
-具有不同于第一pH值(pH1)的第二pH值(pH2)的第二凝胶垫，以及
-阳极阴极对，
所述第一和第二凝胶垫形成所述样品通道的至少两个相对壁部分，且
所述第一凝胶垫的至少一部分、所述第二凝胶垫的至少一部分，以及其相对壁部分由所述第一和第二凝胶垫形成的样品通道部分设置于阳极阴极对的阳极和阴极之间。
在本发明范围内，术语“微流控”理解为生物芯片的通道、腔室和储器的容量为微升数量级，例如为≥0.01μl到≤50μl，特别为≥0.1μl到≤10μl。
在根据本发明的等电聚焦生物芯片中，大多数分级、检测和分离步骤可有利地是自动化的。因此，有利的是，结果的再现性得到了改善，并且分级速度得到了提高。
另外，根据该发明的生物芯片有利地能够分级很小的样品体积，例如若干微升等级。也就是说，根据本法明的生物芯片能够分级为现有技术分离装置所需样品体积大约至少1000倍低的样品体积。因此，分离之前不需要稀释样品。理论上，这将导致分级后浓缩1000倍的蛋白样品。
由于在根据本发明的生物芯片中只需要小样品体积且可以省略样品稀释，所以根据本发明的生物芯片有利地具有提高的检测极限，这很重要，特别是对于检测低丰度蛋白。
在本发明的一个优选实施方式范围内，生物芯片另外包含至少一个微流控分级通道，以及对于每个分级通道包含附加凝胶垫，该附加凝胶垫的pH值不同于其它凝胶垫的pH值。所述附加凝胶垫和第一凝胶垫或第二凝胶垫或另外的附加凝胶垫从而优选地形成分级通道的至少两个相对壁部分。为保证样品的分析物等电移动进入分级通道和/或附加凝胶垫，其相对壁部分由附加凝胶垫和第一凝胶垫或第二凝胶垫或另外的附加凝胶垫形成的分级通道的部分，以及附加凝胶垫的至少一部分被设置于阳极阴极对的阳极和阴极之间。
在本发明的一个另外的优选实施方式范围内，生物芯片包含至少一个附加阳极阴极对。因此生物芯片对于每个附加阳极阴极对包含至少两个另外的凝胶垫，该至少两个另外的凝胶垫的pH值彼此不同且不同于其它凝胶垫的pH值。类似于第一阳极阴极对的第一和第二凝胶垫，附加阳极阴极对的两个凝胶垫也形成样品通道的至少两个相对壁部分。并且为保证样品分析物等电移动进入所述另外的凝胶垫以及任选地进入另外的分级通道，相对壁部分由附加阳极阴极对的两个凝胶垫形成的样品通道部分，以及附加阳极阴极对的两个凝胶垫中每个的至少一部分被设置于附加阳极阴极对的阳极和阴极之间。
使用至少两个阳极阴极对具有的优点是，样品可以在第一分级步骤中被预分级，例如去除高丰度蛋白，例如占蛋白组重量超过90％的白蛋白和免疫球蛋白。在第一步骤中去除高丰度蛋白有利地防止了在最终(第二)分级中的蛋白沉淀。在第二分级步骤中，分析物然后有利地被进一步提高浓度。
有利的是，第一或附加阳极阴极对的阳极和阴极电连接到一个阳极阴极对的两个外部凝胶垫。也就是说，阳极电连接到离样品通道一侧最远的凝胶垫，和阴极电连接到离样品通道的相对侧最远的凝胶垫。
为了引入样品和等电聚焦后任选地去除被分级的样品，样品通道优选地具备样品入口和/或样品出口。出于相同原因，每个分级通道优选地具备分级入口和/或分级出口，和/或每个内部凝胶垫优选地具备凝胶入口和/或凝胶出口，特别是凝胶入口。
在根据本发明的生物芯片的一个实施方式范围内，一个阳极阴极对的两个外部凝胶垫分别具备阳极入口和阴极入口。通过这种方式，不仅可简单地实现电极和凝胶的电接触，而且可有利地简化生物芯片的制造。
在根据本发明的生物芯片的另一个实施方式范围内，样品入口、样品出口、分级入口、分级出口、凝胶入口、凝胶出口、阳极入口和/或阴极入口具有流动屏障。
为了打开流动屏障和/或移动分析物级分，样品通道和/或至少一个分级通道和/或至少一个凝胶垫，特别是样品通道和/或至少一个分级通道，可连接到压力装置。在本发明的范围内，样品通道、分级通道和/或凝胶垫因此可以直接或间接地，例如通过样品入口、分级入口和/或凝胶入口和/或通过缓冲液储器，连接到所述压力装置。
在根据本发明的生物芯片的一个另外的实施方式范围内，样品通道和/或至少一个分级通道和/或至少一个凝胶垫，特别是样品通道和/或至少一个分级通道，通过或可通过样品出口、分级出口和/或凝胶出口，特别是样品出口和/或分级出口，连接到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器。例如，样品通道和/或至少一个分级通道和/或至少一个凝胶垫，特别是样品通道和/或至少一个分级通道，可通过打开样品出口、分级出口和/或凝胶出口特别是样品出口和/或分级出口的流动屏障，连接到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器。优选的是，分析物检测器、分析物收集器和/或另外的分析物分离器因此集成在生物芯片里。合适的分析物分离器和检测器可以例如是基于具有pH梯度并具备免疫测定装置的狭域等电聚焦zoom凝胶(narrow range isoelectric focusing zoom gel)。
在根据本发明的生物芯片的一个另外的实施方式范围内，样品通道和/或至少一个分级通道和/或至少一个凝胶垫通过或可通过样品入口、分级入口和/或凝胶入口，特别是样品入口和/或分级入口，连接到缓冲液储器。例如，样品通道和/或至少一个分级通道和/或至少一个凝胶垫，特别是样品通道和/或至少一个分级通道，可通过打开样品入口、分级入口和/或凝胶入口的流动屏障，连接到缓冲液储器。因此缓冲液储器优选地包含至少一种缓冲液(buffer)。
通过组合上述实施方式，可以通过对缓冲液储器中的缓冲液施加压力、打开流动屏障和将缓冲液通过样品通道、分级通道或凝胶垫冲入分析物检测器、分析物收集器和/或分析物分离器，将分析物转移到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器中。
例如，样品通道可通过打开样品入口的流动屏障连接到缓冲液储器和可通过打开样品出口的流动屏障连接到检测腔室，和/或至少一个分级通道可通过打开分级入口的流动屏障连接到缓冲液储器和可通过打开分级出口的流动屏障连接到检测腔室，和/或至少一个凝胶垫可通过打开凝胶入口的流动屏障连接到缓冲液储器和可通过打开凝胶出口的流动屏障连接到检测腔室。
优选的是，样品通道和/或至少一个分级通道可通过打开样品/分级入口的流动屏障连接到缓冲液储器，和可通过打开样品/分级出口的流动屏障连接到检测腔室。
在根据本发明的生物芯片的另一个优选实施方式范围内，检测腔室可通过打开另外的流动屏障连接到检测探针储器。
优选的是，缓冲液储器和/或检测腔室和/或检测探针储器也具备入口，特别是具备流动屏障，例如隔膜(septum)，通过其可手动或自动地插入检测探针，以允许检测用户指定的分析物和/或去除被分级的分析物。
在本发明范围内，样品通道、分级通道、凝胶垫、缓冲液储器、检测腔室和/或检测探针储器可包含至少一种分析物检测化合物，例如免疫测定化合物。
特别地，根据本发明的生物芯片可包含至少一种捕捉探针和/或至少一种检测探针，作为分析物检测化合物。
在根据本发明的生物芯片的一个优选实施方式范围内，检测腔室优选地包含至少一种捕捉探针，例如至少五种，特别是多种捕捉探针。优选的是，因此捕捉探针共价键接到检测腔室的壁。
根据本发明，捕捉探针能够与分析物发生相互作用，例如通过抗体-抗原、蛋白-蛋白、和蛋白-代谢物相互作用。捕捉探针可以是捕捉抗体、捕捉抗原、捕捉蛋白、捕捉代谢物或另一种对分析物具有高亲和性的分子，例如单链可变区片段(scFv)。
因此优选的是，缓冲液储器和/或检测腔室和/或检测探针储器包括至少一种，特别是对应的，检测探针，优选为经标记的检测探针，例如经标记的检测抗体。
在根据本发明的生物芯片的一个优选实施方式范围内，样品通道具备至少一个流动屏障，用以分离样品与第一阳极阴极对的凝胶垫和与附加阳极阴极对的凝胶垫的相互作用。
为此，流动屏障可例如设置在样品通道中位于相对壁部分由第一和第二凝胶垫形成的样品通道部分，以及相对壁部分由附加阳极阴极对的两个凝胶垫形成的样品通道部分之间的位置。
特别地，样品通道可对于每个阳极阴极对包含第一和第二流动屏障。这些流动屏障优选地位于其相对壁部分由两个凝胶垫形成的样品通道部分的起点和终点。通过这种方式，在等电聚焦期间，样品有利地保持在阳极和阴极之间的区域中。
通常，所有已知的用于微流控通道的流动屏障，例如微阀，都可用于根据本发明的生物芯片。
在根据本发明的生物芯片的一个实施方式中，至少一个流动屏障(flow barrier)是疏水性阻隔屏障。
疏水性阻隔屏障可通过用至少一种斥水剂涂覆毛细管例如样品通道或分级通道内的至少一个区域而实现，该斥水剂例如1H，1H，2H，2H-全氟烷基三卤硅烷，例如1H，1H，2H，2H-全氟己基三氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三氯硅烷，特别是1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟烷基三烷氧基硅烷，例如1H，1H，2H，2H-全氟己基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟己基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三乙氧基硅烷，特别是1H，1H，2H，2H-全氟癸基三甲氧基硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷，和/或基于Teflon(聚全氟乙烯)的化合物，例如Teflon AF1600，和/或下式(III)的化合物：
Figure BPA00001259130500061
这样的涂层确保液体，例如样品、样品级分或缓冲液，在涂层位置被阻隔(见图5a至5c和附图说明)。取决于使用的斥水剂，疏水性阻隔屏障可通过在被阻隔液体上施加压力或高电压、通过改变/增加温度、通过暂时减小毛细管横断面尺寸和/或通过紫外辐射被驱动/打开。例如通式(III)的疏水性化合物在紫外线辐射下分解为亲水性化合物。
在该发明一个优选实施方式范围内，凝胶垫通过至少丙烯酰胺单体：
Figure BPA00001259130500062
N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体：
Figure BPA00001259130500071
和
包含一个或多个pH缓冲子单元的单体(immobiline单体)的共聚制备，所述包含一个或多个pH缓冲子单元的单体例如是包含一个或多个pH缓冲子单元的丙烯酰胺单体，例如式I的immobiline A(在≈pH 4.5缓冲凝胶)：
Figure BPA00001259130500072
和
式II的immobiline B(在≈pH 8.5缓冲凝胶)：
Figure BPA00001259130500073
为了使得能够分离分析物，在本发明范围内，凝胶垫的pH值从最接近阳极的凝胶垫到最接近阴极的凝胶垫增加。
为了适当的连续混合及避免电倾析，根据本发明的生物芯片包含微混合器。合适的微混合器的例子是poly-MEMS(微电机械系统(Micro Electro Mechanical System))或通过(旋转)外部磁场移动的微米棒或纳米棒。
所述样品通道和/或分级通道和/或储器和/或腔室例如容量可为约≥0.1μl至约≤50μl，特别是约≥1μl至约≤10μl，和/或宽度可为约≥0.2mm至约≤5mm，特别是约≥0.5mm至约≤1.5mm，和/或高度可为约≥1μm至约≤500μm，特别是约≥10μm至约≤200μm，和/或长度可为约≥1mm至约≤100mm，例如约≥1mm至约≤50mm，特别是约≥5mm至约≤20mm。所述凝胶垫例如容量可为约≥0.1μl至约≤50μl，特别是约≥1μl至约≤10μl，
和/或宽度可为约≥1mm至约≤20mm，特别是约≥5mm至约≤10mm，和/或高度可为约≥1μm至约≤500μm，特别是约≥10μm至约≤200μm，和/或长度可为约≥1mm至约≤100mm，例如约≥1mm至约≤50mm，特别是约≥5mm至约≤20mm。特别地，因此凝胶垫的长度限定于和样品通道长度相同的方向。阳极和阴极可例如包含铂、金、铜、铝或掺杂硅，特别是由铂、金、铜、铝或掺杂硅组成，优选地涂有铂层。
为保证生物芯片中的凝胶在储存中保持水合，生物芯片优选地包含，特别是可去除的，密封，和/或被置于密封的盒中，例如灌满水。这具有如下优点：生物芯片能在需要时立即使用，且不需要费时的再水合步骤。
本发明的另一主题是采用根据上述任何一项权利要求的生物芯片分级、检测和/或收集分析物，例如蛋白、代谢物、糖蛋白和/或肽的方法，其包括以下步骤：
a)将样品注入样品通道中，
b)在阳极阴极对上施加电压，
c)在样品通道的至少一部分中和/或在分级通道中和/或在凝胶垫中和/或在检测腔室中和/或在分析物检测器中检测至少一种分析物，例如通过免疫测定技术，和/或
从样品通道(特别是通过样品出口)，和/或至少一个分级通道(特别是通过分级出口)，和/或至少一个凝胶垫(特别是通过凝胶出口)收集至少一种分析物。
在根据本发明的分级、检测和/或收集分析物的方法的一个优选实施方式范围内，该方法还包括以下步骤：
d)通过打开至少一个流动屏障和/或操作压力装置，将样品从阳极阴极对之间的区域转移到附加阳极阴极对的区域，
e)在附加阳极阴极对上施加电压，
f)在样品通道的至少一部分中和/或在分级通道中和/或在凝胶垫中和/或在检测腔室中和/或在分析物检测器中检测至少一种分析物，例如通过免疫测定技术，和/或
从样品通道(特别是通过样品出口)，和/或分级通道(特别是通过分级出口)，和/或凝胶垫收集至少一种分析物。
本发明的另一主题是根据本发明的生物芯片的制造方法，其包括以下步骤：
a)在底部基质中形成至少一个凹槽(recess)，
提供至少在对应于将在底部基质上形成的样品通道、凝胶垫和/或分级通道的位置的位置具有孔的覆盖基质，所述孔特别在成品生物芯片中用作样品入口、样品出口、阳极入口、阴极入口、凝胶入口、凝胶出口、分级入口和/或分级出口，
任选地提供制造用覆盖基质，该制造用覆盖基质在与将形成的凝胶垫的位置对应的位置具有孔，
b)将斥水剂施加于底部基质和/或覆盖基质和/或制造用覆盖基质上的区域，所述区域对应于将形成的样品通道和/或分级通道和/或流动屏障和/或储器和/或腔室的位置，
c)用覆盖基质或制造用覆盖基质覆盖底部基质，
d)通过与将形成的不同的凝胶垫的位置对应的每个孔引入不同的凝胶制剂，
e)聚合所述凝胶制剂，以及
f)任选地将制造用覆盖基质调换为覆盖基质。
根据本发明的该制造方法有利地允许其制造根据本发明的微流控生物芯片。
优选的是，底部基质中的凹槽基本具有将形成的样品通道、凝胶垫和/或分级通道的总体轮廓。例如，具有一个样品通道和两个凝胶垫的生物芯片可基于具有十字形总体轮廓的凹槽(图1)，具有一个样品通道、四个凝胶垫和两个分级通道的生物芯片可基于具有具备三个横杆的十字形式的总体轮廓的凹槽(图2)。底部基质、覆盖基质和/或制造用覆盖基质可例如为玻璃基质或塑料基质，例如聚丙烯(PP)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。底部基质中的凹槽可例如通过玻璃蚀刻或光刻法，例如通过使用光刻胶例如SU8，或注塑形成。对于结合斥水剂和/或凝胶粘结剂的硅烷基团，该方法还包含步骤a1)：向塑料基质特别是注塑的塑料基质提供SiOx层。该薄层可例如通过蒸发和/或溅射技术施加。
斥水剂有利地起到疏水阻隔的作用，用于在凝胶制剂过程中控制样品通道、分级通道、储器和/或腔室的形成(见图5a至5c和附图说明)。
根据本发明的合适的斥水剂是例如1H，1H，2H，2H-全氟烷基三卤硅烷，例如1H，1H，2H，2H-全氟己基三氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三氯硅烷，特别是1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟烷基三烷氧基硅烷，例如1H，1H，2H，2H-全氟己基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟己基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三乙氧基硅烷，特别是1H，1H，2H，2H-全氟癸基三甲氧基硅烷和/或1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷，和/或基于Teflon(聚全氟乙烯)的化合物，例如TeflonAF1600，和/或下式(III)的化合物：
Figure BPA00001259130500101
使用制造用覆盖基质及之后交换为覆盖基质具有的好处是，用于形成样品通道、分级通道、储器和/或腔室的斥水剂区域不必涂覆在覆盖基质上，并因此不影响这些成品生物芯片中的样品、水或缓冲液。
然而，也可仅仅使用覆盖基质。在聚合凝胶制剂后，斥水剂因此能够例如在样品通道和/或分级通道和/或储器和/或腔室的位置被转化为亲水性化合物，特别是通过施加辐射，和/或通过用溶剂清洗例如样品通道和/或分级通道和/或储器和/或腔室而除去。例如，Teflon AF可以通过用全氟烷烃，例如全氟己烷冲洗样品通道和/或分级通道和/或储器和/或腔室而除去。
在根据本发明的制造方法的一个优选实施方式范围内，该方法还包含步骤b1)：将凝胶粘结剂施加于底部基质和/或覆盖基质的和将形成的凝胶垫的位置对应的区域。
通过这种方式，应该形成凝胶垫位置的壁或壁部分被官能化，用于与凝胶化学结合且防止液体的不希望的泄漏。合适的玻璃基质和具备SiOx层的塑料基质的凝胶粘结剂是例如甲基丙烯酰氧基烷基三烷氧基硅烷，例如甲基丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基乙基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基乙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷，特别是甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。用于不含SiOx层的塑料(特别是丙烯酸酯或丙烯酰胺)基质的合适凝胶粘结剂是例如氨基官能化的硅烷，特别是伯氨基官能化的硅烷，例如氨基烷基三烷氧基硅烷，特别是氨基丙基三甲氧基硅烷和/或氨基丙基三乙氧基硅烷。有利的是，这些化合物可通过迈克尔加成与丙烯酸酯或丙烯酰胺形成共价键。
在根据本发明的制造方法的另一个优选实施方式范围内，凝胶制剂包含丙烯酰胺单体：
Figure BPA00001259130500111
N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体：
和
包含一个或多个pH缓冲子单元的单体(immobiline单体)，例如包含一个或多个pH缓冲子单元的丙烯酰胺单体，例如式I的immobiline A(在≈pH 4.5缓冲凝胶)：
Figure BPA00001259130500113
和
式II的immobiline B(在≈pH 8.5缓冲凝胶)：
所述凝胶制剂一般通过在去离子水中混合≥0.01重量％至≤20重量％，特别是≥2重量％至≤10重量％的单体制备。丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例例如在≥20∶1至≤100∶1的范围，例如约40∶1。为了在所用immobiline单体的pH获得良好的缓冲能力，immobiline单体的浓度可例如在≥1mM至≤50mM的范围，例如约25mM。
本发明的另一主题是根据本发明的生物芯片的用途，用于：
-复杂生物混合物例如血液、唾液、尿液中蛋白质、代谢物、糖蛋白和/或肽的快速和灵敏检测，
-现场(需求点)测试或在中心化实验室或科学研究中的诊断，
-生物传感器，特别是微流控生物传感器，用于分子诊断，
-化学、医药或分子生物学中的高通量筛查，和/或
-心脏病学、传染病、肿瘤学、食品、环境和/或代谢组学方面的蛋白诊断。
附图简要说明
该发明目标的附加细节、特征、特点和优点披露于从属权利要求、附图及各附图和例子的下列说明中，其以示例方式示出根据本发明的生物芯片的几个优选实施方式。
图1示出根据本发明第一实施方式的生物芯片的示意俯视图。
图2示出根据本发明第二实施方式的具有多个分级腔室的生物芯片的示意俯视图。
图3示出根据本发明第三实施方式的具有附加阳极阴极对和分离样品通道的流动屏障的生物芯片的示意俯视图。
图4示出根据本发明第一实施方式的生物芯片的示意透视图。
图5a至5c示出根据本发明的疏水性阻隔的示意横断面图。
图6示出根据本发明第四实施方式的生物芯片的示意俯视图，具有将样品通道、两个凝胶垫和两个分级通道与涉及检测的储器和腔室分开的流动屏障。
图7a和7b示出通过根据本发明第一实施方式的生物芯片从标准蛋白混合物中分离等电点为4.6的藻青蛋白(phycocyanin)。
实施方式的详细说明
图1示出最简单形式的根据本发明的生物芯片。该生物芯片包含样品通道1、具有第一pH值(pH1)的第一凝胶垫2、具有不同于第一pH值(pH1)的第二pH值(pH2)的第二凝胶垫3，以及阳极阴极对4、5。第一凝胶垫2因此形成至少一部分样品通道壁，第二凝胶垫3形成与第一凝胶垫形成的样品通道壁部分相对的另一个样品通道壁的至少一部分。换言之，样品通道夹在具有第一pH值(pH1)的凝胶垫2和具有第二pH值(pH2)的凝胶垫3之间。根据本发明，第一2和第二3凝胶垫因此形成样品通道1的至少两个相对壁部分。
凝胶垫2、3的pH值因此从离阳极4最近的凝胶垫到离阴极5最近的凝胶垫增加。第一凝胶垫2的pH值(pH1)因此低于第二凝胶垫3的pH值(pH2)。
为保证等电移动，第一凝胶垫2的至少一部分、第二凝胶垫3的至少一部分，以及其相对壁部分由所述第一2和第二3凝胶垫形成的样品通道1部分设置于阳极阴极对4、5的阳极4和阴极5之间，如图1所示。
根据本发明，阳极阴极对4、5的两个外部凝胶垫2、3优选地分别电连接到阳极4和阴极5。在图1中显示的实施方式中，因此阳极3电连接到第一凝胶垫2，阴极4电连接到第二凝胶垫3。
通过这样的设置，生物芯片有利地从样品通道中的样品除去了所有分析物，除了具有在第一(pH1)和第二(pH2)值之间的等电点(pI)的分析物。
图1显示了样品通道1具有样品入口6和样品出口7，以引入含有分析物例如蛋白、代谢物、糖蛋白和/或肽的样品，以及在等电聚焦后除去被分级的分析物，例如通过使用吸管或压力装置。出于相同原因，图2中所示的分级通道11a、11b也可具有分级入口16a、16b和出口17a、17b。在等电聚焦期间，样品入口6和出口7以及图2中所示的任选地分级入口16a、16b和出口17a、17b优选地是关闭的。
如图1所示，一个阳极阴极对4、5的两个外部凝胶垫2、3分别具有阳极入口8和阴极入口9。通过这种方式，有利地，不仅可以简化阴极和凝胶的电接触，而且可以简化根据本发明的生物芯片的制造。凝胶垫2、3可例如通过将阳极4通过阳极入口8插入和将阴极通过阴极入口9插入而电连接到电极。为克服由在电泳期间形成的电极气体导致的不利副作用，例如在凝胶垫2、3中的气泡，阳极4和阴极5优选地不直接接触根据本发明的凝胶垫2、3。为保证电极4、5和凝胶垫2、3的电接触，因此使用液体，特别是含水液体，例如水或缓冲溶液。该液体可通过阳极8和阴极入口9容易地被加入。
图2示出根据本发明第二实施方式的具有多个分级通道11a、11b的生物芯片的示意俯视图。在图1所示的实施方式中，生物芯片包含两个分级通道11a、11b。该分级通道11a、11b优选地填充有含水液体，例如水或缓冲溶液。
图2显示对于每个分级通道11a、11b生物芯片包含附加凝胶垫12、13。因此每个附加凝胶垫12、13具有和其它凝胶垫2、3、12、13的pH值不同的pH值。图2显示第一附加凝胶垫12和第一凝胶垫2形成第一分级通道11a的两个相对壁部分，第二附加凝胶垫13和第二凝胶垫3形成第二分级通道11b的相对壁部分。
为保证等电移动，附加凝胶垫12、13的至少一部分，以及其相对壁部分由附加凝胶垫12、13和第一凝胶垫2或第二凝胶垫3或另外的附加凝胶垫形成的分级通道11a、11b的部分设置于阳极阴极对4、5的阳极3和阴极4之间。为简化制造和使得能够与其它装置连接，阳极阴极对4、5的每个内部凝胶垫2、3优选地具备凝胶入口18、19。
图3示出根据本发明第三实施方式的具有附加阳极阴极对24、25和分离样品通道1的流动屏障30、31、32、33的生物芯片的示意俯视图。根据本发明，该生物芯片对于每个附加阳极阴极对24、25包含至少两个另外的凝胶垫22、23，其pH值彼此不同且不同于其它凝胶垫2、3、12、13的pH值。类似于第一实施方式，两个凝胶垫22、23形成样品通道1的至少两个相对壁部分。为保证等电移动，两个凝胶垫22、23中每个的至少一部分，和其相对壁部分由两个凝胶垫22、23形成的样品通道1部分设置于附加阳极阴极对24、25的阳极24和阴极25之间。
在图3所示的实施方式中，生物芯片包含四个流动屏障30、31、32、33，用于分离样品与第一阳极阴极对4、5的凝胶垫2、3、12、13和与附加阳极阴极对24、25的凝胶垫22、23的相互作用。例如，这些流动屏障30、31、32、33可以是疏水性阻隔屏障。如图3所示，每个阳极阴极对4、5、24、25包含第一30、32和第二31、33流动屏障。这些流动屏障位于其相对壁部分由阳极阴极对4、5、24、25的两个凝胶垫2、3、22、23形成的样品通道1部分的起点和终点处。通过这种方式，在等电聚焦期间，样品有利地保持在阳极阴极对的阳极和阴极之间的区域中。
有利的是，根据图3的一个实施方式使在第一阳极阴极对4、5首先除去例如高丰度蛋白(HAP)，随后在附加阳极阴极对24、25在感兴趣的pI范围内实施另外的分级成为可能。
图4示出图1中所示本发明第一实施方式的生物芯片的示意透视图。图4图示根据本发明的生物芯片可包含底部40和覆盖41基质。
如图4所示，底部基质40包含样品通道1和凝胶垫2、3的具有十字形总体轮廓的凹槽。底部基质40可以是玻璃基质。该凹槽因此优选地通过玻璃蚀刻或光刻法或注塑之后进行SiOx涂覆形成。
图4显示了覆盖基质41在对应于将在底部基质40上形成的样品通道1和凝胶垫2、3的位置的位置具有孔6、7、8、9。这些孔6、7、8、9在成品生物芯片中特别用作样品入口6、样品出口7、阳极入口8和阴极入口9。
此外图4显示了覆盖基质41在面对底部基质40的那一面上包含抗水涂层42。该抗水涂层42引起图5a至5c上下文中说明的效果，并且因此使得实现样品通道1的形成。
用覆盖基质41覆盖底部基质40，通过孔8填充一种凝胶制剂和通过孔9填充另一种凝胶制剂，聚合凝胶制剂，通过孔8引入阳极4和通过孔9引入阴极5，是制造根据本发明的生物芯片的最简单的方法。
然而，根据本发明的生物芯片可通过很多其它方法制造。
例如，底部基质40可首先用制造用覆盖基质覆盖，该制造用覆盖基质具有与在其中应该形成凝胶垫2、3的位置对应的孔8、9和在对应于其中应该形成样品通道1的区域的区域上具有抗水涂层42。这样的制造用覆盖基质使制造凝胶垫2、3和样品通道1成为可能。在聚合凝胶制剂后，制造用覆盖基质可被交换为不含抗水涂层的覆盖基质42。
图5a至5c示出根据本发明的疏水性阻隔的示意横断面图。如图5a至5c所示，液体，例如凝胶制剂或样品，可通过将线性42a-42d或二维42抗水涂层施加到毛细管，例如样品通道的一个或数个内部侧面而被阻隔。通过该效果，不仅可制造样品通道1、分级通道11a、11b、储器51a、51b、52a、52b和腔室53a-53e、54a-54e，而且可制造疏水性阻隔屏障50a-50o。
图6示出根据本发明第四实施方式的生物芯片的示意俯视图，具有将样品通道1、两个凝胶垫2、3和两个分级通道11a、11b与涉及检测的储器51a、51b、52a、52b和腔室53a-53e、54a-54e分离的流动屏障50a-50o。图6示出样品通道1、两个凝胶垫2、3和两个分级通道11a、11b中每个都具有第一50a-50e和第二50f-50j流动屏障，分别设置于样品通道1、凝胶垫2、3和分级通道11a、11b的相对侧面上。通过打开第一流动屏障50a-50e，样品通道1、两个凝胶垫2、3和两个分级通道11a、11b可连接到缓冲液储器和/或压力装置。通过打开第二流动屏障50f-50j，样品通道1、两个凝胶垫2、3和两个分级通道11a、11b可连接到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器。在图6中，样品通道1、两个凝胶垫2、3和两个分级通道11a、11b通过打开第二流动屏障50f-50j特别可连接到检测腔室53a-53e。在图1所示的实施方式中，检测腔室53a-53e包含至少一种捕捉探针，且通过打开第三流动屏障50k-50l可连接到包含至少一种检测探针的检测探针储器54a-54e。
图7a和7b显示通过根据本发明第一实施方式的生物芯片从标准蛋白混合物中分离等电点为4.6的藻青蛋白。
对于该实例，根据本发明第一实施方式的生物芯片根据以下程序制成：
1.通过以下提供底部基质：
-用皂(Extran 02(Merck)清洁玻璃基质，漂洗并吹干底部基质，
-将玻璃基质暴露于UV-臭氧和UVP-100达10分钟，
-用透明胶带遮盖全部基质区域，除了将形成样品通道的位置(样品通道宽度约1mm)，
-将基质在1mbar压力下暴露于全氟癸基三卤硅烷(购自ABCR)达1小时，
-去除透明胶带，
-用双面胶带在基质上形成十字形凹槽(高度约100tm)，
2.通过以下提供覆盖基质：
-用皂(Extran 02(Merck)清洁玻璃基质，漂洗并吹干底部基质，
-将玻璃基质暴露于UV-臭氧和UVP-100达10分钟，
-形成该基质的入口和出口孔6、7、8、9，
3.组装覆盖基质和底部基质，
4.通过以下制备凝胶制剂：
-将溶于去离子水中的7重量％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺(比例为37.5∶1)和1重量％的光引发剂Irgacure 2959混合，
-将一部分该组合物与25mMImmobiline pH 6.6(Fluka)混合和将另一部分该组合物与25mM Immobiline pH 7.4(Fluka)混合，
5.分别通过使用Eppendorf 1-10μl注射器将凝胶制剂填充入孔8和9中，并且
6.将装置在氮气室中暴露于紫外线(Philips PL10，3 mWcm-2)达20分钟。
对于来自BioRad的等电聚焦(IEF)标准蛋白混合物，目录编号161-0310的等电分级：
-将阳极4通过水滴连接到pH值为6.6的第一凝胶垫2，
-将阴极5通过水滴连接到pH值为7.4的第二凝胶垫3，
-施加最多300V的电压和最多20μA的电流达10分钟。
图7a明确显示等电点为4.6的藻青蛋白在10分钟内转移到第一凝胶垫2。因此通过根据本发明的生物芯片，可快速地实现从IEF标准蛋白混合物(BioRad，目录编号161-0310)中分离藻青蛋白。

Claims (15)

1.等电聚焦生物芯片，其包括：
-微流控样品通道(1)，
-具有第一pH值(pH1)的第一凝胶垫(2)，
-具有不同于第一pH值(pH1)的第二pH值(pH2)的第二凝胶垫(3)，以及
-阳极阴极对(4、5)，
其中所述第一(2)和第二(3)凝胶垫形成所述样品通道(1)的至少两个相对壁部分，且
其中所述第一凝胶垫(2)的至少一部分、所述第二凝胶垫(3)的至少一部分，以及其相对壁部分由所述第一(2)和第二(3)凝胶垫形成的样品通道(1)的部分设置于所述阳极阴极对(4、5)的阳极(4)和阴极(5)之间。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含至少一个微流控分级通道(11a、11b)，
其中所述生物芯片对于每个分级通道(11a、11b)包含附加凝胶垫(12、13)，该附加凝胶垫(12、13)的pH值不同于其它凝胶垫(2、3、12、13)的pH值，
其中所述附加凝胶垫(12、13)和所述第一凝胶垫(2)或第二凝胶垫(3)或另外的附加凝胶垫形成所述分级通道(11a、11b)的至少两个相对壁部分，和
其中所述附加凝胶垫(12、13)的至少一部分，以及其相对壁部分由附加凝胶垫(12、13)和第一凝胶垫(2)或第二凝胶垫(3)或另外的附加凝胶垫形成的分级通道(11a、11b)的部分设置于所述阳极阴极对(4、5)的阳极(3)和阴极(4)之间。
3.根据权利要求1或2所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含至少一个附加阳极阴极对(24、25)，
其中所述生物芯片对于每个附加阳极阴极对(24、25)包含至少两个另外的凝胶垫(22、23)，该至少两个另外的凝胶垫(22、23)的pH值彼此不同且不同于其它凝胶垫(2、3、12、13)的pH值，
其中所述两个凝胶垫(22、23)形成所述样品通道(1)的至少两个相对壁部分，和
其中所述两个凝胶垫(22、23)中每一个的至少一部分，和其相对壁部分由所述两个凝胶垫(22、23)形成的样品通道(1)的部分设置于所述附加阳极阴极对(24、25)的阳极(24)和阴极(25)之间。
4.根据前述权利要求任一项所述的生物芯片，其特征在于：
-所述样品通道(1)具备样品入口(6)和样品出口(7)；和
-一个阳极阴极对(4、5；24、25)的两个外部凝胶垫(2、3；12、13)具备阳极入口(8)和阴极入口(9)；以及
-每个分级通道(11a、11b)都具备分级入口(16a、16b)和分级出口(17a、17b)。
5.根据前述权利要求任一项所述的生物芯片，其特征在于：所述样品通道(1)具备至少一个流动屏障(31、32)，用于分离样品与阳极阴极对(4、5)的凝胶垫(2、3、12、13)和与附加阳极阴极对(24、25)的凝胶垫(22、23)的相互作用。
6.根据前述权利要求任一项所述的生物芯片，其特征在于：至少一个分级通道(11a、11b)通过分级出口(17a、17b)连接到或可通过分级出口(17a、17b)连接到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器。
7.根据前述权利要求任一项所述的生物芯片，其特征在于：所述样品通道(1)通过样品出口(7)连接到或可通过样品出口(7)连接到分析物检测器和/或分析物收集器和/或另外的分析物分离器。
8.分级、检测和/或收集分析物的方法，其包括以下步骤：
a)将样品注入样品通道(1)，
b)在阳极阴极对(3、4)上施加电压，
c)在所述样品通道(1)的至少一部分中和/或在分级通道(11a、11b)中和/或在凝胶垫(2、3、12、13、22、23)中和/或在分析物检测器中检测至少一种分析物，和/或从所述样品通道(1)和/或分级通道(11a、11b)和/或凝胶垫(2、3、12、13、22、23)收集至少一种分析物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于该方法还包含以下步骤：
d)通过操作至少一个流动屏障(30、31、32、33)和/或压力装置，将所述样品从所述阳极阴极对(4、5)之间的区域转移到附加阳极阴极对(24、25)的区域，
e)在所述附加阳极阴极对(24、25)上施加电压，
f)在样品通道(1)的至少一部分中和/或在分级通道(11a、11b)中和/或在所述凝胶垫(2、3、12、13、22、23)中和/或在分析物检测器中检测至少一种分析物，和/或
从样品通道(1)和/或分级通道(11a、11b)和/或凝胶垫(2、3、12、13、22、23)收集至少一种分析物。
10.根据权利要求1至8所述的生物芯片的制造方法，其包括以下步骤：
a)在底部基质(40)中形成至少一个凹槽，提供覆盖基质(41)，该覆盖基质(41)至少在与将在底部基质(40)上形成的样品通道(1)、凝胶垫(2、3、12、13、22、23)和/或分级通道(11a、11b)的位置相对应的位置具有孔(6、7、16a、16b、17a、17b、8、9、18、19)，
任选地提供制造用覆盖基质，该制造用覆盖基质在与将形成的凝胶垫(2、3、12、13、22、23)的位置相对应的位置具有孔，
b)将斥水剂施加于所述底部基质(40)和/或所述覆盖基质(41)和/或所述制造用覆盖基质上的区域(42)，该区域(42)对应于将形成的所述样品通道(1)和/或所述分级通道(11a、11b)和/或流动屏障(30-33；50a-50o)和/或储器(51a、51b、52a、52b)和/或腔室(54a-54e)的位置，
c)用所述覆盖基质(41)或所述制造用覆盖基质覆盖所述底部基质(40)，
d)通过与将形成的不同的凝胶垫(2、3、12、13、22、23)的位置对应的各个孔引入不同的凝胶制剂，
e)聚合所述凝胶制剂，以及
f)任选地将所述制造用覆盖基质调换为所述覆盖基质(41)。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于所述底部基质(40)、所述覆盖基质(41)和/或所述制造用覆盖基质是玻璃基质或塑料基质。
12.根据权利要求10或11所述的制造方法，其特征在于所述底部基质中的凹槽是通过玻璃蚀刻或光刻法或注塑形成的。
13.根据权利要求10至12所述的制造方法，其特征在于该方法还包含步骤a1)：向所述塑料基质提供SiOx层。
14.根据权利要求10至13所述的制造方法，其特征在于该方法还包含步骤b1)：将凝胶粘结剂施加于底部基质(40)和/或覆盖基质(41)的与将形成的凝胶垫(2、3、12、13、22、23)的位置对应的区域。
15.根据权利要求1至9任一项的生物芯片的用途：
-用于复杂生物混合物中蛋白质、代谢物、糖蛋白和/或肽的快速和灵敏检测，
-用于现场(需求点)测试或用于在中心化实验室或科学研究中的诊断，
-在用于分子诊断的生物传感器中，
-用于化学、医药或分子生物学中的高通量筛查，和/或
-用于心脏病学、传染病、肿瘤学、食品、环境和/或代谢组学方面的蛋白诊断。
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