KR20240026183A - 샘플 제조 - Google Patents
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Abstract
생물학적 샘플의 수집 및 가공, 구체적으로, DNA 및 RNA 분석 절차를 위한 생물학적 샘플의 수집 및 가공을 위한 일회용 기구(disposable device)가 기술된다. 기구는 (a) 제1 및 제2 전반적 원통형 섹션(generally cylindrical section)을 포함하고, 팁의 제1 및 제2 단부에 제1 및 제2 개구부를 갖는 중공 팁(hollow tip)으로서, 상기 제2 섹션 및 제2 개구부는 상기 제1 섹션 및 제1 개구부보다 더 작은 직경을 갖고, 상기 제1 섹션 및 제1 개구부는 샘플링 도구(sampling instrument)에 제거 가능하게 부착되도록 구성되는 것인 중공 팁; 및 (b) 제1 단부에 생물학적 샘플을 획득하기 위해 노출되거나 노출될 수 있는 작동 표면(working surface), 이렇게 획득된 생물학적 샘플 물질의 흡수 및 닙을 통한 액체의 통과에 적합한 다공성 구조; 및 제2 단부에 상기 닙에 세척 유체를 적용하기 위한 세척 표면을 갖는 다공성 닙(nib)을 포함한다. 또한 후속 샘플 가공을 방해하지 않으면서, 핵산의 방출을 보조하기 위해 다공성 닙 내에서 관능화제(funtionalising agent)로서 폴리비닐피롤리돈, 클로르헥시딘 또는 시트랄의 용도가 기술된다.
Description
본 발명은 임상 샘플을 수집하고, 분석을 위해 그들을 제조하는 것, 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 검출과 같은 분자생물학 처리 기술에 의한 분석을 위해 샘플을 수집하고 이를 제조하는 것; 구체적으로, 그러한 목적을 위한 샘플링 기구, 특히, POC(point of care) 또는 PON(point of need) 셋팅에서 유용하고, 테스트를 위해 원격 실험실로 보내는 데에도 사용되는 샘플링 기구에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태는 핵산 증폭 및/또는 검출을 위한 샘플의 제조에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 생물학적 샘플 중 특정 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재에 대해 테스트하기 위해 이용되는, 핵산을 증폭시키는 편리한 방법이다. PCR은 특히, 병원체나 질병에 대한 마커를 식별하는 진단 방법으로 사용된다. 핵산 샘플을 증폭시키는 기타 방법은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification) 및 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)와 같은 등온 증폭 방법을 포함한다.
이러한 진단 테스트를 수행하기 전에, 사용되는 증폭 과정에 적합한 상태의 핵산을 제공하기 위해 일정 양의 샘플의 제조가 필요하다. 실험실-기반 추출 방법은 일반적으로 고농도의 고순도 핵산을 제공하는 데 맞춰져 있으며, 그 목표는 가능한 한 많은 핵산을 얻는 것이다. 이는 단순성의 대가로 이루어지며, 실험실-기반 추출 기술은 종종 임상 환경과 적합하지 않은 원심분리기와 같은 시약 및 장비에 대한 접근을 필요로 한다.
임상 샘플의 제조는 단지 테스트를 수행하는 데 충분한 핵산을 요구한다. 이는 추출 과정을 상당히 단순화시키기 때문에 중요한 차이점이다. 예를 들어, 단순한 필터 페이퍼의 이용이 전혈과 같은 복잡한 샘플 매트릭스로부터도, PCR을 통한 후속 진단을 위해 생물학적 샘플 중 표적으로부터 충분한 핵산의 포획을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다(Fuehrer et al. J Clin Microbiol. 2011, 49(4), 1628-1630; Bu et al. Analytical Biochemistry 375(2), 370-372; Zou et al(2017) Nucleic acid purification from plants, animals and microbes in under 30 seconds, PLoS Biol 15(11), e2003916). 그러나, 한 가지 문제는 시료의 제조에서 유용할 수 있는 특정 시약이 PCR 증폭과 같은 하류 기술을 방해할 수 있다는 것이다.
생물학적 샘플을 채취할 수 있는 한 가지 방법은 예를 들어, 펜과 유사할 수 있는, 샘플링 기구 내에 유지될 수 있는 다공성 닙(porous nip)의 사용을 포함한다. 이러한 장치 중 하나가 미국 특허 출원 공개 US 2016/0349153에 기술되며, 이 문헌은 모세관 작용을 통해 액체 샘플을 흡수할 수 있는 다공성 닙의 형태로 소결 다공성 매트릭스(sintered porous matrix)를 포함하는 하우징을 갖는 기구를 기술한다. 다른 기구는 본 발명자들의 국제 특허 출원 PCT/EP2021/057315에 기술되며, 상기 기구는 후속 가공 및 분석을 위해 닙으로부터 흡착된 샘플을 플러싱하기 위한 완충액을 담는 저장소(reservoir)를 포함한다.
발명의 요약
구체적으로, 그러나, 배타적으로는 아닌, DNA 및 RNA 분석 절차를 위한 생물학적 시료의 수집 및 가공(processing)을 위한 일회용 기구가 본원에 기술된다. 상기 기구는 분자 진단 테스트에 충분한 핵산을 제공한다. 상기 기구는 본원에서 주로 핵산에 대한 분자 진단 테스트에서의 사용과 관련하여 기술되나, 다른 생체분자, 예를 들어 단백질, 지질, 대사 산물, 비타민, 약물, 유기 화합물(organics), 살충제, 소분자 등이 본 발명에 의해 수집되고 및/또는 가공될 수 있고; 세포막이나 세포 외피 단편(cell coat fragment)과 같은 세포 단편, 또는 세포 소기관도 마찬가지로 본 발명에 의해 수집되고 및/또는 가공될 수 있다. 본 발명자들은 특정한 닙 구성(nib configuration)이 압력을 가하여 닙을 통해 완충액을 능동적으로 플러싱할 필요 없이, 닙으로부터 샘플의 효과적인 방출을 가능하게 한다는 것을 확인했다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 분석을 위한 생물학적 시료를 수득하고, 선택적으로 가공하는 기구(device)로서,
(a) 제1 및 제2 전반적 원통형(generally cylindrical) 섹션을 포함하고, 팁의 제1 및 제2 단부에 제1 및 제2 개구부(opening)를 갖는 중공 팁으로서, 상기 제2 섹션 및 제2 개구부는 상기 제1 섹션 및 제1 개구부보다 직경이 더 작고, 상기 제1 섹션 및 제1 개구부는 샘플링 도구(sampling instrument)에 제거 가능하게 부착되도록 구성되는 것인 중공 팁; 및
(b) 제1 단부에 생물학적 샘플을 획득하기 위해 노출되거나 노출 가능한 작용 표면(working surface), 그에 의해 획득된 생물학적 샘플 물질의 흡수 및 상기 닙(nib)을 통한 액체의 통과에 적합한 다공성 구조, 및 제2 단부에 상기 닙에 세척 유체(wash fluid)를 적용하기 위한 세척 표면을 갖는 다공성 닙;을 포함하고,
상기 제2 섹션 및 제2 개구부는 상기 닙을 제거 가능하게 수용하도록 구성되고, 상기 다공성 닙은 폭보다 긴 길이를 갖는 것인 기구가 제공된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이 팁과 닙의 구성이 샘플이 작용 표면을 통해 다공성 구조로 흡수될 수 있을 뿐만 아니라 세척 유체가 세척 표면에 적용되어 닙으로부터 샘플을, 예를 들어, 후속 가공 또는 분석을 위해, 순전히 모세관 작용 및 중력에 의해 용리(elute)될 수 있게 한다는 것을 발견했다. 샘플을 용리시키기 위해 세척 유체를 닙을 통해 능동적으로 밀어내기 위해 압력을 가할 필요는 없다. 또한, 상기 기구가 작동하는 방식은 잠재적으로 병원체를 포함할 수 있는 샘플로부터 에어로졸을 생성할 위험이 감소된다는 것을 의미한다. 샘플이 먼저 닙에 흡수되고, 나중에 모세관 작용 및 중력에 의해 씻겨지므로, 샘플을 세게 피펫팅할 필요가 없으며, 피펫팅 과정에서 에어로졸이 생성될 수 있다.
닙의 길이 및 폭은 닙과 팁의 구조에 따라 정의될 수 있다. 일반적으로, 닙은 작용 표면을 정의하는 제1 단부 및 세척 표면을 정의하는 제2 단부를 갖는다. 이러한 제1 단부와 제2 단부 간에 연장되는 축이 닙의 길이를 정의하고, 폭은 이 축에 수직이다. 닙이 전반적으로 원통형인 경우, 폭은 원통의 직경일 수 있고, 일부 구체예에서, 닙은 일정한 폭을 가질 필요는 없으나; 가장 큰 폭의 부분은 길이보다 작다.
닙이 제2 섹션 및 제2 개구부 내에 수용되면, 닙의 작용 표면이 노출되고, 세척 표면은 팁 내에 존재한다. 바람직하게는, 세척 표면은 팁의 제1 섹션과 제2 섹션 사이의 전이부(transition)와 같은 높이에서 상기 팁 내에 있다; 즉, 상기 팁은 상기 닙의 세척 표면 위로, 제1 섹션의 형태로 넓어진다.
닙 위 팁의 높이는 닙 내에 유지된 액체의 표면 장력을 깨뜨리고 중력 하에서 물질의 흐름을 허용하기에 충분한 세척액의 '수두(head)'를 허용한다. 이는 세척액 중 점도 및 표면 장력 개질제를 사용하여 조절할 수 있다. 바람직하게는, 팁의 제1 섹션의 길이는 동일한 섹션의 직경보다 크고; 바람직하게는, 또한 닙의 길이보다 길다. 예상외로, 샘플을 흡수하기 위해 필요한 닙의 모세관 현상(capillarity)은 세척액이 닙을 통과하도록 강제하기 위해 압력을 가하지 않고도 닙을 포화시키고 샘플을 유지할 것으로 예상된다. 그러나, 본 발명자들은 이 구성이 포화된 물질을 통해 거의 동일한 양의 액체를 흘려보내 그에 스며든 샘플 물질로부터 추출된 핵산 및 단백질을 방출할 수 있게 한다는 것을 발견했다. 방출의 효율성은 예상치 못한 것이다.
중공 팁 구조의 사용은 팁과 닙을 샘플링 도구에 부착시킬 수 있게 한다. 편리하게, 이는 피펫이나 유사한 처리 기구일 수 있다. 예를 들어, 멀티팁 및/또는 로봇식 피펫은 복수 개의 샘플을 신속하게 처리하고 가공하는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 샘플링 도구는 단순히 취급 및 조작이 가능하도록 팁과 맞물리는 핸들(handle)일 수도 있다.
사용 시 팁과 닙은 다음과 같이 작동하는 것으로 예상할 수 있다. 사용자가 팁 및 닙을 피펫에 부착시킨다. 그 후, 닙을 환자의 입에 배치하고, 테스트를 위한 핵산을 포함할 타액을 흡수시킨다. 그 후, 사용자는 테스트 튜브 또는 샘플 플레이트 위에 피펫을 잡고, 팁과 닙을 테스트 튜브로 방출시키기 위해 피펫으로부터 팁을 탈착시킨다(eject). 그 후, 동일한 피펫을 사용하여 팁 내의 닙의 상부 표면에 세척 유체를 첨가할 수 있다. 중력 및/또는 모세관 현상에 따라, 세척 유체는 닙으로 들어가고, 닙의 하부 표면으로부터 테스트 튜브로 샘플을 용리시킨다. 그 후, 닙과 팁을 제거하고, 적절한 절차를 사용하여 용리된 샘플을 분석할 수 있다. 일부 구체예에서, 테스트 튜브 또는 샘플 플레이트는 임의의 용리된 샘플을 흡착할 흡수성 부재(bibulous member) 또는 흡수성 종이를 포함할 수 있다. 기타 구체예에서, 타액 샘플은 먼저 테스트 튜브나 기타 용기에 수집될 수 있다. 그 후, 팁/닙 조합이 입에서 직접 채취하는 것과 거의 동일한 방식으로 테스트 튜브로부터 타액 샘플을 수집할 수 있다. 또 다른 변형에서, 닙만 타액 샘플이 들어 있는 테스트 튜브에 넣을 수 있다. 그 후, 닙이 타액을 흡수하고, 사용자는 피펫에 위치하는 팁 내에 닙을 배치하고, 유사한 방식으로 추가 가공을 진행할 수 있다.
본 발명은 분석, 구체적으로, PCR, RPA 또는 LAMP와 같은 핵산 증폭 과정뿐만 아니라 잠재적으로 면역검출(immunodetection)과 같은 기타 분석 접근법에 의한 분석을 위한 샘플을 수득하고, 제조하는 편리한 수단을 제공한다. 이는 액체 또는 부분 액체(part-liquid)의 흡수에 의해 샘플을 수집하거나 생물학적 샘플을 포함하는 표면을 닦는(wipe) 데 사용되는 닙에 의해 적어도 부분적으로 달성된다.
닙은 전반적 원통형(generally cylindrical form)일 수 있으나, 닙이 폭보다 더 길다면, 임의의 적절한 형태가 사용될 수 있다. 예를 들어, 전반적 원통형 닙은 작동 표면 및 세척 표면 중 어느 하나 또는 둘 다에 곡면 또는 둥근 면을 포함할 수 있거나; 닙의 작동 및/또는 세척 표면과 본체 사이에 형성된 각도가 90도보다 클 수 있다. 이러한 구성은 샘플 수집이 수행되는 동안 환자의 편안함을 향상시킬 수 있고, 달리 완전한 원통형 닙(strictly cylindrical nib)에서 볼 수 있는 모세관 고정(capillary holding)에 대한 주변 효과(edge effect)도 줄일 수 있다. 일 형태에서, 닙은 뾰족한 끝(fine point), 뾰족한 가장자리(fine edge), 또는 넓은 스트로크(broad stroke)로 샘플의 획득을 촉진하기 위해 끌-형태(chisel-shaped) 또는 비스듬한 끌-형태(slanted chisel-shaped) 작동 표면을 갖는다. 이는 다양한 표면으로부터 샘플을 획득하는 법의학에 특히 유용할 수 있다.
닙은 억지 끼워맞춤으로 팁 내에 고정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 환형 링(annular ring)이 팁의 제2 부분의 내부에 형성될 수 있다. 이들이 팁의 내부 직경을 감소시키고, 닙은 압축 가능하므로, 이는 사용 동안 닙을 제자리에 유지시킬 것이다. 닙을 팁에 열 융착 또는 접착(heat staking or gluing)시키는 것도 가능하다.
일 구체예에서, 닙을 적시기 위해 샘플 수집 이전에 닙에 액체가 제공될 수 있다. 이렇게 하면 건조한 샘플 표면으로부터 샘플 수집을 촉진할 수 있다(예를 들면, 접촉되었던 영역으로부터 법의학적 수집, 또는 전비공(anterior nares)으로부터의 수집). 바람직한 구체예에서, 닙은 혈액, 타액, 소변 등과 같은 액체 샘플을 수집하기 위해 건조상태일 수 있다.
적합하게는, 사용 전 및/또는 사용 후에 닙을 덮기 위해 적어도 하나의 제거가능한 캡이 제공된다. 하나의 이러한 캡은 사용 전에 닙에 제공될 수 있으며, 사용 후 닙 상에 수득된 샘플을 보호하기 위해 교체가능하다(replaceabl).
닙에 획득된 수성 샘플의 양을 나타내는 수변색 표시(hydrochromic mark)가 제공될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 양의 수성 샘플이 닙 내로 채취된 때를 표시하기 위해, 상기 표시는 닙의 길이를 따라 특정 지점에 제공될 수 있다. 대안적으로, 상기 표시는 닙 전체에서 존재하는 물의 양에 비례하여 나타나거나 사라지는 감수성(water-sensitive) 염료의 형태를 취할 수 있다.
일 구체예에서 다공성 닙은 소결된 다공성 (sintered porous nib)닙일 수 있다.
다공성 닙은 다공성 플라스틱, 다공성 금속, 다공성 세라믹, 섬유 또는 내부 채널이 있는 압출 플라스틱 또는 금속을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 다공성 플라스틱은 소결된 다공성 플라스틱이다. 플라스틱 닙은 폴리에틸렌과 같은 다양한 플라스틱으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 폴리에틸렌은 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 및 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE)을 포함하나 그에 한정되지 않는다. 닙은 또한 폴리프로필렌(PP), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴릭 니트릴(PAN), 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA), 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 제조될 수 있다. 플라스틱 닙은 또한 전술된 플라스틱 중 2종 이상으로 제조될 수 있다. 일 구체예에서, 플라스틱 닙은 약 30% PP와 약 70% PE(wt:wt%)로 제조된다. 다른 구체예에서, PP와 PE가 조합되는 경우, PP는 약 100% 내지 약 0%의 범위로 존재할 수 있고, PE는 약 0 내지 약 100%의 범위로 존재할 수 있다. (100% 내지 0%:0% 내지 100% 중량:중량%). PE가 다른 중합체와 조합되는 경우, PE는 적어도 약 50%(wt%)로 존재한다. 일 구체예에서, 플라스틱은 HDPE이다. 다른 구체예에서, 플라스틱은 UHMWPE, PP, 폴리아미드 또는 폴리아크릴릭 니트릴이다. 다른 적합한 닙 재료는 US 2016/0349153에 기술된 것들을 포함한다.
하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 상기 닙은 닙 상에 수득된 샘플의 처리를 위한 활성제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 닙은 상기 활성제로 관능화된다(functionalized). 상기 활성제는 바람직하게는 세포(예를 들면, 박테리아) 또는 바이러스를 용해시켜 그의 성분을 방출하는 능력을 갖는 하나 이상의 막-교란(membrane-disturbing) 시약을 포함한다. 예를 들어, 용해된 세포의 DNA 및/또는 RNA는 추가 가공 또는 분석을 위해 수집될 수 있다; 대안적으로, 지질, 단백질 또는 펩티드, 또는 세포 소기관, 또는 세포막 또는 세포벽 단편을 포함한 세포 단편이 수집될 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성제는 인간에게 무독성이다. 하나의 바람직한 활성제는 4차 암모늄 화합물(QAC)을 포함하고, 더욱 바람직한 활성제는 세틸 피리디늄 클로라이드이며, 대안적인 것(예를 들어, 개별적으로 또는 조합되어, 표 1에 언급된 것들)이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 활성제는 동결건조되거나 건조된 형태이고, 예를 들어, 닙이 혈액 또는 타액과 같은 액체 샘플의 수집을 위해 이용되는 경우, 상기 활성제는 닙을 적시는 것에 의해 재수화될 수 있다. 상기 활성제의 기타 용도는 분석 과정에 방해될 수 있는 특정 성분을 포획하는 것일 수 있다.
본원에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 특정 활성제가 인간에게 무독성일 뿐만 아니라, 후속 서열 핵산 증폭을 방해하지 않는 농도로 세포 및/또는 바이러스로부터 핵산을 방출하는데 효과적이라는 것을 발견했다. 이러한 특징들의 조합은 이러한 활성제들을 본원에 기술된 샘플링 및 가공 기술에 특히 적합하게 만들 뿐만 아니라, 핵산 분석을 위한 샘플의 제조에서 이러한 작용제의 보다 일반적인 사용에 대한 길을 열어준다.
일 구체예에서, 상기 활성제는 폴리비닐피롤리돈(PVP; 포비돈)을 포함한다. 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 이전에 페놀성 화합물의 제거를 보조하기 위해 추출 완충액에 사용되었다; DNA 정제 동안 폴리페놀을 흡수하는 데 대단히 우수하다. 폴리페놀은 많은 식물 조직에서 흔히 발견되며, 제거하지 않으면 단백질을 불활성화시킬 수 있고, 따라서, PCR과 같은 다수의 후속 반응을 억제할 수 있다. 분자 생물학에서, PVP는 Denhardt 완충액의 구성 성분으로서 서던 블롯(Southern blot) 분석 동안 차단제(blocking agent)로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 PVP가 증폭을 억제하지 않으면서, 바이러스를 파열시켜 핵산(및/또는 기타 바이러스 성분)을 방출시킬 수 있다는 것을 확인했고, 놀랍게도 본 발명자들은 본원에 기술된 수집 기구의 닙에 PVP가 건조될 수 있다는 것을 발견했다.
일 구체예에서, 상기 활성제는 클로르헥시딘 및/또는 시트랄(citral)을 포함한다. 닙은 이 작용제를 다공성 매트릭스 내로 건조시켜; 예를 들어, 클로르헥시딘의 용액을 닙에 흡수시키고, 사용하기 전에 이를 건조시키는 것에 의해, 관능화될 수 있다. 바람직하게는, 닙에 건조시킬 용액은 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 또는 1% 이하의 활성제를 포함한다. 다수의 활성제가 사용되는 경우, 이는 모든 활성제에 대한 합계일 수 있다. % 활성제는 닙이 재수화될 때(샘플로부터 또는 완충액이나 세척 유체의 첨가로부터), 최종 용액이 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 또는 1% 이하의 활성제를 함유하도록 선택된다. 예를 들어, 이는 알려진 양의 샘플을 흡착하고, 알려진 양의 완충액으로 플러싱(flush)될 수 있는 알려진 양의 닙을 가짐으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 샘플의 초기 용해는 액체 샘플이 닙에 흡수될 때 일어나고; 그 후, 용해된 샘플은 완충액(예를 들면, Tris 완충액)을 이용하여 닙으로부터 플러싱된다. 이는 세척 후 후속 증폭에서보다 용해 단계에서 활성제의 농도가 더 높아지는 효과를 갖고; 그에 의해, 그 농도가 용해를 위해 최적화되고, 증폭을 방해하지 않도록 후속적으로 감소될 수 있게 한다.
바람직한 구체예에서, 상기 활성제는 PVP와 클로르헥시딘 및 시트랄 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. PVP는 바이러스에서 핵산을 방출하는 데 특히 유용하나, 클로르헥시딘과 시트랄은 박테리아와 같은 미생물에 대해 활성을 갖는다; 이들 활성제의 조합은 광범위한 핵산의 방출을 제공한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 활성제는 0.9% PVP 및 0.1% 클로르헥시딘 또는 시트랄을 포함한다. 클로르헥시딘과 시트랄은 모두 더 높은 농도에서 증폭을 방해할 수 있으므로, 더 높은 농도에서의 초기 용해 및 전술된 바와 같이 농도를 낮추기 위한 세척이 이 구체예에서 더 중요하다.
기타 활성제는 핵산을 분해로부터 보호하는 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알킬 폴리글루코시드는 DNA에 결합하는 것으로 나타났으며, 수집된 샘플을 뉴클레아제 활성으로부터 보호하고 수집된 샘플의 보관 시간을 증가시키는데 도움이 될 수 있다; 일 구체예에서, 작용제는 알킬 폴리글루코시드를 추가로 포함한다. PEG 및 특히 분지형 PEG(분지형, 별형(star) 및 빗형(comb), 및 더 낮은 정도로, 선형 PEG)도 페길화(PEGylation) 과정을 통해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 것으로 나타났다. 일 구체예에서, 닙은 막 교란제(membrane disrupting agent) 외에, 보호제를 포함할 수 있고; 예를 들어, 1%의 PEG 6000이 클로르헥시딘 외에 닙 내로 건조될 수 있다. 이는 수집된 샘플의 자가-수집 및 안정화를 가능하게 하여, 그 후, 샘플을 생물학적으로 안전하게 만들때 방출되는 핵산을 분해하지 않으면서 테스트 시설로 배포하기에 생물학적으로 안전하다. PEG 6000은 또한 점액/섬유와의 소수성 단백질 상호작용을 감소시키고 닙으로부터의 방출을 증진시킨다.
본원에서 그의 특징적인 핵산 함량 분석을 위해 테스트 샘플을 수득하고 이용하는 것과 관련하여 주로 기술되나, 본 발명은 또한 면역학적(항체/항원) 테스트 절차, 또는 실제로 적합한 검출 시약이 존재하는 경우, 생물학적 샘플에서 발견될 수 있는 기타 분석물의 수집 및/또는 검출에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 지질, 단백질, 펩티드, 세포내 소기관 또는 단편, 세포막 또는 세포벽 단편 등이 모두 본 발명의 적합한 적용에서 수집되고 가공될 수 있다.
본 발명은 테스트 샘플링 기구 및 그의 용도를 제공할 수 있고, 상기 기구는 정의된 부피의 테스트 샘플을 흡수하고, 건조 공정을 통하여 니브로 미리-관능화된(pre-functinalized) 활성 성분에 샘플을 노출시키는 다공성 매트릭스를 포함한다. 샘플이 니브에 흡수되면서, 샘플이 그 성분들을 재수화시킨다. 그로부터, 추출된 핵산(또는 면역진단의 경우 단백질, 또는 지질 등)이 즉시 이용될 수 있거나, 또는 닙을 통해 완충액을 다시 통과시켜 완충액 교환을 통한 후속 용리(elution)를 위해 수송(shipping) 동안 건조될 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 증폭용 핵산의 제조에서 PVP의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 이 양태는 증폭용 핵산의 제조에서 클로르헥시딘 및/또는 시트랄의 사용을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 핵산을 제조하고 증폭하는 방법으로서, 상기 방법은:
샘플을 PVP를 포함하는 용해 완충액과 조합하여, 샘플 내 물질로부터 핵산을 방출시키는 단계;
상기 샘플을 핵산 증폭 과정에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
바람직하게는, 핵산 증폭 과정은 PCR이다. 바람직하게는, 샘플은 PVP의 존재 하에 핵산 증폭 과정을 거친다. 용해 완충액(lysis buffer)은 또한 적절한 시약(예를 들면, 프라이머, dNTP, 효소 등)을 포함시켜 핵산 증폭 믹스로 사용될 수 있다. 이러한 시약은 초기 단계에 용해 완충액에 존재할 수 있거나, 또는 후속적으로 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 용해 완충액은 클로르헥시딘 및/또는 시트랄을 추가로 포함한다.
PVP는 용해 완충액에 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 또는 1% 이하로 존재할 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 용해 완충액은 0.9% PVP 및 0.1% 클로르헥시딘 또는 시트랄을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 PVP, 및 핵산 증폭 과정을 수행하기 위한 하나 이상의 추가 시약을 포함하는 핵산 증폭 믹스를 제공한다. 바람직하게는, 핵산 증폭 과정은 PCR이다. 바람직하게는, 추가 시약은 프라이머, dNTP 및 효소로부터 선택된다. 증폭 믹스는 클로르헥시딘 또는 시트랄; 더욱 바람직하게는 0.9% PVP 및 0.1% 클로르헥시딘 또는 시트랄을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 샘플 수집을 위한 다공성 닙으로서, 상기 다공성 닙은 그 내부에 건조된 PVP를 포함하는 것인 다공성 닙을 제공한다. 닙은 그 내부에 건조된 클로르헥시딘 또는 시트랄을 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 샘플 수집 및 제조를 위한 기구의 사시도이다.
도 2는 기구의 단면도를 보여준다.
도 3은 기구 사용의 결과를 보여준다.
도 4 및 5는 다양한 용해제를 사용한 샘플의 qPCR 증폭 곡선을 보여준다.
도 6은 다양한 용해 완충액을 사용한 증폭의 결과를 보여준다.
도 2는 기구의 단면도를 보여준다.
도 3은 기구 사용의 결과를 보여준다.
도 4 및 5는 다양한 용해제를 사용한 샘플의 qPCR 증폭 곡선을 보여준다.
도 6은 다양한 용해 완충액을 사용한 증폭의 결과를 보여준다.
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 이 기구는 양 단부에 개구부를 갖는, 거의 원통형인 팁(largely cylindrical tip)을 포함하는, 통상적인 피펫 팁의 일반적인 형태 및 크기를 갖는다. 제1, 더 큰 직경의 섹션은 핸들로 작용하기 위해 플라스틱 피펫 또는 기타 기구와 맞물릴 수 있는 제1 개구부를 포함한다. 제2, 더 좁은 직경의 섹션은 다공성 플라스틱 원통형 닙이 수용되는 제2 개구부를 갖는다. 구체예에서, 닙은 그를 보호하기 위해 제거 가능한 보호 캡(도시되지 않음)으로 덮일 수 있다; 다른 구체예에서, 사용되지 않을 때, 보호를 제공하고, 피펫에 쉽게 연결할 수 있도록 복수의 팁/닙 기구가 랙(rack)에 수용될 수 있다. 복수 개의 팁/닙을 랙에 배치하면 복수 개의 피펫이나 로봇 디스펜서 등을 사용한 처리량의 증가를 가능하게 할 수 있다.
팁은 양쪽 개구부에 억지 끼워맞춤을 제공하도록 구성되고, 이러한 목적을 위해 클립(clip), 리브(rib), 환형 링, 멈춤쇠(detent) 등이 제공될 수 있다. 더 큰 제1 개구부는 피펫이나 기타 기구와 맞물리도록 구성된다. 상기 기타 기구는 일부 구체예에서 단순히 핸들일 수 있으나, 기타 기구는 상기 기구로부터 사용된 팁의 용이한 탈착을 가능하게 하는 것이 바람직하다; 예를 들어, 이는 상기 기타 기구로부터 밀어내기 위해 상기 더 큰 개구부의 외부 테두리와 맞물릴 수 있는 레버, 푸시 로드(push rod) 또는 기타 기계적 수단일 수 있다.
닙은 팁으로부터 돌출된 샘플링 단면(sampling end surface), 및 팁 내부에 노출되는 세척 단면(wash end surface)을 갖는다.
닙
적합한 닙 재료는 면-기반 재료, 또는 바람직하게는 다양한 점도의 생물학적 표본(specimen)을 흡수하고 유지하기 위해 다양한 밀도로 제조될 수 있는 PE 또는 PVDF와 같은 플라스틱 기반 매트릭스를 포함한다. 닙 구성의 정확한 세부사항은 본 발명의 용도를 위한 구체적 적용에 따라 달라질 수 있으며, 통상의 기술자는 적절한 재료 및 밀도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 수집할 샘플이 타액인 경우, 하나의 이러한 적합한 재료는 다공성이 ~90%인 원통형 PE/PP 심지(wick)이다.
마커 펜 닙(marker pen nib)은 종종 개방형 구멍 구조를 생성하기 위해 펠트나 셀룰로오스와 같은 다공성 프레스된 섬유(porous pressed fiber) 또는 다공성 프레스된 플라스틱 구체(porous pressed plastic sphere)로 제조된다. 본 발명에서 닙은 적합하게 유사한 재료 또는 구조일 수 있고, 바람직하게는 정의된 다공성(공극율(void fraction))을 갖는다.
닙은 작업별로 설계되거나 다양한 작업에 대응하도록 설계될 수 있다. 법의학 작업의 경우, 일부 응용을 위해 하나의 표면, 또는 더 넓은 영역의 샘플링을 위한 넓은 표면의 정교한 도말(fine swabbing)을 가능하게 하는 닙 설계를 갖는 것이 편리하다. 또한, 예를 들어 표면 도말(surface swabbing)로부터 건조 샘플을 수집하거나 전비공(anterior nares)이나 표피에서 샘플을 수집하기 위해, 축축할 때 사용할 수 있는 닙을 제공하거나, 또는 혈액, 소변, 타액 등과 같은 액체 샘플을 수집하기 위해 건조 상태일 때 사용할 수 있는 닙을 제공하는 것이 편리할 수 있다.
펠트 펜 닙(felt pen nib)은 종종 동일한 단일 닙으로부터 가늘거나 넓은 잉크 스트로크를 허용하도록 설계된다. 동일한 설계 원칙이 여기에서 닙에서 적용될 수 있다; 예를 들면, 샘플이 표면으로부터 뾰족한 끝, 뾰족한 가장자리, 또는 넓은 스트로크로서 채취될 수 있게 하는 단부 표면의 비스듬한 끌 형태. 그러나, 닙이 기술되고 예시된 구조적 특징을 갖지 않아도 된다. 가장 단순하게는, 닙은 단지 평활 말단 또는 둥근 말단을 제시할 수 있다.
닙의 다공성 형태는 액체 테스트 샘플의 흡수를 위한 모세관 공간(capillary space)을 제공할 것이다. 다공성 구조는 알려진 양의 샘플 유체, 예를 들면, 타액를 모세관 공간으로 끌어들이도록 설계되어, 채취되는 샘플의 양을 조절하고 테스트를 보다 일관성 있게 할 수 있다.
닙은 표적 핵산 성분으로부터 샘플의 세포 또는 바이러스 성분을 용해 또는 제거하는 수단을 제공하기 위하여 음으로 하전된 표면을 형성하도록 처리되고 및/또는 음이온성 디터전트로 처리되고, 및/또는 살생물제로 처리되었을 수 있다.
셀룰로오스 섬유는 약간의 음(음이온) 전하를 갖는다. 셀룰로오스의 히드록실기(-OH)는 또한 다양한 시약과 부분적으로 또는 완전히 반응하여 유용한 특성을 가진 유도체를 제공할 수 있다. 따라서, 닙에 테스트 샘플의 양전하 이온(예를 들면, Fe3+)을 결합하고 유지하는 음전하 표면이 제공될 수 있고, 중성 또는 음전하 이온 및 분자(예를 들면, DNA)를 닙으로부터 흐르게 하고 양이온 성분으로부터 멀리 떨어지게 하기 위해 벌브(bulb)가 사용될 수 있다.
박테리아와 같은 대부분의 살아있는 세포는 지방 지질 이중층으로 둘러싸여 있다. 지질 구성은 세포내 막(subcellular membrane) 전체에서 동일하지 않다 - 포유류 원형질막은 콜레스테롤과 스핑고지질 함량이 더 높다. 바이러스도 숙주 막과 동일한 것으로 간주되는 외피 지질(인지질, 스핑고지질, 일부 콜레스테롤)을 갖는다.
세포의 지질층을 파괴하고 결과적으로 항박테리아 또는 항바이러스 특성을 나타내는 다수의 상이한 화학적 작용기가 있다. 이들이 기구의 닙을 관능화하기 위해 사용되는 경우, 닙에 스며든 세포(박테리아 포함) 또는 바이러스가 터져, DNA 및 RNA(또는 기타 세포 또는 바이러스 구성 성분, 예를 들면, 지질, 단백질, 세포내 소기관 또는 단편, 막 또는 세포벽 단편 등)를 방출할 것이다.
하기 표 1은 닙의 관능화에 대한 예를 제공한다. 구강청결제 제제(음영 부분에 표시)는 생물학적으로 안전하고 효과적인 것으로 알려져 있어 소비자가 기구를 입에 넣어 테스트를 위해 타액을 자가 수집할 수 있으므로 특히 유용해 보인다. 예를 들어, 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC)는 다양한 구강청결제의 활성 성분이고, 막-교란제(membrane-disrupting agent)인 것으로 확인되었다(Popkin et al, Cetylpyridinium chloride (CPC) exhibits potent, rapid activity against influenza viruses in vitro and in vivo, Pathogens and Immunity, 2017; 2(2):253-69). 특히 바람직한 제제는 클로르헥시딘이다.
조합은 다양한 개체의 지질 이중층에 대한 표적화된 활성을 제공하여 동일한 제제가 다양한 표적에 걸쳐 사용될 수 있거나, 또는 표적화된 제제에 추가적인 항박테리아 또는 항바이러스 활성을 제공하여 사용 후 샘플을 생물학적으로 안전하게 만들 수 있다.
시약은 관능화(예를 들면, -OH 기)를 통해 적절한 화학적 결합에 의해 닙에 공유결합될 수 있거나, 또는 닙 재료 내에 건조되어 샘플에 의해 수화될 때 활성화될 수 있다.
제제를 닙에 건조시켜 도입하면(dry down) 타액(또는 다른 시험 샘플)의 희석, 및 따라서 절단된 물질의 닙 매트릭스로의 재흡수를 최소화한다. 표 1에 표시된 구강청결제 제제는 수초 내에 바이러스 및 박테리아에 작용하는 것으로 나타났다. 따라서, 닙은 다음과 같은 지원 기능을 제공한다:
1. 그 위에 선택적으로 항바이러스 및/또는 항박테리아 제제가 건조되어 도입되어, 타액 샘플을 처리하여 희석할 필요를 제거하는 매트릭스;
2. 구강 내에 삽입될 때 타액 생성의 유도.
3. 유도된 타액의 흡수.
4. 알려진 양의 타액 포함.
타액 샘플을 수집하고, 후속 처리를 위해 튜브에 넣을 수 있다. 또는, 샘플러(닙)를 구강에 삽입하고 그 자리에서(in situ) 타액을 수집하는 것이 바람직할 수도 있다. 그 경우, 닙은 세포(예를 들면, 박테리아) 또는 바이러스를 파괴하여 DNA 및/또는 RNA 및/또는 기타 세포 또는 바이러스 성분을 방출하는 능력을 가지나, 무독성이고, 따라서, 산물을 그런 방식으로 사용하기에 안전하게 만드는 화합물로 처리될 수 있다.
기구의 사용
본 발명의 기구를 위한 특히 바람직한 적용은 타액 샘플의 수집, 예를 들어, SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염에 대한 테스트를 위한 타액 샘플의 수집니다. 클로르헥시딘과 같은 무독성 화학물질을 사용한다는 것은 타액을 흡수하기 위해 상기 기구를 환자의 구강에 넣을 수 있다는 것을 의미한다. 사용 시, 작업자는 취급의 용이를 위해 팁을 피펫에 연결하고, 구강 내에서 샘플링 단부를 타액과 접촉시킬 수 있다. 그 후, 다공성 닙에 흡수되며, 클로르헥시딘이 바이러스 캡시드가 있는 경우 이를 용해하고, 닙 상에 바이러스 핵산을 방출한다. 이 시점에 닙은 타액에 의해 완전히 축축해질 것이다.
그 후, 작업자는 환자의 구강으로부터 팁과 닙이 있는 피펫을 제거하고, 피펫에서 팁을 방출시켜, 테스트 튜브나 기타 수집 기구에 들어가게 한다. 이 단계에서, 팁과 닙은 도 2에 도시된 바와 같이, 그림 2에 표시된 수직으로 세워져 있다; 즉, 더 큰 개구부가 위쪽을 향하고, 닙의 샘플 표면이 최저점에 있다.
그 후, 작업자는 통상적인 팁을 피펫에 연결하고,이를 사용하여 세척 완충액을 팁의 더 큰 개구부에 분배하여 상기 완충액이 닙의 상부 세척 표면과 접촉하게 한다. 중력 하에, 세척 완충액은 닙을 통과할 것이다. 이는 닙의 포화를 유지하지만, 놀랍고도 중요하게 닙으로부터 용해된 핵산을 테스트 튜브 또는 기타 수집 기구로 용리시킨다. 일반적으로 유체는 압력 하에 밀어내야 하고, 중력은 충분하지 않을 것으로 가정되었을 것이다. 예를 들어, 통상적인 샘플 제조는 종종 모세관 매트릭스로부터 샘플을 방출시키기 위해 원심분리를 필요로 한다. 현재의 기구에서 이렇게 높은 효율로 샘플을 쉽게 방출시킬 수 있다는 것은 전혀 예상치 못한 것이었다.
대안적으로, 샘플 수집 및 조작을 위해 피펫을 사용하는 대신, 팁을 샘플 수집을 위한 대안적인 클립이나 핸들에 고정하고, 테스트 튜브로 옮길 수 있다.
그 후, 팁과 닙을 테스트 튜브로부터 꺼내고, 방출된 샘플을 테스트에 사용할 수 있다.
본원에 기술된 팁 및 닙 기구(tip and nip device)의 특별한 장점은 그들이 사용될 수 있는 샘플 유형 및 그들이 적합한 하류 가공(downstream processing) 측면에서 다용도성(versatility)이다. 특히, 상기 기구는 일반적으로 깃털 스왑(flocked swab), 면 스왑(cotton swab) 및 폼 스왑, 또는 큐티클 스틱(cuticle stick)에 의해 다양하게 수집될 수 있는 모든 유형의 샘플에 사용될 수 있다. 팁 및 닙 기구는 시료 추출 및 희석에 사용될 수 있고, 생물학적으로 안전하며(biosafe), 하나의 통합된 수집 및 처리 기구(integrated collection and handling device)를 사용하여, 습식 및 건식 샘플의 수집에 사용될 수 있다. 이러한 다용도성, 및 기타 샘플 수집 기술과의 비교가 하기 표에 요약된다.
따라서, 팁 및 닙 기구는 단일 제품에 여러 기능을 결합하여, 다양한 유형의 샘플 및 테스트 프로토콜에 대해 상이한 샘플 기구를 사용할 필요성을 감소시킨다.
실시예
도 3은 다양한 관능화를 갖는 닙으로부터의 코로나바이러스 229E를 첨가한(spiked) 타액 샘플의 RT-qPCR 분석 결과를 보여준다. 샘플을 닙에 흡수시킨 후 닙의 세척 표면에 pH 7.5의 Tris 완충액을 첨가하여 닙에서 샘플을 방출시켰다. 그 후, 방출된 샘플에 통상적인(conventional) 프로토콜을 이용하여 RT-qPCR을 수행했다.
세로 축은 바이러스를 검출하는 데 필요한 사이클 수를 나타내고, 사이클 수가 낮을수록 더 민감하다. 좌측부터 우측으로, 닙의 상이한 관능화제는 CIT - 시트랄(citral), PP - 포비돈 요오드(povidone-iodine), BE - 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride), CE - 세틸피리디늄(cetylpyridinium), CH - 클로르헥시딘 디글루코레이트(chlorhexidine diglucorate)이다. 마지막 2개의 플롯은 핵산 방출을 제어하는 방법이다: 95C - 10분 동안 95℃로 가열하고, TDI50 - 바이러스 사멸의 전유(proprietary) 방법.
용해제의 테스트
본 발명자들은 무독성이고 샘플에서 핵산을 방출하는 데 효과적이며 증폭을 방해하지 않는 작용제(agent)를 확인하기 위한 목적으로, 검출용 핵산의 방출에서 다양한 활성제의 사용을 추가로 연구하기로 결정했다. 초기 테스트는 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC), 포비돈(PVP), 시트랄, 포비돈 요오드 및 클로르헥시딘을 사용하여 수행하였다. 각 작용제는 2%, 0.6%, 0.2%, 및 0.02% 농도에서 테스트되었고, 용리 완충액 대조군(Tris-HCl, 활성제 불포함)도 테스트되었다.
SARS-CoV-2를 검출하도록 설계된 YouSeq의 E-RdRP 키트를 사용했고, SARS-CoV-2 표적 유전자인 E 유전자, RdRP 유전자 및 인간 RP(내부 대조군)를 포함하는 양성 대조군을 포함한다. 각 반응은 하기를 포함했다:
10 ㎕ 마스터믹스 (MasterMix)
1 ㎕ 프라이머/프로브
3 ㎕ 물
1 ㎕ 주형 또는 물
5 ㎕ 완충액
PCR은 하기 조건에서 수행했다:
55C 10분 RT 단계
95C 3분 변성
x 45 사이클
95C 15초
60C 60초
Quantstudio Q5를 사용하여 증폭을 모니터링했다.
결과가 도 4 및 5에서 그래프로 도시된다. CPC 및 포비돈 요오드는 증폭을 강력하게 억제하고; 시트랄 및 클로르헥시딘은 더 높은 농도에서 억제하며; 포비돈은 증폭을 억제하지 않는다는 것을 알 수 있다. 보다 상세하게, 그래프는 하기를 보여준다:
도 4a. 용리 완충액 대조군. 모두 증폭을 보여준다. 이는 모든 대조군이 통과되었고, 따라서, 데이터가 유효하다는 것을 의미한다. 도 4b. 세틸 클로라이드. 모두 평평한 선, 명확한 PCR 억제. 도 4c. 포비돈. 모든 웰은 증폭을 보이고, 이는 유의한 억제가 없다는 것을 의미한다. 2% 내지 0.2%에 패턴은 없다. 도 4d. 시트랄. 모두 증폭을 보여준다. 그러나, 2% 내지 0.2%에서 명확한 억제 효과가 있다. 도 4e. 포비돈 요오드. 모두 평평한 선(하나의 약한 rep 제외), 명확한 PCR 억제. 도 4f. 클로르헥시딘. 0.2% 웰만 증폭되었다. 더 낮은 Ct 값. 명확한 PCR 억제.
도 5a. 용리 완충액 대조군. 모두 증폭을 보여준다. 이는 모든 대조군이 통과되었고, 따라서, 데이터가 유효하다는 것을 의미한다. 도 5b. 세틸 클로라이드. 모두 평평한 선, 명확한 PCR 억제. 도 5c. 포비돈. 모든 웰은 증폭을 보이고, 이는 유의한 억제가 없다는 것을 의미한다. 0.06%는 0.2% 대비 개선된 Ct 값을 갖는다. 도 5d. 시트랄. 모든 웰은 증폭을 보이고, 이는 유의한 억제가 없다는 것을 의미한다. 0.06%는 0.2% 대비 개선된 Ct 값을 갖는다. 도 5e. 포비돈 요오드. 모두 평평한 선(2개의 약한 rep 제외), 명확한 PCR 억제. 도 5f. 클로르헥시딘. 모든 웰은 증폭을 보이고, 이는 유의한 억제가 없다는 것을 의미한다. 0.06%는 0.2% 대비 개선된 Ct 값을 갖는다.
그 후, 후자의 3개의 작용제를 조사된(irradiated) 전체 SARS-CoV-2 입자에서 핵산을 방출하고, 억제 없이 증폭을 수행하는 능력에 대해 테스트했다. 대조군은 이 목적에 적합한 것으로 알려진 완충액인 Mswab 완충액을 사용했다. 상이한 작용제의 조합을 테스트했다:
A = 1% 폴리비닐피롤리돈(10,000)
B = 0.9% 폴리비닐피롤리돈 + 0.1% 클로르헥시딘
C = 0.9% 폴리비닐피롤리돈 + 0.1% 시트랄
D = 1% 클로르헥시딘
E = 시트랄 1%
결과가 도 6에 도시된다. 모두 효과적이라는 것을 알 수 있다; 그러나, 완충액 B 및 C가 선호된다. 혈장 단백질과 근접한 물리적 유사성(physical resemblance)을 갖는 포비돈(폴리비닐피롤리돈, PVP)은 제약 산업에서 약물을 분산 및 현탁시키기 위한 합성 폴리머 비히클로 사용된다. 또한 붕해제 및 정제 결합제(tablet binder)로도 작용한다. 순수한 형태의 백색 내지 회백색 흡습성 분말로 나타나며 물에 쉽게 용해된다. 포비돈-요오드는 빠르고 강력하며 광범위한 항미생물 특성을 보이나, 포비돈 자체는 살미생물(microbicidal) 활성이 보고된 바 없다. 포비돈은 동물에게 심각한 독성을 나타내지 않으면서 바이러스에 대해 강력한 억제 작용을 갖는 것으로 밝혀졌다. 항미생물 활성이 없는 PVP와 항미생물 활성을 갖는 클로르헥시딘 및 시트랄의 조합은 qPCR용 핵산을 방출하는 광범위한 교란물질(broad spectrum disuptor)이 된다. 이는 이전에 수행된 적이 없으며 실제로 클로르헥시딘과 같은 화합물은 일반적으로 PCR 억제제로 간주된다. 본 발명자들은 조합이 qPCR에 대한 영향을 감소시키고, 교란물질로서 효과를 유지하기 위해 사용될 수 있다는 것을 확인했다.
그룹 | 활성 성분 | 활성 성분 농도 | 참조문헌 |
에센셜 오일에서 유래된 모노테르펜
|
시트랄 | 25 ㎍/ml | Astani et al, Comparative study on the antiviral activity of selected monoterpenes derived from essential oils. Phytother Res. 2010;24(5):673-679. Nazzaro et al, Effect of essential oils on pathogenic bacteria. Pharmaceuticals (Basel). 2013;6(12):1451-1474. |
유칼립투스 오일 | 100 ㎍/ml | ||
차 나무 오일 | 7.5 ㎍/ml | ||
클로르헥시딘 | 클로르헥시딘 | 0.12% | |
사포닌 | 트리테르페노이드 사포닌 | Simoes et al, Mechanism of antiviral activity of triterpenoid saponins. Phytother Res. 1999 Jun;13(4):323-8 | |
폴리필라 사포닌Ⅰ | 6.25-50 ㎍/mL | Pu et al, Polyphylla saponin I has antiviral activity against influenza A virus. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(10):18963-18971. | |
포비돈 요오드 | 포비돈 요오드 | 0.23%; (PVP-I: 0.47 및 0.23% w/v) | Kariwa et al, Inactivation of SARS coronavirus by means of povidone-iodine, physical conditions and chemical reagents. Dermatology. 2006;212 Suppl 1:119-23 Meister et al, Virucidal Efficacy of Different Oral Rinses Against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. J Infect Dis. 2020;222(8):1289-1292 Capriotti et al, A Novel Topical 2% Povidone-Iodine Solution for the Treatment of Common Warts: A Randomized, Double-Blind, Vehicle-Controlled Trial. Dermatol Ther (Heidelb). 2015;5(4):247-252. Nakagawa et al, The efficacy of povidone-iodine products against periodontopathic bacteria. Dermatology. 2006;212 Suppl 1:109-11 |
4차 암모늄
화합물 |
세틸피리디늄 클로라이드(CPC) | CPC는 영국에서 0.025-0.075% w/v(250-750 ㎍/ml) 농도로 약용 구강 세정제에 사용되는 반면, 일부 국가에서 판매되는 로젠지에는 1.4-3.0mg의 CPC가 포함되어 있다. > 10 ㎍/ml가 효과적인 것으로 나타났다. | Popkin et al, Cetylpyridinium Chloride (CPC) Exhibits Potent, Rapid Activity Against Influenza Viruses in vitro and in vivo. Pathog Immun. 2017;2(2):252-69 Baker et al, Repurposing Quaternary Ammonium Compounds as Potential Treatments for COVID-19, Pharm Res (2020) 37:104 Schrank et al, Disinfectants, Effective against Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2? ACS Infect. Dis. 2020, 6, 1553-1557 Kersting et al, Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens, Microchim Acta (2014) 181:1715-1723 O'Donnell et al, Potential role of oral rinses targeting the viral lipid envelope in SARS-CoV-2 infection, Function, Volume 1, Issue 1, 2020 WO 2005/046738 A2, Virucidal Activities of Cetylpyridinium Chloride |
4차 암모늄 화합물 (계속) |
염화벤잘코늄(BAC) | Rabenau et al, Efficacy of various disinfectants against SARS coronavirus. J Hosp Infect. 2005;61(2):107-111 Ansaldi et al, (2004). SARS-CoV, influenza A and syncitial respiratory virus resistance against common disinfectants and ultraviolet irradiation. Journal of Preventive Medicine and Hygiene. 45 |
|
구강 세척제 제제 | 리스테린 쿨민트 - 에탄올, 에센셜 오일 |
Meister et al, Virucidal Efficacy of Different Oral Rinses Against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. J Infect Dis. 2020;222(8):1289-1292 | |
데쿠날 - 염화데쿠알리늄(DAC), 염화벤잘코늄(BAC) | |||
오랄 비 프로 - 염화세틸피리디늄(CPC) |
|||
Crest Pro-Health Multi-Protection (C21H38ClN) 구강세척제 - 염화세틸피리디늄(C21H38ClN) |
|||
BETADINE 가글 및 구강 세척제 포비돈-요오드 I(PVP-I) |
Martinez Lamas et al, (2020), Is povidone-iodine mouthwash effective against SARS-CoV-2? First in vivo tests. Oral Disease Cimolai, N. (2020). Efficacy of povidone-iodine to reduce viral load. Oral Diseases, https://doi.org/10.1111/odi.13557. | ||
Nakagawa et al, The efficacy of povidone-iodine products against periodontopathic bacteria. Dermatology. 2006;212 Suppl 1:109-11 |
Claims (27)
- 분석을 위한 생물학적 시료를 수득하고, 선택적으로 가공하는 기구로서,
(a) 제1 및 제2 전반적 원통형(generally cylindrical) 섹션을 포함하고, 팁의 제1 및 제2 단부에 제1 및 제2 개구부를 갖는 중공 팁으로서, 상기 제2 섹션 및 제2 개구부는 상기 제1 섹션 및 제1 개구부보다 직경이 더 작고, 상기 제1 섹션 및 제1 개구부는 샘플링 도구에 제거 가능하게 부착되도록 구성되는 것인 중공 팁; 및
(b) 제1 단부에 생물학적 샘플을 획득하기 위해 노출되거나 노출 가능한 작동 표면(working surface), 획득된 생물학적 샘플 물질의 흡수 및 닙(nib)을 통한 액체의 통과에 적합한 다공성 구조, 및 제2 단부에 상기 닙에 세척 유체를 적용하기 위한 세척 표면을 갖는 다공성 닙;을 포함하고,
상기 제2 섹션 및 제2 개구부는 상기 닙을 제거 가능하게 수용하도록 구성되고, 상기 다공성 닙은 폭보다 긴 길이를 갖는 것인 기구. - 청구항 1에 있어서, 상기 팁의 제1 섹션의 길이는 동일한 섹션의 폭보다 크고; 바람직하게는 또한 상기 닙의 길이보다 긴 것인 기구.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 닙은 억지 끼워맞춤(interference fit)에 의해 상기 팁 내에 고정되는 것인 기구.
- 선행하는 항에 있어서, 상기 닙은 소결된 다공성 닙인 것인 기구.
- 선행하는 항에 있어서, 상기 닙은 상기 닙 상에 수득된 샘플의 처리를 위한 하나 이상의 활성제를 포함하는 것인 기구.
- 청구항 5에 있어서, 상기 하나 이상의 활성제는 동결건조된 형태 또는 건조된(dried-down) 형태인 것인 기구.
- 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 하나 이상의 활성제는 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 것인 기구.
- 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 활성제는 클로르헥시딘 및/또는 시트랄을 포함하는 것인 기구.
- 청구항 5 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 활성제는 핵산을 분해로부터 보호하는 작용제; 바람직하게는 알킬 폴리글루코시드를 포함하는 것인 기구.
- 청구항 5 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충액이 상기 닙의 세척 표면에 적용될 때, 중력이 상기 세척 완충액을 상기 닙을 통해 뽑아내고, 가공된 생물학적 샘플을 상기 닙으로부터 축출시키는 것인 기구.
- 청구항 10에 있어서, 상기 가공된 생물학적 샘플은 핵산을 포함하고, 방출되고 축출된 핵산은 농축 또는 정제 없이 분자 진단 테스트에 직접적으로 적용될 수 있는 것인 기구.
- 청구항 10에 있어서, 상기 가공된 생물학적 샘플은 단백질을 포함하고, 방출되고 축출된 단백질은 면역진단 테스트에 직접적으로 적용될 수 있는 것인 기구.
- 청구항 10, 11, 또는 12에 있어서, 상기 세척 완충액의 적용 및 생물학적 샘플의 축출(displacement)은 에어로졸을 생성할 위험이 낮은 것인 기구.
- 선행하는 항에 있어서, 상기 닙은 작동 표면 및 세척 표면 중 어느 하나 또는 둘 다에 곡면(curved face) 또는 둥근 면(rounded face)을 포함하는 것인 기구.
- 증폭용 핵산의 제조에서 폴리비닐피롤리돈의 용도.
- 청구항 15에 있어서, 증폭용 핵산의 제조에서 클로르헥시딘 및/또는 시트랄의 사용을 더 포함하는 것인 용도.
- 핵산을 제조하고 증폭하는 방법으로서, 상기 방법은
샘플을 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 용해 완충액과 조합하여, 상기 샘플 중 물질로부터 핵산을 방출시키는 단계;
상기 샘플을 핵산 증폭 과정에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 핵산 증폭 과정은 PCR인 것인 방법.
- 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 샘플은 폴리비닐피롤리돈의 존재 하에 핵산 증폭 과정에 적용되는 것인 방법.
- 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해 완충액은 핵산 증폭 믹스로 사용하기 위한 적절한 시약을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해 완충액은 클로르헥시딘 및/또는 시트랄을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 폴리비닐피롤리돈은 상기 용해 완충액에 5%, 4%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 또는 1% 이하로 존재하는 것인 방법.
- 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해 완충액은 0.9% PVP 및 0.1% 클로르헥시딘 또는 시트랄을 포함하는 것인 방법.
- 폴리비닐피롤리돈, 및 핵산 증폭 과정을 수행하기 위한 하나 이상의 추가 시약을 포함하는, 핵산 증폭 믹스.
- 청구항 24에 있어서, 클로르헥시딘 또는 시트랄을 추가로 포함하고; 더욱 바람직하게는 0.9% 폴리비닐피롤리돈 및 0.1% 클로르헥시딘 또는 시트랄을 추가로 포함하는 것인 믹스.
- 생물학적 샘플의 수집을 위한 다공성 닙으로서, 상기 다공성 닙은 그 내부에 건조된 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 것인 다공성 닙.
- 청구항 26에 있어서, 그 내부에 건조된 클로르헥시딘 또는 시트랄을 추가로 포함하는 것인 닙.
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